O cão é a única espécie, além do homem, em que o câncer de próstata (CP), a neoplasia intraepitelial prostática (PIN) e a hiperplasia prostática benigna (HPB) ocorrem espontaneamente, permitindo dessa forma que se realize estudo comparativo de afecções benignas e malignas da próstata. Acredita-se que a existência de stem cells malignas, localizadas na camada de células basais da próstata, seja um dos fatores responsáveis pelo insucesso da terapia por ablação androgênica que ocorre na maioria dos carcinomas prostáticos avançados. O objetivo deste estudo foi caracterizar a próstata canina quanto a aspectos envolvidos na evolução para o carcinoma prostático, tentando identificar a origem celular e as alterações das lesões pré-neoplásicas. Foram obtidas 44 próstatas na necrópsia. Amostras prostáticas foram fixadas em metacarne, embebidas em parafina e seccionadas a 5µm para a coloração com hematoxilina eosina (HE) e avaliadas em relação à presença de hiperplasia, prostatite, PIN e neoplasia. Além disso, cortes corados em HE representando cada afecção foram utilizados na determinação da área nuclear média por morfometria computadorizada. Cortes histológicos obtidos em lâminas silanizadas foram utilizados na imunoistoquímica para células basais (p63 e 34E-12), conexinas 32 e 43, receptor de andrógeno (AR) e antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA). Amostras foram coletadas também em nitrogênio líquido e mantidas a 80o C para a realização do PCR quantitativo em tempo real, para a determinação da expressão do RNAm do AR, e para a realização do Western blot, para a determinação da expressão da conexina 43. As afecções mais freqüentes foram a prostatite e a hiperplasia prostática benigna. Foi observada uma maior porcentagem de células basais e um alto índice proliferativo, como demonstrado pela imunoistoquímica para o PCNA, na neoplasia intraepitelial prostática. Além disso, observou-se nessas lesões marcação nuclear heterogênea para o AR, menor em relação à dos ácinos benignos. Ao contrário do observado na próstata humana, não foi observada expressão das conexinas 32 e 43 na próstata canina (normal ou com PIN). A área nuclear média, obtida pela morfometria computadorizada, foi maior em células epiteliais de ácinos apresentando PIN e/ou neoplasia em relação à de células epiteliais de ácinos benignos. Observou-se expressão variável do RNAm para o AR nas PINs e neoplasias, utilizando-se o PCR em tempo real. Estes achados sugerem que células basais malignas desempenham papel na origem da neoplasia intraepitelial prostática e possuem capacidade de proliferar a despeito da expressão heterogênea do receptor de andrógeno. / Dogs are the only animal other than man to develop prostate cancer, prostatic intraepithelial neoplasia (PIN) and benign prostatic hyperplasia (HPB) spontaneously, allowing the comparison between benign and malignat affections of prostate. Malignant stem cells among the basal cell layer of the prostate are believed to play an important role in the failure of androgen-ablation therapy that occurs in most advanced prostate cancer. The goal of this study was to characterize the canine prostate in relation to evolution to prostatic carcinoma, trying to identify the cellular origin and the alterations of pre-neoplastic lesions. Forty-four canine prostates were obtained at necropsy. Prostatic samples were fixed in methacarn, embedded in paraffin wax and sectioned into 5µm-thick slices for hematoxylin eosin (HE) staining and evaluated for the presence of hyperplasia, prostatitis, PIN and neoplasia. Moreover, HE stained sections representing each affection were used to determine the mean nuclear area by computerized morphometry. Tissue sections obtained in silanized slides were used in immunohistochemical staining for basal cells (p63 and 34E-12), connexins 32 and 43, androgen receptor (AR) and proliferating-cell nuclear antigen (PCNA). Quantitative real-time PCR to determine the expression level of AR at the mRNA level and Western blot to protein levels of connexin 43 were examined in samples collected using liquid nitrogen and kept at 80o C. The most common lesions were prostatitis and benign prostatic hyperplasia. The prostatic intraepithelial neoplasia exhibited a higher percent of basal cells and was highly proliferative, as demonstrated by PCNA immunohistochemistry. Moreover, these lesions exhibited heterogeneous nuclear AR staining, lower in comparision with benign acini. In contrast to human prostate, the canine prostate (normal or harboring PIN) did not express the connexins 32 and 43. The mean nuclear area measured by computerized morphometry was greater in epithelial cells of PIN and neoplastic acini than that of benign acini. We found variable RNAm AR expression in prostatic intraepithelial neoplasia and neoplasia by real-time PCR. These findings suggest that malignant basal cells may play a role in the origin of PIN and can proliferate despite the heterogeneous AR expression.

O cão é a única espécie, além do homem, em que o câncer de próstata (CP), a neoplasia intraepitelial prostática (PIN) e a hiperplasia prostática benigna (HPB) ocorrem espontaneamente, permitindo dessa forma que se realize estudo comparativo de afecções benignas e malignas da próstata. Acredita-se que a existência de stem cells malignas, localizadas na camada de células basais da próstata, seja um dos fatores responsáveis pelo insucesso da terapia por ablação androgênica que ocorre na maioria dos carcinomas prostáticos avançados. O objetivo deste estudo foi caracterizar a próstata canina quanto a aspectos envolvidos na evolução para o carcinoma prostático, tentando identificar a origem celular e as alterações das lesões pré-neoplásicas. Foram obtidas 44 próstatas na necrópsia. Amostras prostáticas foram fixadas em metacarne, embebidas em parafina e seccionadas a 5µm para a coloração com hematoxilina eosina (HE) e avaliadas em relação à presença de hiperplasia, prostatite, PIN e neoplasia. Além disso, cortes corados em HE representando cada afecção foram utilizados na determinação da área nuclear média por morfometria computadorizada. Cortes histológicos obtidos em lâminas silanizadas foram utilizados na imunoistoquímica para células basais (p63 e 34E-12), conexinas 32 e 43, receptor de andrógeno (AR) e antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA). Amostras foram coletadas também em nitrogênio líquido e mantidas a 80o C para a realização do PCR quantitativo em tempo real, para a determinação da expressão do RNAm do AR, e para a realização do Western blot, para a determinação da expressão da conexina 43. As afecções mais freqüentes foram a prostatite e a hiperplasia prostática benigna. Foi observada uma maior porcentagem de células basais e um alto índice proliferativo, como demonstrado pela imunoistoquímica para o PCNA, na neoplasia intraepitelial prostática. Além disso, observou-se nessas lesões marcação nuclear heterogênea para o AR, menor em relação à dos ácinos benignos. Ao contrário do observado na próstata humana, não foi observada expressão das conexinas 32 e 43 na próstata canina (normal ou com PIN). A área nuclear média, obtida pela morfometria computadorizada, foi maior em células epiteliais de ácinos apresentando PIN e/ou neoplasia em relação à de células epiteliais de ácinos benignos. Observou-se expressão variável do RNAm para o AR nas PINs e neoplasias, utilizando-se o PCR em tempo real. Estes achados sugerem que células basais malignas desempenham papel na origem da neoplasia intraepitelial prostática e possuem capacidade de proliferar a despeito da expressão heterogênea do receptor de andrógeno. / Dogs are the only animal other than man to develop prostate cancer, prostatic intraepithelial neoplasia (PIN) and benign prostatic hyperplasia (HPB) spontaneously, allowing the comparison between benign and malignat affections of prostate. Malignant stem cells among the basal cell layer of the prostate are believed to play an important role in the failure of androgen-ablation therapy that occurs in most advanced prostate cancer. The goal of this study was to characterize the canine prostate in relation to evolution to prostatic carcinoma, trying to identify the cellular origin and the alterations of pre-neoplastic lesions. Forty-four canine prostates were obtained at necropsy. Prostatic samples were fixed in methacarn, embedded in paraffin wax and sectioned into 5µm-thick slices for hematoxylin eosin (HE) staining and evaluated for the presence of hyperplasia, prostatitis, PIN and neoplasia. Moreover, HE stained sections representing each affection were used to determine the mean nuclear area by computerized morphometry. Tissue sections obtained in silanized slides were used in immunohistochemical staining for basal cells (p63 and 34E-12), connexins 32 and 43, androgen receptor (AR) and proliferating-cell nuclear antigen (PCNA). Quantitative real-time PCR to determine the expression level of AR at the mRNA level and Western blot to protein levels of connexin 43 were examined in samples collected using liquid nitrogen and kept at 80o C. The most common lesions were prostatitis and benign prostatic hyperplasia. The prostatic intraepithelial neoplasia exhibited a higher percent of basal cells and was highly proliferative, as demonstrated by PCNA immunohistochemistry. Moreover, these lesions exhibited heterogeneous nuclear AR staining, lower in comparision with benign acini. In contrast to human prostate, the canine prostate (normal or harboring PIN) did not express the connexins 32 and 43. The mean nuclear area measured by computerized morphometry was greater in epithelial cells of PIN and neoplastic acini than that of benign acini. We found variable RNAm AR expression in prostatic intraepithelial neoplasia and neoplasia by real-time PCR. These findings suggest that malignant basal cells may play a role in the origin of PIN and can proliferate despite the heterogeneous AR expression.

Recentemente, tem sido demonstrado que a maioria dos RNAs transcritos em células humanas são RNAs não-codificadores de proteínas (ncRNAs) originados de íntrons ou regiões intergênicas. Em trabalhos anteriores realizados por nosso grupo, foram descritos longos ncRNAs transcritos de regiões intrônicas de genes codificadores e cuja expressão foi correlacionada ao grau de diferenciação de tumores de próstata, apontando para a relevância fisiológica desta classe de transcritos. Apesar de sua abundância, as propriedades, funções e regulação da grande maioria dos ncRNAs ainda não foram elucidadas. O objetivo do presente trabalho foi investigar a biossíntese de ncRNAs intrônicos em células humanas, primordialmente a contribuição da RNA Polimerase II (RNAP II), bem como aspectos de sua regulação. Primeiramente, o modelo de regulação da expressão gênica por hormônio andrógeno foi utilizado para avaliação da participação direta de um fator de transcrição de RNAP II, o Receptor de Andrógeno (AR), na modulação da transcrição de ncRNAs intrônicos. Utilizando-se a técnica de imunoprecipitação da cromatina, foi detectada a ligação do AR ao elemento de resposta a andrógeno (ARE) presente em um possível promotor de um transcrito intrônico antisenso (derivado do locus Myo5A), cuja expressão é aumentada em células da linhagem LNCaP tratadas com o hormônio. A ligação ao ARE foi induzida pelo tratamento, sugerindo que o efeito do andrógeno na expressão do ncRNA é mediado pelo AR. Em uma segunda abordagem, o efeito da inibição da transcrição por RNAP II com α-amanitina por 24 h em células LNCaP foi avaliado com o uso de microarranjos de oligonucleotídeos representando transcritos total ou parcialmente intrônicos, além de éxons de genes codificadores. A expressão de menos de 20 % dos transcritos intrônicos foi afetada, fração significativamente menor que a observada para os transcritos exônicos (40 %). Ainda que a maioria dos ncRNAs intrônicos diferencialmente expressos tenha sua abundância diminuída, interessantemente, 13 a 16 % foram aumentados, contrastando com aproximadamente 2 a 3 % de exônicos que aumentaram. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a RNAP II atua na transcrição de ncRNAs intrônicos, mas que uma fração considerável pode ser transcrita por outra RNA Polimerase. / It has been recently shown that the bulk of the transcription in human cells is comprised of non-protein-coding RNAs (or noncoding RNAs - ncRNAs) transcribed from introns and intergenic regions of the genome. Previous work from our group has demonstrated that expression of long intronic ncRNAs can be correlated to the degree of prostate tumor differentiation, underscoring the physiological relevance of these transcripts. However, the properties, functions, and regulation of this huge population of ncRNAs remain largely unknown. The present work aimed to investigate the biosynthesis of intronic ncRNAs and aspects of its regulation in human cells, focusing on the contribution of RNA Polymerase II (RNAP II). Initially, the model of regulation of gene expression by androgen hormone was used in order to evaluate the participation of the RNAP II transcription factor Androgen Receptor (AR) in the transcriptional regulation of intronic ncRNAs. Chromatin immunoprecipitation experiments revealed the binding of the AR in an androgen response element (ARE) present in a putative promoter driving the expression of an antisense intronic transcript in Myo5A locus in LNCaP cells. The interaction occurred in an androgen-inducible fashion, along with the up-regulation of the transcript, suggesting that hormone activation occurred in a direct manner mediated by the AR. In a different approach, the effect of RNAP II inhibition with α-amanitin for 24 h in LNCaP cells was analyzed using an oligoarray representing totally and partially intronic transcripts, as well as exons of proteincoding genes. The expression of less than 20 % of the intronic transcripts was affected by the treatment, contrasting to a significantly higher fraction observed for exonic messages (40 %). Moreover, most differentially expressed intronic transcripts were down-regulated, but strikingly 13 to 16 % were up-regulated in cells with blocked RNAP II, while this fraction for exonic transcripts was about 2 %. The results described here demonstrate that RNAP II in fact plays a role in intronic transcription in human cells, but also highlight that another transcriptional system may account for the biogenesis of a fraction of intronic ncRNAs.

Recentemente, tem sido demonstrado que a maioria dos RNAs transcritos em células humanas são RNAs não-codificadores de proteínas (ncRNAs) originados de íntrons ou regiões intergênicas. Em trabalhos anteriores realizados por nosso grupo, foram descritos longos ncRNAs transcritos de regiões intrônicas de genes codificadores e cuja expressão foi correlacionada ao grau de diferenciação de tumores de próstata, apontando para a relevância fisiológica desta classe de transcritos. Apesar de sua abundância, as propriedades, funções e regulação da grande maioria dos ncRNAs ainda não foram elucidadas. O objetivo do presente trabalho foi investigar a biossíntese de ncRNAs intrônicos em células humanas, primordialmente a contribuição da RNA Polimerase II (RNAP II), bem como aspectos de sua regulação. Primeiramente, o modelo de regulação da expressão gênica por hormônio andrógeno foi utilizado para avaliação da participação direta de um fator de transcrição de RNAP II, o Receptor de Andrógeno (AR), na modulação da transcrição de ncRNAs intrônicos. Utilizando-se a técnica de imunoprecipitação da cromatina, foi detectada a ligação do AR ao elemento de resposta a andrógeno (ARE) presente em um possível promotor de um transcrito intrônico antisenso (derivado do locus Myo5A), cuja expressão é aumentada em células da linhagem LNCaP tratadas com o hormônio. A ligação ao ARE foi induzida pelo tratamento, sugerindo que o efeito do andrógeno na expressão do ncRNA é mediado pelo AR. Em uma segunda abordagem, o efeito da inibição da transcrição por RNAP II com α-amanitina por 24 h em células LNCaP foi avaliado com o uso de microarranjos de oligonucleotídeos representando transcritos total ou parcialmente intrônicos, além de éxons de genes codificadores. A expressão de menos de 20 % dos transcritos intrônicos foi afetada, fração significativamente menor que a observada para os transcritos exônicos (40 %). Ainda que a maioria dos ncRNAs intrônicos diferencialmente expressos tenha sua abundância diminuída, interessantemente, 13 a 16 % foram aumentados, contrastando com aproximadamente 2 a 3 % de exônicos que aumentaram. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a RNAP II atua na transcrição de ncRNAs intrônicos, mas que uma fração considerável pode ser transcrita por outra RNA Polimerase. / It has been recently shown that the bulk of the transcription in human cells is comprised of non-protein-coding RNAs (or noncoding RNAs - ncRNAs) transcribed from introns and intergenic regions of the genome. Previous work from our group has demonstrated that expression of long intronic ncRNAs can be correlated to the degree of prostate tumor differentiation, underscoring the physiological relevance of these transcripts. However, the properties, functions, and regulation of this huge population of ncRNAs remain largely unknown. The present work aimed to investigate the biosynthesis of intronic ncRNAs and aspects of its regulation in human cells, focusing on the contribution of RNA Polymerase II (RNAP II). Initially, the model of regulation of gene expression by androgen hormone was used in order to evaluate the participation of the RNAP II transcription factor Androgen Receptor (AR) in the transcriptional regulation of intronic ncRNAs. Chromatin immunoprecipitation experiments revealed the binding of the AR in an androgen response element (ARE) present in a putative promoter driving the expression of an antisense intronic transcript in Myo5A locus in LNCaP cells. The interaction occurred in an androgen-inducible fashion, along with the up-regulation of the transcript, suggesting that hormone activation occurred in a direct manner mediated by the AR. In a different approach, the effect of RNAP II inhibition with α-amanitin for 24 h in LNCaP cells was analyzed using an oligoarray representing totally and partially intronic transcripts, as well as exons of proteincoding genes. The expression of less than 20 % of the intronic transcripts was affected by the treatment, contrasting to a significantly higher fraction observed for exonic messages (40 %). Moreover, most differentially expressed intronic transcripts were down-regulated, but strikingly 13 to 16 % were up-regulated in cells with blocked RNAP II, while this fraction for exonic transcripts was about 2 %. The results described here demonstrate that RNAP II in fact plays a role in intronic transcription in human cells, but also highlight that another transcriptional system may account for the biogenesis of a fraction of intronic ncRNAs.

Orientador: Patricia Fernanda Felipe Pinheiro / Resumo: A programação fetal (PF) é o resultado permanente do organismo na presença de estímulos ocorridos durante os períodos críticos de desenvolvimento. Vários fatores ambientais podem levar à PF. Entre eles, podemos citar a restrição alimentar materna ou a deficiência específica de nutrientes. De acordo com a janela de programação fetal masculinizante (MPW), os andrógenos agem para assegurar o desenvolvimento normal dos órgãos reprodutores do macho, assim, foram estudados os efeitos da restrição proteica materna durante a gestação e lactação sobre o desenvolvimento da próstata ventral de ratos Wistar. Para isto, dois grupos de ratas gestantes foram alimentadas com dietas isocalóricas, sendo um grupo normoproteico (NP) e o outro grupo hipoproteico (RP). Os grupos NP e RP tiveram livre acesso à dieta durante os períodos de gestação e lactação. Após o desmame, metade da prole de machos foi eutanasiada. A outra metade da prole de machos recebeu dieta padrão de animais de laboratório até os 120 dias de idade. A próstata ventral foi estudada por imuno-histoquímica para a avaliação da localização do antígeno de proliferação celular (PCNA), da proteína p63, dos receptores de andrógeno (AR), de estrógeno alfa (ER-α), de grelina (GHSR-1a), de leptina (Ob -R). Os pesos corpóreo, da próstata ventral, dos testículos e do tecido adiposo e os níveis de testosterona e estradiol foram obtidos. A PF determinou atraso no crescimento somático dos animais do grupo RP e diminuição do estradiol plasmáti... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Fetal programming (FP) is the permanent result of the organism in the presence of stimuli during the periods of development. Several environmental factors can lead to FP. Among them, we can mention the maternal food restriction or deficiency of specific nutrients. According to the masculinization programming window (MPW) in which androgens act to ensure normal development of the male reproductive organs, we studied the effects of maternal protein restriction during pregnancy and lactation period on the development of the Wistar rat ventral prostate. Dams of the group (NP) were fed diet containing 17% protein; Dams of the group (RP) were fed diet containing 8% protein. The NP and RP groups had free access to diet during pregnancy and lactation period. After weaning, half of the male pups was killed. The other half of male pups received a standard laboratory diet until 120 days old. The ventral prostate was studied immunohistochemically to evaluate the expression of cell proliferation antigen (PCNA), p63 protein, androgen (AR), alpha estrogen (ER-α), ghrelin (GHSR-1a), leptin (Ob -R) receptors. The body, ventral prostate, testes and adipose tissue weights, testosterone and estradiol levels were determined. FP determined a delay somatic growth of the RP group and decrease of the plasmatic estradiol of the adult animals of the RP group. At 21 days of age, the RP group presented less intense immunostaining for ER-α, GHSR-1a, and Ob-R when compared to the NP group. At 120 days, the... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor