Den mest välkända arten i släktet Mycobacterium som kan orsaka sjukdom hos människan är Mycobacterium tuberculosis (MTB). Infektioner av andra mykobakterier ökar världen över. Dessa benämns icke-tuberkulösa mykobakterier (NTM) och orsakar ofta liknande symtom som de vid MTB-infektion. Vanligtvis krävs dock olika behandlingar beroende på om infektionen är orsakad av MTB eller av NTM. Nuvarande diagnostik bygger på odling och mikroskopi, men analyser som innefattar molekylärbiologiska metoder för undersökning av mykobakteriers DNA blir allt vanligare. I denna studie jämfördes olika PCR-metoder för identifiering av NTM, där metoderna baserades på två tidigare publicerade artiklar. Tester gjordes på DNA från sex NTM-stammar med MTB-DNA som referens. För påvisning av hela släktet Mycobacterium användes primers riktade mot hsp65 och 16S, och för att kunna urskilja MTB från NTM användes primers riktade mot IS6110, IS1081 och ITS-MTC. Undersökningarna visade lägre Ct-värden och högre PCR-effektivitet för hsp65 än för 16S men tester med avseende på MTB-specifika primers visade samtliga amplifiering även för NTM. / The most well-known species of the genus Mycobacterium that can cause human disease is Mycobacterium tuberculosis (MTB). Infections caused by other mycobacteria is an increasing problem worldwide. These mycobacteria are known as non-tuberculous mycobacteria (NTM) and they often cause similar symptoms as those in MTB-caused infections. Usually different treatments are required depending on if the infection is caused by NTM or MTB. Current diagnostic methods are based on culture and microscopy, though molecular methods are becoming more common. In this study different PCR-methods for identification of NTM’s were compared. The different methods were based on two earlier published articles. Experiments were made with DNA from six NTM-species and with DNA from MTB as reference. To detect all mycobacteria primers targeting hsp65 and 16S were used, and primers targeting IS6110, IS1081 and ITS-MTC were used to separate MTB from NTM. This study showed lower Ct-values and higher PCR-efficiency for hsp65 than for 16S, but comparative tests regarding MTB-specific primers showed, with all three primer pairs, amplification of NTM as well.

Tuberkulos orsakad av Mycobacterium tuberculosis, är en av de ledande dödsorsakerna globalt sett enligt världshälsoorganisationen (WHO). M. tuberculosis ingår i Mycobacterium tuberculosis komplex (MTBC) där bland annat Mycobacterium bovis, M. bovis BCG (Bacillus Calmette-Guérin) och Mycobacterium africanum också ingår. Förutom MTBC ingår även icke-tuberkulösa mykobakterier (NTM) i genuset Mycobacterium. Fall av M. tuberculosis-infektioner rapporteras vanligtvis i utvecklingsländer medan NTM-infektioner är vanligare i västvärlden. Idag använder man sig av sputumprover för att diagnostisera vid misstanke om tuberkulos men bakterierna detekteras också från vätskor, sekret, exkret och vävnader. Odling är den vanligaste diagnostikmetoden men även mikroskopi används och molekylärbiologiska tekniker som realtids-PCR (polymerase chain reaction) vilken kan amplifiera och detektera M. tuberculosis för en snabb och säker analys. Syftet med denna studie var att utveckla en realtids-PCR-metod för att detektera NTM och särskilja dem från MTBC i formalin-fixerade paraffininbäddade vävnadsprover (FFPE). Fyra tidigare publicerade primerpar, senX3, MTC, IS6110 och IS1081, specifika för MTBC utvärderades med realtids-PCR parallellt med det kommersiella kittet AnyplexTM MTB/NTMe real-time detection med dual priming oligonukleotider (DPO). Resultaten visade att de fyra primerparen inte var specifika nog för att kunna särskilja MTBC- och NTM-stammar utan PCR-produkter av olika storlek erhölls även från NTM-stammar. Anyplex-kittet visade däremot hög specificitet och kunde gruppera samtliga testade stammar korrekt som MTBC eller NTM. Samma goda resultat erhölls vid analys av DNA-extrakt från 21 FFPE-prover. Sammanfattningsvis visar denna studie att AnyplexTM MTB/NTMe-kittet uppfyller kraven för att särskilja MTBC från NTM från FFPE-material vilket inte realtids-PCR med primers senX3, MTC, IS6110 och IS1081 gör. / Tuberculosis mainly caused by Mycobacterium tuberculosis, is one of the leading causes of death globally according to the World Health Organization (WHO). M. tuberculosis is included in the Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) which contains also Mycobacterium bovis, M. bovis BCG (Bacillus Calmette-Guérin) and Mycobacterium africanum. In addition to MTBC, non-tuberculous mycobacteria (NTM) are also included in the genus Mycobacterium. Cases of M. tuberculosis infections are usually reported in developing countries while NTM infections are more common in the western world. Today, sputum samples are used to diagnose tuberculosis but the bacteria can also be detected from analysis of fluids, secretions, excreta and tissues. Cultivation is a common diagnostic method but also use of microscopy and molecular biology techniques such as real-time PCR (polymerase chain reaction) which can amplify and detect M. tuberculosis for a rapid and specific analysis. The purpose of this study was to develop a real-time PCR method for detecting MTBC and distinguishing them from NTM in formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples (FFPE). AnyplexTM MTB/NTMe real-time detection kit was compared with previously published primers senX3, MTC, IS6110 and IS1081. 21 FFPE samples were processed by DNA extraction for further analysis with real-time PCR for amplification and detection and fragment analysis for size determination. The results show that the kit meets the requirements for distinguishing MTBC from NTM both with purified strains and samples from FFPE material while the different primer combinations senX3, MTC, IS6110 and IS1081 don't. To conclude, the AnyplexTM MTB/NTMe kit can be used for diagnostics of MTBC and NTM from FFPE samples.