Toxoplasma gondii är en encellig parasit som kan skapa svåra skador hos immunsupprimerade individer samt hos foster då mamman infekteras under graviditet. Genom framtagande av en realtids-PCR-metod för detektion av T. gondii ska denna diagnostik flyttas från Klinisk Patologi (KP) samt Karolinska Universitetslaboratoriet till Klinisk Mikrobiologi i Lund. Två regioner: REP-529 samt genen B1, som båda förekommer i ett flertal kopior i T. gondii-genomet, utgjorde mål för primerutprovning. Analyser utfördes både med realtids-PCR och konventionell PCR. De primerpar som gav lägst Ct-värde samt högst amplitud valdes ut för REP-529 respektive B1 för vidare analyser. Hybridiseringsprober användes för att öka specificiteten och metoden utvärderades på upprenat T. gondii DNA från olika stammar samt Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) -prover erhållna från KP. I alla provmaterial amplifierades REP-529 mer effektivt (lägre Ct-värde) än B1 vilket var förväntat då fler kopior finns av REP-529 än av B1. Nedre kvantifikationsgränsen för REP-529 och B1 visade sig dock vara samma på ca 1,8 genomkopior/µl. / Toxoplasma gondii is a unicellular organism that can cause severe damage in immunocompromised patients or in fetuses when the mother is infected during pregnancy. Through development of a real time-PCR based method for detection of T. gondii-DNA, the diagnostics is planned to be relocated from the department of Clinical Pathology in Lund and the Karolinska University Laboratory in Huddinge to the department of Clinical Microbiology in Lund. The method was built on amplification of REP-529 and the B1-gene of the T. gondii genome, both present in multiple copies. Primers were tested on purified T. gondii DNA with conventional PCR as well as real time PCR with EvaGreen dye. Primers with high amplitude and low Ct-value were selected for both REP-529 and B1. Hybridizing probes were applied to increase specificity and the method was evaluated on T. gondii-DNA extracted from Formalin-Fixed, Paraffine-Embedded (FFPE) tissue as well as purified DNA from ten different strains of T. gondii. The amplification of REP-529 yielded a higher amplitude and lower Ct-value compared to that of B1 but the lower limit of quantification seemed to correlate between the two, with 1,8 genome-copies/µl.

Hansson, L. Detektion av makrolidresistens hos Mycoplasma genitalium med Panther Fusion. Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskal 15 högskolepoäng. Malmö universitet: Fakulteten för hälsa och samhälle, institutionen för Biomedicinsk Vetenskap, 2023.   Mycoplasma genitalium är en sexuellt överförbar mikroorganism som infekterar både män och kvinnor, som behandlas oftast med azitromycin med ett ökande problem av antibiotikaresistens. För M. genitalium är makrolidresistens det främsta hotet mot behandling, och har kopplats till fyra punktmutationer i region V i 23S rRNA-genen: A2071G, A2072G, A2072C samt A2071T (M. genitalium G-37, GenBank NR_077054.1). Projektet har undersökt möjligheten att ersätta nuvarande in house realtids-PCR metod för makrolidresistensbestämning med ett integrerat nukleinsyra-reningssteg och realtids-PCR med Panther Fusion (Hologic) hos Klinisk mikrobiologi i Lund. Under projektet analyserades 55 patientprover som samlades under perioden januari-februari 2023 i Region Skåne, som blivit positiva vid M. genitalium testning. Dessa prover har därefter analyserats av personal med nuvarande ABI-metod för resistensbestämning och sedan analyserats på Panther Fusion. Nuvarande ABI-metod resulterade i positiv signal för 91% (50/55) av patientprover positiva vid M. genitalium analys och makrolidresistensmutation hos 25 % (14/55), medan Panther Fusion metoden resulterade i positiv signal för 81 % (45/55) av positiva M. genitalium prover och påvisade resistensmutation hos 20 % (11/55) av proverna.

Underdiagnosis of intestinal parasites in patients with diarrhea A compilation from the Swedish public health authority indicates that infections caused by Cryptosporidium spp. increased in Sweden from 47 cases in 2004 to 594 cases in 2016 and Giardia intestinalis causes around 1300 infections per year. The primary aim of this study was to investigate the prevalence of parasites in patients with diarrhea. Furthermore, the study investigated whether samples taken with E-swab could be analyzed with real-time polymerase chain reaction (PCR) for detection of Cryptosporidium spp., Dientamoeba fragilis, Entamoeba histolytica/dispar and G. intestinalis rather than Sodium acetate-acetic acid-formaline fixative (SAF-fixative). Prevalence of parasites in fecal samples was collected from 200 samples from patients with bacterial issue ordered. For evaluation of E-swab, 22 frozen, unfixed samples that were positive for intestinal parasites was used. Twelve positive E-swab samples was used as comparative positive controls. This was analyzed using real-time PCR. Bacteria was counted for 9.5% of the infections whilst parasites counted for 14% of the infections. The conclusion was that E-swab could replace SAF-fixative in the diagnosis of intestinal parasites and that there is that an underdiagnosis of intestinal parasites. Keywords: Cryptosporidium spp, Dientamoeba fragilis, Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, Giardia intestinalis, real-time PCR, E-swab, prevalence.

Typning av hla-b*27:En jämförelsestudie mellan två analysmetoder för att påvisa HLA-B*27 molekylen i ankyloserande spondylitCarolina BermudezBermudez, C. Typning av HLA-B*27. En jämförelsestudie mellan två analysmetoder för att påvisa HLA-B*27 molekylen i Ankyloserande spondylit. Examensarbete i Biomedicinsk vetenskap, 15 högskolepoäng. Malmö universitet: Fakulteten för hälsa och samhälle, institutionen för Biomedicinsk vetenskap, 2018.Human leukocyt antigen (HLA) är vävnadsantigener, belägna på våra vita blodkroppar. HLA-B*27 allelen är starkt kopplat till Ankyloserande spondylit (AS). Det är en kronisk inflammatorisk ledsjukdom, som främst attackerar ryggraden, bäckenet och bröstkorgen. Det finns idag ingen enskild laborativ metod som med full säkerhet kan fastställa diagnos av denna sjukdom, innan de kliniska symtomen uppträder. Typning av HLA-B*27 ger endast information om närvaro eller frånvaro av antigenet, vid utredning av AS. Vidare är HLA-B*27 en polymorf och de olika alleltyperna varierar kraftigt, bland skilda etniska grupper samt mellan geografiska områden. Genetiska- och miljöfaktorer påverkar också. Sjukdomsutveckling i samband med närvaro av HLA-B*27 allelen, varierar därför från individ till individ. Därmed fungerar metoden endast som ett komplement-verktyg, för att ytterligare bekräfta diagnos. Syftet med denna studie var att med realtids-polymerase chain reaction (PCR), utföra typning av HLA-B*27 med Linkseq kit samt jämföra analysresultaten med uthämtade resultat från intern sjukhusdatabas, där typning av HLA-B*27 hade utförts med PCR-SSP (sekvens-specifika primers). Samtliga resultat stämde överens till 100%, vilket indikerar att metoden fungerar bra. Det finns studier som visat att HLA-B*27 molekylens fria tunga kedjor (HLA-B*272) har en starkare benägenhet än andra HLA-molekyler att binda in till killer immunoglobine-like receptorer (KIRs). Inbindning till KIRs med efterföljande ökad stimulering av interleukiner (IL) främst IL-17 och IL-23 bidrar till sjukdomsutvecklingen av AS. Dock finns ingen HLA-B*272 specifik antikropp som kan bevisa detta och det behövs därför ytterligare undersökning för att hitta en sådan. Därefter skulle en ny laborativ metod kunna utvecklas för att fastställa diagnos av AS i ett tidigt skede, innan de kliniska symtomen uppvisas. Nyckelord: Allelvarianter, Ankyloserande spondylit, HLA-B*27, KIR, PCR-SSP, Realtids-PCR. / typing of hla-b*27:a comparison study between two analysing methods for the detection of the HLA-B*27 molecule in ankylosing spondylitisCarolina BermudezBermudez, C. Typing of HLA-B*27. A comparison study between two analysing methods for the detection of the HLA-B*27 molecule in Ankylosing spondylitis. Degree project in Biomedical Laboratory Science, 15 credit points. Malmö University: Faculty of Health and Society, Department of Biomedical science, 2018.Human leukocyte antigen (HLA) are tissue antigens located on our white blood cells. The HLA-B*27 allele is strongly related to Ankylosing spondylitis (AS). It is a chronical inflammatory rheumatic disease that primarily affects the spine, the pelvis and the chest. At present, there is no single laboratory method that with all certainty may determine diagnosis of this disease, before the clinical symptoms appear. Typing of HLA-B*27 only gives information about the presence or absence of the antigen, upon the investigation of AS. Furthermore, HLA-B*27 is a polymorph and the different types of alleles, strongly vary among different ethnic groups and also between geographic regions. Genetic- and environmental factors also affect. Development of disease in conjunction with the presence of the HLA-B*27 allele, therefore varies from one individual to another. So, the method only functions as a complementary tool, to further confirm diagnosis. The aim of this study was to perform HLA-B*27 typing with realtime-polymerase chain reaction (PCR) using Linkseq kit and compare the analysed results with those results that were retrieved from the internal database of the hospital, where typing of HLA-B*27 had been performed with PCR-SSP (sequence specific primers). All results agreed with 100%, which indicates that the method functions well. There are studies that show that the heavy chains (HLA-B*272) of the HLA-B*27 molecule have a stronger affinity than other HLA-molecules of binding in to killer immunoglobulin-like receptors (KIRs). Increased stimulation of interleukins (IL) primarily IL17 and IL23, following binding to KIRs, contributes to the pathogenesis of ankylosing spondylitis. However, there is no HLA-B*272 specific antibody that may prove this and therefore more investigation is needed, in order to find one. A new laboratory method could then be developed to determine diagnosis of AS at an early stage, before the clinical symptoms emerge. Keyword: Allelvariants, Ankylosing spondylitis, HLA-B*27, KIR, PCR-SSP, Realtime-PCR.

Autoimmunitet är ett tillstånd där kroppens immunsystem felaktigt attackerar och skadar sina egna vävnader och celler. HLA-B27 är en genvariation som kan kopplas till autoimmun sjukdom som ankyloserande spondylit med en prevalens på 2-4% i världens befolkning. Denna studie syftade till att utvärdera och jämföra två kit för HLA-B27 alleler mot den nuvarande metoden på Länssjukhuset Ryhov i Region Jönköpings län. De metodprinciper som användes var realtids-PCR samt LAMP.  Totalt analyserades 37 avidentifierade blodprover med vardera av kiten samt med nuvarande metod. Resultatet visade en överensstämmelse med avseende på förväntade positiva och negativa resultat för HLA-B27 för de två kiten jämfört med nuvarande metoden. De tre metoderna/kiten detekterar de vanligaste HLA-B27 allelerna. Utifrån studiens resultat visade sig båda kiten vara effektiva, lättanvända samt ha stabila reagenser. Dessutom uppnådde båda kiten de IVD-krav som ställs inom EU. / Autoimmunity is a condition where the body's immune system mistakenly attacks and damages its own tissues and cells. HLA-B27 is a genetic variation that can be linked to autoimmune diseases such as ankylosing spondylitis, with a prevalence of 2-4% in the world’s population. This study aimed to evaluate and compare two kits for HLA-B27 alleles against the current method at Ryhov County Hospital in Region Jönköping County. The methodological principles used were real-time PCR and LAMP. A total of 37 anonymized blood samples were analyzed using each of the kits and the routine method. The results showed concordance with the expected positive and negative results for HLA-B27 between the two kits compared to the current method. The three methods/kits detect the most common HLA-B27 alleles.  Based on the study’s results, both kits proved to be effective, user friendly, and have stable reagents. Additionally, both kits met the IVD requirements set within the EU.