Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1651.pdf: 3101567 bytes, checksum: 399a65fa1b493a7477de38b37956b87e (MD5) Previous issue date: 2007-12-07 / Universidade Federal de Sao Carlos / Enzymatic hydrolyzed proteins present some advantages over the pool of amino acids obtained after a chemical hydrolysis: lower osmolality (easier absorption by the organism) and better sensorial characteristics. The removal of phenylalanine (Phe) from these hydrolysates allows their use in the diet of phenylktonuria (PKU) patients. This Thesis studies the sequential hydrolysis of cheese whey proteins. This process aims at producing a protein hydrolysate with low contents of Phe, after two reaction stages: in the first one, concentrated cheese whey proteins are hydrolyzed by the endoprotease chymotrypsin, immobilized on agarose gel. The substrate of the second stage is the product of the first one. This reaction is the central focus of this Thesis, and consists in a hydrolysis using the exoprotease carboxipeptidase A (CPA), immobilized on the same matrix. Since the scope of this work was a process for obtaining a protein hydrolysate with low contents of Phe for phenylketonurics, another stage had to be incorporated: ultrafiltration, to separate the amino acids released by the action of CPA, mainly Phe (and other amino acids that inhibit the reaction). With this purpose, an enzymatic membrane reactor (EMR) is proposed. It should be noticed that, to the best of our knowledge, the reactor design presented here has not been published yet. The EMR had spherical agarose particles within the reaction space, retained by a stainless steel mesh (400 Tyler). Hence, the ultrafiltration membrane was in charge only of the separation of the amino acids in the hydrolysate, which was continuously recycled to the flask containing the immobilized enzyme. Assays to characterize the membranes were performed. These membranes were then used in the integrated process (reaction with immobilized enzyme coupled to the ultrafiltration), for different experimental conditions. The substrates where Prato and Minas Frescal cheese whey. Two set-ups of the ultrafiltration unit were tested: flat plate and hollow fiber, both with 1 kDa cut-off. The reactor volume/membrane area ratios were 7.5×10-2 cm and 76.9×10-2 cm, respectively. Finally, the performance of three systems was compared: EMR with flat plane and hollow fiber and a batch reactor, followed by diafiltration. The hollow fiber EMR showed the best performance (85% conversion, productivity of 275.2×10-7 ghidrolisado/mgPhe/UH-PHE/h and only 1% retention of Phe in the membrane, after assays of 10 h). The resulting product was appropriate for phenylketonurics, with high protein contents (53.4 g/L), mainly constituted by small peptides (≤ 5.8 kDa) and with 19.9 mgPhe/gProteína, within the admissible range for PKU / Os hidrolisados protéicos via enzimática apresentam algumas vantagens, em relação à mistura de aminoácidos livres obtida pela hidrólise química: menor osmolalidade (e, portanto, maior facilidade de absorção pelo organismo) e características sensoriais mais agradáveis. Por sua vez, a remoção da fenilalanina (Phe) desses hidrolisados permite a utilização dos hidrolisados na dieta de fenilcetonúricos. Nesta Tese foi estudada a hidrólise enzimática seqüencial de proteínas de soro de queijo, processo proposto para obtenção de um hidrolisado protéico, com reduzido teor de Phe, e constituído de duas etapas reacionais: na primeira, as proteínas do soro de queijo concentrado são hidrolisadas pela endoprotease quimotripsina, imobilizada em gel de agarose. A segunda etapa, cujo substrato é o produto da primeira proteólise, é o foco central desta Tese, e consiste na hidrólise do substrato prehidrolisado utilizando-se a exoprotease carboxipeptidase A (CPA), imobilizada na mesma matriz. Como o escopo do trabalho era o processo para obtenção de um hidrolisado protéico com baixo teor de Phe para pacientes fenilcetonúricos foi necessário incorporar outra etapa: ultrafiltração, para separar os aminoácidos liberados por ação da CPA, principalmente Phe (além de outros aminoácidos inibidores da reação). Para isso, propõe-se trabalhar com reator enzimático de membrana (REM). Destaque-se que a concepção de reator aqui apresentada é, até onde vai nosso conhecimento, inédita. Estudou-se um reator de membrana com a enzima imobilizada em partículas esféricas de gel de agarose, retidas no volume reacional propriamente dito por meio de um filtro de aço (400 Tyler). Assim, a membrana de ultrafiltração ficou a cargo apenas da separação dos aminoácidos presentes no hidrolisado, que era reciclado continuamente para o frasco contendo a enzima imobilizada. Foram realizados ensaios para caracterização das membranas utilizadas, para posteriormente serem realizados ensaios em diferentes condições experimentais no processo integrado (reação com enzima imobilizada acoplada à ultrafiltração), utilizando como substratos soro de queijo tipo Prato e Minas Frescal. Foram testadas duas configurações de unidades de ultrafiltração: placa plana e fibra oca, ambas com corte de 1 kDa As razões volume de reator/área de membrana testadas foram de 7,5×10-2 e 76,9×10-2 cm, rescpectivamente. Foi desenvolvido um modelo matemático do REM, e suas predições foram comparados com dados experimentais de hidrólise com CPA para ambos os sistemas. Finalmente, foi comparado o desempenho de três sistemas: reator com membrana de placa plana, reator com membrana de fibra oca e reator em batelada, seguido por diafiltração com membrana de fibra oca. O REM tipo fibra oca apresentou o melhor desempenho (85% de conversão, uma produtividade de 275,2×10-7 ghidrolisado/mgPhe/UH-Phe/h e apenas 1% de retenção de Phe na membrana, em ensaios de 10 h. O produto resultante desse sistema apresentou características próprias para ser utilizado como complemento protéico para pacientes fenilcetonúricos, com um alto conteúdo protéico (53,4 g/L) constituído majoritariamente por pequenos peptídeos (≤ 5,8 kDa) e com 19,9 mgPhe/gProteína valor que se encontra dentro da faixa tolerada para pacientes de fenilcetonúria

Reatores enzimáticos com membrana (REM) combinam muitas das características desejáveis em um bioprocesso, tais como: reator de elevada produtividade, reprodutibilidade no tempo, fácil controle e automação, operação em regime contínuo, eficiente separação de biocatalisador, substratos e produtos, com a viabilidade do uso de enzimas sem necessidade de imobilização. Este estudo faz parte do desenvolvimento e otimização de um bioprocesso que utiliza um reator enzimático com membrana com a enzima invertase, que catalisa a hidrólise da sacarose produzindo uma mistura equimolar de glicose e frutose. Estudou-se a influência de algumas variáveis operacionais e de reação no comportamento do REM. Este reator consiste de um tanque agitado de 50 mL onde células de Saccharomyces cerevisiae, contendo a invertase, ficam retidas por meio de uma membrana (Øporo 0,45µm), disposta na parte inferior do sistema. A configuração deste é semelhante a um reator contínuo tipo tanque agitado (CSTR). Inicialmente, avaliou-se a influência das variáveis: concentração de sacarose e concentração de enzima, por meio de experimentos seriais, que possibilitaram fixar estas variáveis em níveis adequados, de 500 mM e 1 mg/mL, respectivamente, para a continuidade dos ensaios por meio de planejamentos experimentais fatoriais. Foi utilizado um planejamento experimental (23 + estrela) e a análise de superfície de resposta para avaliar a influência das variáveis: vazão de alimentação do substrato, temperatura e pH. Para a análise estatística dos resultados, utilizaram-se como respostas o grau de conversão da sacarose e a produtividade em frutose, determinadas em amostragens feitas durante o tempo de operação do reator, em média de 8 a 9 horas por condição avaliada. Dos resultados obtidos, mostraram-se significativos, com 95% de confiança, os efeitos lineares e quadráticos da vazão e temperatura. As condições ótimas encontradas foram: vazão de alimentação entre 0,4 e 1,0 mL/min e temperatura 51°C. O grau de conversão obtido foi de aproximadamente 95%, com as seguintes condições experimentais: concentração da suspensão de células de 1mg/mL, temperatura de 51°C, pH 5,5; concentrações de sacarose de 500 mM e vazão de alimentação de 1,0 mL/min. Para esta condição obteve-se uma produtividade da ordem de 0,6 mmol frutose/h.mg invertase. Os desvios entre os valores previstos pelo modelo estatístico e pelo modelo experimental foram da ordem de 3%. Em função dos resultados obtidos neste trabalho concluiu-se que esta concepção de reator é eficiente para a bioconversão da sacarose e, portanto, o processo contínuo com reator com membrana é promissor para o desenvolvimento de processos enzimáticos desta natureza. / Enzymatic membrane reactors combine several desirable characteristics in a bioprocess, such as high productivity, reproducibility, easy control and automation, continuous operation, efficient separation of biocatalyst, substrate and products, and the use of enzymes without immobilization. This work is part of the development and optimization of a bioprocess using an enzymatic reactor which utilizes a membrane reactor for the enzymatic hydrolysis of sucrose in a solution of fructose and glucose, containing the enzyme invertase. The influence of some operational and reaction variables on the performance of the membrane reactor was studied. The bioreactor consisted of a 50 mL-stirred tank where intact cells of Saccharomyces cerevisiae, containing invertase in the cell wall, are retained inside the reactor by a microfiltration membrane (Øpore 0.45µm). The flat sheet membrane is fixed at the bottom of the device. The reactor configuration is similar to a continuous stirred tank reactor (CSTR). Initially, the influence of sucrose and enzyme concentration was evaluated through a series of experiments in order to determine the suitable levels of these variables. Sucrose was set to 500 mM and enzyme set to 1 mg/mL. This allowed the work to continue by means of experimental factorial designs. It was utilized a 23 full experimental design followed by a 2nd order statistical design and, the surface response methodology in order to evaluate the influence of volume feeding rate of the substrate, temperature and pH on fructose productivity and sucrose conversion. The values were obtained during the reactor operation. The average operation time was trom 8 to 9 hours for all evaluated conditions. From the statistical analysis, it was concluded that the linear and quadratic effects of temperature and flow rate on the results were the most significant with 95% of confidence. The optimum conditions found for this bioprocess were volume feeding rate between 0.4 and 1.0 mL/min and temperature of 51°C. The degree of conversion of sucrose obtained experimentally was 95%, in the following experimental conditions: cell concentration of 1mg/mL, temperature of 51°C, pH 5.5; sucrose concentration of 500 mM and feeding rate of 1.0 mL/min. For this operational condition it was obtained a productivity of about 0.6 mmol fructose/h.mg invertase. The deviation between the predicted values by the statistical model and the experimental data was 3%. Based on the results obtained in this work, it can be concluded that this conception of bioreactor is efficient for the bioconversion of sucrose and, a continuous membrane reactor process is very promising for the development of this kind of enzymatic process.

Reatores enzimáticos com membrana (REM) combinam muitas das características desejáveis em um bioprocesso, tais como: reator de elevada produtividade, reprodutibilidade no tempo, fácil controle e automação, operação em regime contínuo, eficiente separação de biocatalisador, substratos e produtos, com a viabilidade do uso de enzimas sem necessidade de imobilização. Este estudo faz parte do desenvolvimento e otimização de um bioprocesso que utiliza um reator enzimático com membrana com a enzima invertase, que catalisa a hidrólise da sacarose produzindo uma mistura equimolar de glicose e frutose. Estudou-se a influência de algumas variáveis operacionais e de reação no comportamento do REM. Este reator consiste de um tanque agitado de 50 mL onde células de Saccharomyces cerevisiae, contendo a invertase, ficam retidas por meio de uma membrana (Øporo 0,45µm), disposta na parte inferior do sistema. A configuração deste é semelhante a um reator contínuo tipo tanque agitado (CSTR). Inicialmente, avaliou-se a influência das variáveis: concentração de sacarose e concentração de enzima, por meio de experimentos seriais, que possibilitaram fixar estas variáveis em níveis adequados, de 500 mM e 1 mg/mL, respectivamente, para a continuidade dos ensaios por meio de planejamentos experimentais fatoriais. Foi utilizado um planejamento experimental (23 + estrela) e a análise de superfície de resposta para avaliar a influência das variáveis: vazão de alimentação do substrato, temperatura e pH. Para a análise estatística dos resultados, utilizaram-se como respostas o grau de conversão da sacarose e a produtividade em frutose, determinadas em amostragens feitas durante o tempo de operação do reator, em média de 8 a 9 horas por condição avaliada. Dos resultados obtidos, mostraram-se significativos, com 95% de confiança, os efeitos lineares e quadráticos da vazão e temperatura. As condições ótimas encontradas foram: vazão de alimentação entre 0,4 e 1,0 mL/min e temperatura 51°C. O grau de conversão obtido foi de aproximadamente 95%, com as seguintes condições experimentais: concentração da suspensão de células de 1mg/mL, temperatura de 51°C, pH 5,5; concentrações de sacarose de 500 mM e vazão de alimentação de 1,0 mL/min. Para esta condição obteve-se uma produtividade da ordem de 0,6 mmol frutose/h.mg invertase. Os desvios entre os valores previstos pelo modelo estatístico e pelo modelo experimental foram da ordem de 3%. Em função dos resultados obtidos neste trabalho concluiu-se que esta concepção de reator é eficiente para a bioconversão da sacarose e, portanto, o processo contínuo com reator com membrana é promissor para o desenvolvimento de processos enzimáticos desta natureza. / Enzymatic membrane reactors combine several desirable characteristics in a bioprocess, such as high productivity, reproducibility, easy control and automation, continuous operation, efficient separation of biocatalyst, substrate and products, and the use of enzymes without immobilization. This work is part of the development and optimization of a bioprocess using an enzymatic reactor which utilizes a membrane reactor for the enzymatic hydrolysis of sucrose in a solution of fructose and glucose, containing the enzyme invertase. The influence of some operational and reaction variables on the performance of the membrane reactor was studied. The bioreactor consisted of a 50 mL-stirred tank where intact cells of Saccharomyces cerevisiae, containing invertase in the cell wall, are retained inside the reactor by a microfiltration membrane (Øpore 0.45µm). The flat sheet membrane is fixed at the bottom of the device. The reactor configuration is similar to a continuous stirred tank reactor (CSTR). Initially, the influence of sucrose and enzyme concentration was evaluated through a series of experiments in order to determine the suitable levels of these variables. Sucrose was set to 500 mM and enzyme set to 1 mg/mL. This allowed the work to continue by means of experimental factorial designs. It was utilized a 23 full experimental design followed by a 2nd order statistical design and, the surface response methodology in order to evaluate the influence of volume feeding rate of the substrate, temperature and pH on fructose productivity and sucrose conversion. The values were obtained during the reactor operation. The average operation time was trom 8 to 9 hours for all evaluated conditions. From the statistical analysis, it was concluded that the linear and quadratic effects of temperature and flow rate on the results were the most significant with 95% of confidence. The optimum conditions found for this bioprocess were volume feeding rate between 0.4 and 1.0 mL/min and temperature of 51°C. The degree of conversion of sucrose obtained experimentally was 95%, in the following experimental conditions: cell concentration of 1mg/mL, temperature of 51°C, pH 5.5; sucrose concentration of 500 mM and feeding rate of 1.0 mL/min. For this operational condition it was obtained a productivity of about 0.6 mmol fructose/h.mg invertase. The deviation between the predicted values by the statistical model and the experimental data was 3%. Based on the results obtained in this work, it can be concluded that this conception of bioreactor is efficient for the bioconversion of sucrose and, a continuous membrane reactor process is very promising for the development of this kind of enzymatic process.