Fusobacterium necrophorum är en gramnegativ anaerob bakterie som grupperas i ss. necrophorum och ss. funduliforme. Fusobacterium necrophorum ss. funduliforme har på senare tid misstänkts kunna spela en roll vid vanligare svalginfektioner såsom halsfluss. Syftet med detta arbete var att sätta upp och bepröva en metod för realtids-PCR (Polymerase Chain Reaction) enligt Taqman för att detektera ss funduliforme. Vi undersökte även hur förvaringstiden i transportmedium (Amies kol, Copan) och odlingsmedium (Fastidious Agar Broth) påverkar överlevnaden för F. necrophorum ss. funduliforme och resultatet från realtids-PCR. Bakteriesuspension av varierande koncentration applicerades på provtagningspinnar som direkt inkuberades i medium, varefter en pinne av vardera koncentration utodlades och DNA extraherades för varje dag försöket pågick. En serie 10-spädningar av extraherat DNA från ss funduliforme ,med en lägsta koncentration av 10 DNA-molekyler per µL, användes som standard och positiv kontroll för PCR. Fusobacterium necrophorum ss funduliforme kunde detekteras med realtids-PCR från alla prov under alla dagar försöket pågick, medan odlingarna visade bäst resultat om provet såddes ut inom ett dygn från provtagningen. Realtids-PCR kan därför detektera förekomsten av ss funduliforme efter längre förvaring och bör användas för exempelvis transporterade prover, medan traditionell utodling med fördel kan användas för diagnostering av ss fundulforme då PCR inte ger information om antibiotikaresistens hos isolatet. / Fusobacterium necrophorum are Gram-stain negative, anaerobic, bacteria that are grouped into subspecies necrophorum and funduliforme. Fusobacterium necrophorum ss. funduliforme has recently been suspected to play a role in common throat infections such as tonsillitis. The purpose of this work was to set up and test a method for real-time PCR (Polymerase Chain Reaction) according to Taqman with the purpose of detecting ss. funduliforme. We also examined how the storage time within transport medium (Amies charcoal, Copan) and culture medium (FAB-broth) affects the survival of the bacterium and the sensitivity of the culture and PCR methods. Bacterial suspensions of different concentrations were applied to pharyngeal sampling swabs and then directly incubated in transport medium. For each day the experiment lasted, a set of swabs of each concentration were cultured, DNA extracted, and real-time PCR performed. DNA extracted from ss. funduliforme was used as standards for the real-time PCR, with a minimum concentration of 10 DNA molecules per μL. Subspecies funduliforme could be detected from all days with real-time PCR while the cultures showed the best results if the sample was cultured within one day of collection. Real-time PCR can detect the presence of ss. funduliforme after prolonged storage and can therefore show accurate results for transported samples. Traditional culturing on growth medium is still a valuable and reliable method, provided that the samples are cultured within 24 hours. Culture may also be needed i.e. since PCR gives no information of the antibiotic resistance of the isolate.

Human T-lymfotropt virus (HTLV) är ett C-typ onkovirus som tillhör familjen Retroviridae som huvudsakligen angriper T-lymfocyter och orsakar leukemi och andra autoimmuna sjukdomar. I den nuvarande kliniska diagnostiken används Enzyme-linked immunosorbent assay och ibland vid screeningsmetoden uppträder ospecifika reaktioner. På senare tid har flera metoder baserade på real-tids PCR utvecklats för att bestämma halten av virala genom i patienter. Syftet med denna studie var att sätta upp och optimera en realtids-PCR för detektion av humant T-lymfotropt virus typ-1 och 2. Inför optimering av realtids-PCR extraherades DNA från MT-4 och MO-T cellinjer.  Under optimering av realtids-PCR användes SYBR Green och smältpunktsanalys där flera komponenter bl.a. templat-, primer-, magnesium- koncentrationer samt annealing/elongeringstemperaturen modifierades. Efter avslutad optimering utfördes probetitrering för att specifikt skilja ut HTLV-1 och HTLV-2. Amplifieringsprodukten verifierades med Sangersekvensering. För att hitta den lämpligaste metoden för extrahering av DNA från helblod testades olika extraheringsmetoder för DNA-preparering. Efter färdig optimering såg PCR-programmet ut enligt följande: 95ºC i 3 min följt av 45 cykler med 95ºC i 3s och 60ºC i 10s. De optimala koncentrationerna av de olika reagenserna var 0,5µM HTV-F5, 0,7µM HTV-R4, 0,2µM HTLV-P1 och 0,1µM HTLV-P2.  Den optimala extraktionsmetoden från helblod visades vara med MagNA Pure Compact med 500µL helblod. Den färdig optimerade PCR-metoden är en semi-kvanitativ metod som fungerar väl för detektion av HTLV 1 och 2, men vidareutveckling av metoden krävs innan den kan tas i bruk för klinisk diagnostik.

No description available.

No description available.

No description available.

The antibiotic class β-lactams include drugs such as penicillins, cephalosporines, carbapenems and monobactams which mechanism of action is to inhibit cell-wall synthesis. Bacteria have developed several mechanisms to counter β-lactams. Bacteria can defend themselves from antibiotics by releasing enzymes that attack the antibiotic compound itself by hydrolysis, target alteration or redox reactions. Presence of antibiotics can also trigger a downregulation of genes coding for antibiotic binding proteins, as well as upregulation of proteins that serves as channel and pump proteins that ensure no accumulation of antibiotics occurs in the cytosol. The aim with the study was to investigate the presence of three plasmid-mediated genes (blaFOX, blaCIT(CMY-2) and blaMOX) coding for ampicillin resistance (pAmpC) in water isolates sampled from Helge River, Kristianstad. The detection of genes was done according to a previous optimized protocol for Real-Time PCR with SYBR™Green chemistry (duplex blaCIT(CMY-2)/blaMOX and singleplex blaFOX). The method proved not to be robust for multiplex PCR, only the singelplex for the gene blaFOX could produce valid results. 30 of 96 isolates were deemed as positive for the gene, whereas 27 of 79 were considered clinical relevant. Among the 27 isolates, 16 also harbored other genes for resistance (13 blaCTX-M, 2 blaOXA, 1 blaTEM and 1 blaSHV). One isolate carried on three resistancegenes (blaFOX, blaCTX-M och blaTEM). A majority of the positive isolates, 20 out of 27, were sampled near the pumpstation. The findings indicate that Helge river might be a reservoir for dissemination of antibiotic resistance genes.

Tuberkulos orsakad av Mycobacterium tuberculosis, är en av de ledande dödsorsakerna globalt sett enligt världshälsoorganisationen (WHO). M. tuberculosis ingår i Mycobacterium tuberculosis komplex (MTBC) där bland annat Mycobacterium bovis, M. bovis BCG (Bacillus Calmette-Guérin) och Mycobacterium africanum också ingår. Förutom MTBC ingår även icke-tuberkulösa mykobakterier (NTM) i genuset Mycobacterium. Fall av M. tuberculosis-infektioner rapporteras vanligtvis i utvecklingsländer medan NTM-infektioner är vanligare i västvärlden. Idag använder man sig av sputumprover för att diagnostisera vid misstanke om tuberkulos men bakterierna detekteras också från vätskor, sekret, exkret och vävnader. Odling är den vanligaste diagnostikmetoden men även mikroskopi används och molekylärbiologiska tekniker som realtids-PCR (polymerase chain reaction) vilken kan amplifiera och detektera M. tuberculosis för en snabb och säker analys. Syftet med denna studie var att utveckla en realtids-PCR-metod för att detektera NTM och särskilja dem från MTBC i formalin-fixerade paraffininbäddade vävnadsprover (FFPE). Fyra tidigare publicerade primerpar, senX3, MTC, IS6110 och IS1081, specifika för MTBC utvärderades med realtids-PCR parallellt med det kommersiella kittet AnyplexTM MTB/NTMe real-time detection med dual priming oligonukleotider (DPO). Resultaten visade att de fyra primerparen inte var specifika nog för att kunna särskilja MTBC- och NTM-stammar utan PCR-produkter av olika storlek erhölls även från NTM-stammar. Anyplex-kittet visade däremot hög specificitet och kunde gruppera samtliga testade stammar korrekt som MTBC eller NTM. Samma goda resultat erhölls vid analys av DNA-extrakt från 21 FFPE-prover. Sammanfattningsvis visar denna studie att AnyplexTM MTB/NTMe-kittet uppfyller kraven för att särskilja MTBC från NTM från FFPE-material vilket inte realtids-PCR med primers senX3, MTC, IS6110 och IS1081 gör. / Tuberculosis mainly caused by Mycobacterium tuberculosis, is one of the leading causes of death globally according to the World Health Organization (WHO). M. tuberculosis is included in the Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) which contains also Mycobacterium bovis, M. bovis BCG (Bacillus Calmette-Guérin) and Mycobacterium africanum. In addition to MTBC, non-tuberculous mycobacteria (NTM) are also included in the genus Mycobacterium. Cases of M. tuberculosis infections are usually reported in developing countries while NTM infections are more common in the western world. Today, sputum samples are used to diagnose tuberculosis but the bacteria can also be detected from analysis of fluids, secretions, excreta and tissues. Cultivation is a common diagnostic method but also use of microscopy and molecular biology techniques such as real-time PCR (polymerase chain reaction) which can amplify and detect M. tuberculosis for a rapid and specific analysis. The purpose of this study was to develop a real-time PCR method for detecting MTBC and distinguishing them from NTM in formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples (FFPE). AnyplexTM MTB/NTMe real-time detection kit was compared with previously published primers senX3, MTC, IS6110 and IS1081. 21 FFPE samples were processed by DNA extraction for further analysis with real-time PCR for amplification and detection and fragment analysis for size determination. The results show that the kit meets the requirements for distinguishing MTBC from NTM both with purified strains and samples from FFPE material while the different primer combinations senX3, MTC, IS6110 and IS1081 don't. To conclude, the AnyplexTM MTB/NTMe kit can be used for diagnostics of MTBC and NTM from FFPE samples.

Diatoms are photosynthetic protists that reside in aquatic environments. A unique feature of diatoms is their cell wall structure made of silica. Silicon is a limiting nutrient for diatoms. The bioavailable form of silicon in aquatic environments is silicic acid. Since the intracellular concentration of silicon is many times greater than the extracellular concentration in aquatic habitats, silicon transporters (SIT) are required that actively transports silicic acid into the cell. In the diatom Chaetoceros affinis two such transporters have been reported, SIT1 (CaSIT1) and SIT2 (CaSIT2). Gene expression of CaSIT1 is increased at low extracellular concentration of silicic acid (<30 µM), while at higher concentrations the transportation is dominated by diffusion. On the contrary, CaSIT2 does not seem to be affected by variations in environmental silicic acid concentrations, and its role in the transportation of silicic acid remains unclear. The aim of this study was to evaluate the relative gene expression of CaSIT1 and CaSIT2 in C. affinis, using realtime-PCR. The diatom was cultivated in two media: one with full nutrients (control) and one without added silicon (-Si). In addition, C. affinis was also cultivated with a second diatom, Cylindrotheca fusiformis, in respective media (mixed cultivation). Due to extensive primer-dimers, CaSIT2 was excluded from the proceeding analysis of the samples. Analysis showed that the relative gene expression of CaSIT1 was increased by silica limitation (ANOVA: p < 0,05), in accordance with previous studies. The effect of competition however resulted in a decrease of gene expression (ANOVA: p < 0,05). The combined effect, the interaction of competition and silica limitation, did not result in a significant change of the gene expression (ANOVA: p = 0,38). However, there was an increased variation among the mixed cultures, which could be a result of RNA degradation considering the poor RNA quality of the samples. The results from this study show that realtime-PCR is an effective method to measure gene expression of silica transporters, provided that the primers have been correctly evaluated. / Diatomer är vattenlevande, fotosyntetiska protister som kännetecknas av att dess cellväggsstruktur är uppbyggd av kiseldioxid. Kisel är ett begränsande näringsämne för diatomer. Den biotillgängliga formen av kisel i akvatisk miljö är kiselsyra. Eftersom den intracellulära koncentration av kisel är mångfaldigt högre än den extracellulära i de flesta akvatiska habitat, krävs kiseltransportörer (SIT) som aktivt pumpar in kiselsyran. Hos diatomen Chaetoceros affinis har två kiseltransportörer rapporterats, SIT1 (CaSIT1) och SIT2 (CaSIT2). Genuttrycket av CaSIT1 ökar vid låg koncentration av extracellulär kiselsyra (<30 µM), medan vid högre koncentrationer domineras transporten av diffusion. I motsats tycks CaSIT2 inte påverkas av variationer i tillgänglig kiselsyra, och dess roll vid transport av kiselsyra är oklar. Syftet med föreliggande arbete var att med realtids-PCR undersöka det relativa genuttrycket av CaSIT1 och CaSIT2 hos C. affinis. Diatomen odlades i två medium: en med komplett näringsinnehåll (kontroll) och en med samma näringsinnehåll förutom kisel (-Si). Därutöver odlades även C. affinis tillsammans med Cylindrotheca fusiformis, i respektive medium (mixad kultur). På grund av omfattande primer-dimers uteslöts CaSIT2 primers från analys av proverna. Det relativa genuttrycket av CaSIT1 ökade vid kiselbegränsning (ANOVA: p < 0,05), i enlighet med tidigare studier. Effekten av konkurrens resulterade däremot i en minskning av genuttryck (ANOVA: p < 0,05). Den kombinerade effekten (konkurrens och kiselbegränsning) resulterade inte i en signifikant förändring av genuttrycket (ANOVA: p = 0,38). Det var en ökad variation bland de mixade kulturerna, vilket eventuellt förklaras av degraderat RNA då RNA-kvalitén över lag var väldigt låg för de flesta prover. Resultaten i denna studie visar att realtids-PCR är en effektiv metod för att undersöka genuttryck av kiseltransportörgener, under förutsättning av primers utvärderats korrekt.

Methicillin-resistenta Staphylococcus aureus (MRSA) har blivit en allt vanligare patogen inom sjukvården och i samhället. MRSA orsakar infektioner som inte kan behandlas med β-laktamantibiotika. För att förhindra spridning genomgår patienter och sjukvårdspersonal screening-tester. I dessa screening-tester ingår PCR-analys av mecA, nuc och/eller Sa442. MecA är lokaliserad på Staphylococcal Cromosomal Cassette mec (SCCmec) och används som en markör för MRSA medan nuc och Sa442 anger S. aureus. PCR-positiva isolat odlas ut på agarplattor efter anrikning i en selektiv buljong. Kolonier av S. aureus resistensbestäms mot cefoxitin som MRSA är resistent mot. Idag används dock PCR-analys av mecA som en referensmetod för diagnostisering av MRSA. Under det senaste årtiondet har även rapporterats fynd av stammar som enligt resistensmönster är MRSA men som har utfallit negativt för mecA i PCR. Under 2011 rapporterades en ny variant av SCCmec och en ny variant av mecA, mecALGA251. I denna studie har en realtids-PCR tagits fram för att identifiera den nya varianten, mecALGA251. Denna PCR användes för att undersöka 43 kliniska isolat, fyra cefoxitin-känsliga S. aureus från rutinen och tre referensstammar. De kliniska isolaten hade samlats in under perioden 2004 – 2011 och hade uppvisat cefoxitin-resistens men gett negativt resultat i mecA-PCR. Totalt 40 av de 43 cefoxitin-resistenta kliniska isolaten visades bära mecALGA251. Resistensbestämningar med diskdiffusion och E-test mot cefoxitin, oxacillin, cefuroxim och cefotaxim visade att denna typ av MRSA inte kan skiljas från klassisk MRSA. Resultaten visar att cefoxitin-resistenta S. aureus isolat som bär mecALGA251 finns bland skånska patienter. De visar också att det finns cefoxitin-resistent S. aureus som saknar både klassiska mecA och mecALGA251. Dessa stammar har inte studerats vidare i denna studie. / Methicillin-resistant Staphylococcus aure s (MRSA) has become a more frequent pathogen within health care facilities and the community. MRSA causes infections that can’t be treated with β-lactamantibiotics. To prevent the spread of MRSA, patients and medical personnel undergo screening-tests. In the screening-tests PCR-analysis of mecA, nuc and/or Sa442 is included. MecA is located at Staphylococcal Chromosomal Cassette mec (SCCmec) and is a marker for MRSA, whereas nuc and Sa442 state regular S. Aureus infections. PCR-positive isolates are grown on agar plates after enrichment in selective broth. Colonies of S. aureus are tested for cefoxitin susceptibility to which MRSA is resistant. PCR-analysis of mecA is the reference method that is being used today when MRSA is being diagnosed. During the last decade cefoxitin-resistant strains that lack mecA in the PCR has been reported. In 2011 a new variant of SCCmec and a new variant of mecA, mecALGA251 was reported. In this study a new real-time-PCR has been developed in order to identify mecALGA251. The new PCR protocol was being used to examine 43 clinical isolates, four cefoxitin-susceptible S. aureus from the routine and three reference strains were examined. The clinical isolates had been collected during the period 2004-2011 and were cefoxitin-resistant but lacked mecA. In total of 40 of the 43 cefoxitin-resistant was PCR positive for mecALGA251. Susceptibility testing with disk diffusion and E-test for cefoxitin, oxacillin, cefuroxime and cefotaxime showed that this type of MRSA can’t be distinguished from regular MRSA. The results showed that cefoxitin-resistantS. aureus isolates carrying mecALGA251 exist among patients in Skåne County. One cefoxitin-resistant S. aureus isolate lacked both classic mecA and mecALGA251, which indicates that other mechanisms may exist, however these results has not been further analysed in this study.

No description available.