Orientador: Lilia F. R. de Souza Li / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T01:59:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrade_SimoneCaixetade_M.pdf: 1991149 bytes, checksum: 4c5b783ab7776886c12977300fbb6af7 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O CASR pertence à família C dos receptores que se acoplam à proteína G e é ativado quando interage com o cálcio extracelular, sendo responsável pelo ajuste do ¿set point¿ do cálcio extracelular por meio da regulação da secreção de PTH e excreção de cálcio. Mutações no Receptor Sensor de Cálcio (CASR) estão associadas a FHH (Hipercalcemia Hipocalciúrica Familiar) e NSHTP (Hiperparatireoidismo Neonatal Grave) quando inativadoras do receptor e ADH (Hipoparatireoidismo Autossômico Dominante) quando ativadoras. O Hiperparatireoidismo Neonatal Grave (NSHPT) é uma doença rara caracterizada por calcemias elevadas, próximas às consideradas incompatíveis à vida, associada ao aumento da concentração de PTH, desmineralização óssea grave e sintomas neonatais como hipotonia e baixo ganho ponderal. Trata-se de uma doença familiar, com pais portadores de Hipercalcemia Hipocalciúrica Familiar (FHH), uma doença autossômica dominante, geralmente assintomática, com calcemias elevadas ou no limite superior da normalidade, associada a concentrações de PTH normais, porém não suprimidas e hipocalciúria. ADH, por sua vez, cursam com desregulação no ajuste da concentração de cálcio extracelular, onde baixas concentrações de cálcio ativam o receptor e inibem a secreção de PTH pelas paratireóides e aumentam a excreção de cálcio pelos rins. Indivíduos afetados apresentam hipocalcemia, PTH no limite inferior ou abaixo do normal, hiperfosfatemia e hipercalciúria. O objetivo desse trabalho foi estudar duas famílias portadoras de NSHPT e FHH, identificar novas mutações e analisar o grau de expressão dos receptores mutados. Identificamos três mutações pontuais, nas posições c.1913.G>T, c.2.T>G e c.2244.C>G. Na família S encontramos a mutação c.1913.G>T que resulta em mudança de aminoácido Arginina por Leucina na posição 638 e a mutação silenciosa c.2244.C>G que não altera o aminoácido Prolina da posição 748. Na família J encontramos a mutação c.2.T>G que resulta em mudança do primeiro aminoácido Metionina e em perda da seqüência Kozak (AXXATGG). Um programa de análise para a previsão de seqüências utilizadas para início da tradução protéica, indicou que, na presença da mutação, o ATG com maior probabilidade de ser utilizado como o novo sítio de início de tradução localiza-se no exon 3, na mesma matriz de leitura original. Para análise da expressão do receptor, com a mutação no códon inicial de transcrição do receptor (p.M1?), inserimos no cDNA do CASR um fragmento correspondente à região -226 a 66 do CASR, contendo cinco potenciais seqüências Kozak. Para o estudo da expressão dos receptores mutados da família S inserimos as mutações no cDNA do CASR através de mutagênese sítio dirigida. Analisamos a expressão dos receptores mutados através do Western Blot. O receptor mutado p.R638L apresentou uma expressão similar ao receptor nativo e foram visualizadas as formas monoméricas correspondentes às bandas de 140kDa (forma imatura, parcialmente glicosilada) e 160kDa (forma madura e glicosilada) e bandas superiores maiores que 220kDa. A mutação c.2244.C>G é silenciosa e apresentou expressão similar à do receptor nativo. Em contraste, a expressão do receptor mutado p.M1? através do Western blot estava consideravelmente reduzida. Nos experimentos de imunocitoquímica, observamos que o receptor nativo foi bem expresso na superfície celular tanto em células não permeabilizadas, quanto permeabilizadas. Padrão semelhante foi observado para o receptor mutado p.R638L, indicando maturação e processamento apropriado no retículo endoplasmático enquanto que o receptor com a mutação p.M1? não foi visualizado na superfície celular de células não permeabilizadas e só foi identificado no interior de células permeabilizadas, sugerindo que o receptor mutado era retido no retículo endoplasmático não conseguindo se expressar na membrana plasmática / Abstract: The CASR belongs to family C of the G protein coupled receptors and it is activated by the interaction with extracellular calcium, which is responsible for adjusting extracellular calcium set point adjusting PTH and calcium excretion. Calcium Sensing Receptor mutations are related to Familial Hypocalciuric Hypercalcemia (FHH) and Neonatal Severe Hyperparathyroidism (NSHPT) when inactivating and to Autosomal Dominant Hypocalcemia (ADH) when activating. Neonatal Severe Hyperparathyroidism (NSHPT) is a rare disease characterized by hypercalcemia, calcium levels close to those incompatible with life, markedly elevated PTH levels, severe bone demineralization and neonatal symptoms as hypotonia and poor weight gain. Familial Hypocalciuric Hypercalcemia is a familial disease with Autosomal dominant inheritance, in which parents are usually affected, generally asymptomatic, mild ¿ to ¿ moderate hypercalcemia and normal PTH levels (but not suppressed) and hypocalciuria. In ADH, affected individuals¿ present hypocalcemia, PTH at the lower limit or normal range, hyperphosphatemia and hypercalciuria. The objective of this work was study of two families (S and J) with Neonatal Severe Hyperparathyroidism and Familial Hypocalciuric Hypercalcemia, search for new mutations and analyze the expression pattern of mutated receptors. Three new missense mutations were found: c.1913.G>T, c.2.T>G and c.2244.C>G. The mutation c.1913.G>T was identified at family S. and resulted in Arginine to Leucine change at codon 638. The silent mutation c.2244.C>G didn¿t change the amino acid Proline at codon 748. A novel mutation in exon 2, T to G transition at nucleotide 2, changing Metionine to Arginine was identified at family M. The mutation disrupts the original Kozak sequence (AXXATGG), altering the protein start site. Computational analysis using a program that predicts start sites showed that the putative new translation start site was in the exon 3 in frame. A portion of the gene containing the mutation and five cryptic Kozak sequences (-226 to 66) was used to analyze the expression of the mutant receptor (p.M1?). To analyze the expression pattern of Family S, the mutated cDNAs was inserted in a vector, using site direct mutagenesis. Western blot was performed to analyze the expression analysis of the mutated receptors. The p.R638L receptor showed similar expression pattern compared with the wild type receptor, presenting the monomeric forms of 140 (immature, partial glycosylated) and 160kDa (mature, glycosylated) and other forms higher than 200kDa. The mutation c.2244.C>G showed similar expression pattern compared with the wild type receptor. In contrast, Western blot expression levels of the mutant receptor p.M1? was dramatically reduced. Immunocytochemistry experiments showed strong staining at the cell surface of nonpermeabilized and permeabilized HEK293 cells expressing the wild type receptor. The same pattern was observed for the mutant receptor p.R638L, suggesting correct maturation and trafficking. While the mutant receptor p.M1? was not expressed on the cell surface and the staining was only identified inside permeabilized cells, suggesting that the mutant receptor was trapped within the endoplasmatic reticulum and was not expressed at the plasmatic membrane / Mestrado / Mestre em Farmacologia