A expressão dos receptores da ocitocina (OTR) em machos, embora estudada em algumas espécies, não foi ainda estabelecida em cães. O objetivo deste estudo foi trazer novas perspectivas para a utilização terapêutica da ocitocina (OT) em patologias reprodutivas em cães já que tem sido utilizada no tratamento da infertilidade em homens. Foi realizada a imunolocalização dos receptores de OTR em amostras de testículo e epidídimo de cães coletadas por cirurgia eletiva de orquiectomia e fixadas em formaldeído tamponado a 10%. Seguiu-se o processamento histológico de rotina, desparafinização, desidratação e recuperação de sítios antigênicos. A incubação foi feita com o anticorpo primário anti-OTR humano policlonal produzido em coelho e o polímero NOVOLINK da Nicherei®. A imunomarcação foi observada nas células mioepiteliais, células da musculatura lisa do estroma e nas células de Leydig no testículo e muito mais intensa nas células da musculatura lisa da região do epidídimo. A expressão dos OTR demonstrou-se maior no epidídimo quando comparada ao testículo. A distribuição dos OTR na imunomarcação e no western blotting reforçam os dados da literatura que sugerem ação da ocitocina no estímulo da contratilidade dos túbulos seminíferos e epidídimo, assim como seu papel na modulação dos níveis de androgênios nestes tecidos estimulando a conversão da testosterona em diidrotestosterona (DHT). Nossos resultados corroboram com a literatura permitindo que o conhecimento da distribuição das OTR no testículo e epidídimo de cães possibilite a utilização terapêutica da ocitocina e novas perspectivas para a área de reprodução e biotecnologia de cães. / The expression of oxytocin receptors (OTR) in the male reproductive tract has been studied in several species with the exception of the dogs. In men, oxytocin (OT) therapy has been successfully used to treat infertility. Therefore, the aim of the present study was to provide new perspectives for the therapeutic use of oxytocin (OT) in reproductive disorders in dogs. We performed the immunolocalization of OTR in samples of testis and epididymides of dogs collected by elective orchiectomy and fixed in 10% buffered formaldehyde. This was followed by routine histological processing, deparaffinization, dehydration and recovery of antigenic sites. Incubation was performed with the human polyclonal anti-OTR primary antibody produced in rabbits and the NOVOLINK polymer (Nichirei, Japan). Oxytocin receptor Immunostaining was observed in myoepithelial, smooth muscle, stromal, and Leydig cells in the testis and, a more intense staining was found in the smooth muscle cells in the region of the epididymis. The distribution of OTR immunostaining and expression on western blotting reinforces the hypothesis proposed by previous studies that oxytocin may stimulate seminiferous tubules and epididymis contractility, and modulate the androgen levels in these tissues, stimulating the conversion of testosterone to dihydrotestosterone (DHT).Results suggest that testicular and epididymal OTR immunolocalization in dogs may be similar to previously studied species. This could indicate that the therapeutic use of oxytocin could be an alternative in infertile dogs, providing new insights to the reproduction and biotechnology in this species.

A expressão dos receptores da ocitocina (OTR) em machos, embora estudada em algumas espécies, não foi ainda estabelecida em cães. O objetivo deste estudo foi trazer novas perspectivas para a utilização terapêutica da ocitocina (OT) em patologias reprodutivas em cães já que tem sido utilizada no tratamento da infertilidade em homens. Foi realizada a imunolocalização dos receptores de OTR em amostras de testículo e epidídimo de cães coletadas por cirurgia eletiva de orquiectomia e fixadas em formaldeído tamponado a 10%. Seguiu-se o processamento histológico de rotina, desparafinização, desidratação e recuperação de sítios antigênicos. A incubação foi feita com o anticorpo primário anti-OTR humano policlonal produzido em coelho e o polímero NOVOLINK da Nicherei®. A imunomarcação foi observada nas células mioepiteliais, células da musculatura lisa do estroma e nas células de Leydig no testículo e muito mais intensa nas células da musculatura lisa da região do epidídimo. A expressão dos OTR demonstrou-se maior no epidídimo quando comparada ao testículo. A distribuição dos OTR na imunomarcação e no western blotting reforçam os dados da literatura que sugerem ação da ocitocina no estímulo da contratilidade dos túbulos seminíferos e epidídimo, assim como seu papel na modulação dos níveis de androgênios nestes tecidos estimulando a conversão da testosterona em diidrotestosterona (DHT). Nossos resultados corroboram com a literatura permitindo que o conhecimento da distribuição das OTR no testículo e epidídimo de cães possibilite a utilização terapêutica da ocitocina e novas perspectivas para a área de reprodução e biotecnologia de cães. / The expression of oxytocin receptors (OTR) in the male reproductive tract has been studied in several species with the exception of the dogs. In men, oxytocin (OT) therapy has been successfully used to treat infertility. Therefore, the aim of the present study was to provide new perspectives for the therapeutic use of oxytocin (OT) in reproductive disorders in dogs. We performed the immunolocalization of OTR in samples of testis and epididymides of dogs collected by elective orchiectomy and fixed in 10% buffered formaldehyde. This was followed by routine histological processing, deparaffinization, dehydration and recovery of antigenic sites. Incubation was performed with the human polyclonal anti-OTR primary antibody produced in rabbits and the NOVOLINK polymer (Nichirei, Japan). Oxytocin receptor Immunostaining was observed in myoepithelial, smooth muscle, stromal, and Leydig cells in the testis and, a more intense staining was found in the smooth muscle cells in the region of the epididymis. The distribution of OTR immunostaining and expression on western blotting reinforces the hypothesis proposed by previous studies that oxytocin may stimulate seminiferous tubules and epididymis contractility, and modulate the androgen levels in these tissues, stimulating the conversion of testosterone to dihydrotestosterone (DHT).Results suggest that testicular and epididymal OTR immunolocalization in dogs may be similar to previously studied species. This could indicate that the therapeutic use of oxytocin could be an alternative in infertile dogs, providing new insights to the reproduction and biotechnology in this species.

A ocitocina (OT) é um neuropeptídio hipotalâmico, que dentre suas funções na fêmea destaca-se a contração uterina durante o parto e a ejeção do leite. No entanto, estudos vêm demonstrando importantes funções endócrinas e parácrinas no trato reprodutivo masculino. Evidenciando a possível ação conjunta entre OT e a Globulina ligadora de hormônios sexuais (SHBG). Entretanto, em cães não existem informações disponíveis quanto sua atuação. Assim, estudos direcionados aos receptores de ocitocina (OTR) e SHBG e suas funções no sistema reprodutor masculino, mais especificamente na fisiologia espermática, são de suma importância para os conhecimentos da fisiologia reprodutiva para posterior aplicação em biotecnologias reprodutivas em pequenos animais e humanos, fomentando também novas perspectivas para a utilização terapêutica da ocitocina em enfermidades reprodutivas. Portanto, o objetivo deste estudo é verificar a expressão gênica e proteica do OTR e SHBG no testículo e epidídimo de cães, correlacionando tais dados com a qualidade espermática e dosagem de testosterona. Para tal, foram coletados testículos e epidídimos de 26 cães em idade reprodutiva (1 a 5 anos). Após a orquiectomia, foi realizada a coleta dos espermatozoides provenientes da cauda do epidídimo e então, as amostras foram analisadas quanto à motilidade computadorizada do sêmen (CASA), integridade de membrana plasmática (Eosina/Nigrosina), integridade de membrana acrossomal (Fast Green / Rosa Bengala) e atividade mitocondrial (3´3 Diaminobenzidine). A imunolocalização do OTR e SHBG foi realizada através de imunoistoquímica e imunofluorescência. E a análise de expressão gênica, através da Reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT PCR). E da expressão proteica, através do Western Blotting. Foram encontradas correlações significantes e positivas entre as expressões gênicas do OTR e do SHBG, tanto no testículo como no epidídimo. Além disto, a expressão do OTR no testículo correlacionou-se positivamente com espermatozoides com membrana acrossomal íntegra e negativamente com a porcentagem de células com baixa atividade mitocondrial. Já o SHBG do testículo, correlacionou-se positivamente com a concentração de espermatozoides, porcentagens de células com membrana plasmática e acrossomal íntegras, motilidade, motilidade progressiva e velocidade rápida, e negativamente com a porcentagem de células com baixa atividade mitocondrial. Por outro lado, no epidídimo, a expressão gênica do SHBG apresentou correlação positiva com a porcentagem de células com membrana plasmática íntegra e expressão proteica de SHBG no testículo. Quanto a expressão proteica, o OTR no testículo obteve correlação positiva com testosterona e negativa com atividade mitocondrial nula, já no epidídimo, ocorreu correlação positiva com integridade de membrana acrossomal e negativa também com atividade mitocondrial nula. Em relação ao SHBG, houve correlação positiva com a expressão gênica do SHBG no epidídimo, células normais e padrões de velocidade. E na imunoistoquímica foi possível observar a imunomarcação do OTR e SHBG na musculatura lisa e células de Leydig do testículo e OTR na musculatura lisa do epidídimo. No entanto, não houve imunomarcação do SHBG no epidídimo, assim como expressão proteica. Nossos resultados demonstraram que o OTR e SHBG são expressos nos testículos e epidídimos de cães e que estão relacionados a funções espermáticas importantes, sendo essenciais para o sucesso reprodutivo / Oxytocin (OT) is a hypothalamic neuropeptide that plays important and well known roles in the female such as uterine contraction during childbirth and milk ejection. Notwithstanding, studies have shown important endocrine and paracrine functions also in the male reproductive tract, highlighted by the possible joint action between OT and sex hormone-binding globulin (SHBG). In dogs, however, there is no information available with regards to the role of these hormones in the reproductive function. Thus, studies directed to oxytocin (OTR) and SHBG receptors and their functions in the male reproductive system, specifically with regards to sperm physiology. Such knowledge is essential to understand the reproductive physiology for the subsequent use in reproductive biotechnologies in small animals and humans, especially by providing new perspectives for the therapeutic use of oxytocin in reproductive disorders. Therefore, the aim of this study is to assess the gene and protein expression of OTR and SHBG in the testis and epididymis of dogs, correlating these data with sperm quality and testosterone dosage. To this end, testis and epididymis were collected from 26 dogs in reproductive age (1 to 5 years). After orchiectomy, collection of sperm from the cauda epididymis was carried out and then the samples were analyzed for computerized motility of semen (CASA), plasma membrane integrity (eosin / nigrosine), acrosome membrane integrity (Fast Green / rose Bengal) and mitochondrial activity (3\'3 Diaminobenzidine). The immunolocalization of OTR and SHBG was performed by immunohistochemistry and immunofluorescence. Gene expression analysis was performed by real time polymerase chain reaction (qRT - PCR). The protein expression was further assessed by Western Blotting. Significant positive correlations were found between the gene expressions of OTR and SHBG in both the testis and epididymis. Furthermore, the OTR expression in testis was positively correlated to sperm with intact acrosome membrane and negatively to the percentage of cells with low mitochondrial activity. On the other hand, testicular SHBG was positively correlated with sperm concentration, percentage of sperm with intact plasma membrane and acrosome, motility, progressive motility and the percentage of RAPID sperm. Also, negative correlation was found between testicular SHBG and the percentage of cells with low mitochondrial activity. Furthermore, in the epididymis, SHBG gene expression was positively correlated to the percentage of cells with intact plasma membrane and protein expression of SHBG in the testis. In relation to the protein expression, the OTR in the testis correlated positively with blood plasma testosterone and negatively with sperm with no mitochondrial activity. In the epididymis, OTR protein expression correlated positively with sperm showing intact acrosome and negatively with cells with no mitochondrial activity. With regards to SHBG proteins expression, there was a positive correlation to SHBG gene expression in the epididymis, normal cells and some patterns of sperm velocity. In the immunohistochemistry, we observed the OTR and SHBG immunostainings in the smooth muscle and Leydig cells of the testis while, in the epididymis, the OTR immunostaining could be observed only in the smooth muscle. Interestingly, there was no immunostaining or protein expression of SHBG in the epididymis. Our results demonstrated that OTR and SHBG are expressed in the testis and epididymis of dogs and are related to important sperm functions, essential for reproductive success

A ocitocina (OT) é um neuropeptídio hipotalâmico, que dentre suas funções na fêmea destaca-se a contração uterina durante o parto e a ejeção do leite. No entanto, estudos vêm demonstrando importantes funções endócrinas e parácrinas no trato reprodutivo masculino. Evidenciando a possível ação conjunta entre OT e a Globulina ligadora de hormônios sexuais (SHBG). Entretanto, em cães não existem informações disponíveis quanto sua atuação. Assim, estudos direcionados aos receptores de ocitocina (OTR) e SHBG e suas funções no sistema reprodutor masculino, mais especificamente na fisiologia espermática, são de suma importância para os conhecimentos da fisiologia reprodutiva para posterior aplicação em biotecnologias reprodutivas em pequenos animais e humanos, fomentando também novas perspectivas para a utilização terapêutica da ocitocina em enfermidades reprodutivas. Portanto, o objetivo deste estudo é verificar a expressão gênica e proteica do OTR e SHBG no testículo e epidídimo de cães, correlacionando tais dados com a qualidade espermática e dosagem de testosterona. Para tal, foram coletados testículos e epidídimos de 26 cães em idade reprodutiva (1 a 5 anos). Após a orquiectomia, foi realizada a coleta dos espermatozoides provenientes da cauda do epidídimo e então, as amostras foram analisadas quanto à motilidade computadorizada do sêmen (CASA), integridade de membrana plasmática (Eosina/Nigrosina), integridade de membrana acrossomal (Fast Green / Rosa Bengala) e atividade mitocondrial (3´3 Diaminobenzidine). A imunolocalização do OTR e SHBG foi realizada através de imunoistoquímica e imunofluorescência. E a análise de expressão gênica, através da Reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT PCR). E da expressão proteica, através do Western Blotting. Foram encontradas correlações significantes e positivas entre as expressões gênicas do OTR e do SHBG, tanto no testículo como no epidídimo. Além disto, a expressão do OTR no testículo correlacionou-se positivamente com espermatozoides com membrana acrossomal íntegra e negativamente com a porcentagem de células com baixa atividade mitocondrial. Já o SHBG do testículo, correlacionou-se positivamente com a concentração de espermatozoides, porcentagens de células com membrana plasmática e acrossomal íntegras, motilidade, motilidade progressiva e velocidade rápida, e negativamente com a porcentagem de células com baixa atividade mitocondrial. Por outro lado, no epidídimo, a expressão gênica do SHBG apresentou correlação positiva com a porcentagem de células com membrana plasmática íntegra e expressão proteica de SHBG no testículo. Quanto a expressão proteica, o OTR no testículo obteve correlação positiva com testosterona e negativa com atividade mitocondrial nula, já no epidídimo, ocorreu correlação positiva com integridade de membrana acrossomal e negativa também com atividade mitocondrial nula. Em relação ao SHBG, houve correlação positiva com a expressão gênica do SHBG no epidídimo, células normais e padrões de velocidade. E na imunoistoquímica foi possível observar a imunomarcação do OTR e SHBG na musculatura lisa e células de Leydig do testículo e OTR na musculatura lisa do epidídimo. No entanto, não houve imunomarcação do SHBG no epidídimo, assim como expressão proteica. Nossos resultados demonstraram que o OTR e SHBG são expressos nos testículos e epidídimos de cães e que estão relacionados a funções espermáticas importantes, sendo essenciais para o sucesso reprodutivo / Oxytocin (OT) is a hypothalamic neuropeptide that plays important and well known roles in the female such as uterine contraction during childbirth and milk ejection. Notwithstanding, studies have shown important endocrine and paracrine functions also in the male reproductive tract, highlighted by the possible joint action between OT and sex hormone-binding globulin (SHBG). In dogs, however, there is no information available with regards to the role of these hormones in the reproductive function. Thus, studies directed to oxytocin (OTR) and SHBG receptors and their functions in the male reproductive system, specifically with regards to sperm physiology. Such knowledge is essential to understand the reproductive physiology for the subsequent use in reproductive biotechnologies in small animals and humans, especially by providing new perspectives for the therapeutic use of oxytocin in reproductive disorders. Therefore, the aim of this study is to assess the gene and protein expression of OTR and SHBG in the testis and epididymis of dogs, correlating these data with sperm quality and testosterone dosage. To this end, testis and epididymis were collected from 26 dogs in reproductive age (1 to 5 years). After orchiectomy, collection of sperm from the cauda epididymis was carried out and then the samples were analyzed for computerized motility of semen (CASA), plasma membrane integrity (eosin / nigrosine), acrosome membrane integrity (Fast Green / rose Bengal) and mitochondrial activity (3\'3 Diaminobenzidine). The immunolocalization of OTR and SHBG was performed by immunohistochemistry and immunofluorescence. Gene expression analysis was performed by real time polymerase chain reaction (qRT - PCR). The protein expression was further assessed by Western Blotting. Significant positive correlations were found between the gene expressions of OTR and SHBG in both the testis and epididymis. Furthermore, the OTR expression in testis was positively correlated to sperm with intact acrosome membrane and negatively to the percentage of cells with low mitochondrial activity. On the other hand, testicular SHBG was positively correlated with sperm concentration, percentage of sperm with intact plasma membrane and acrosome, motility, progressive motility and the percentage of RAPID sperm. Also, negative correlation was found between testicular SHBG and the percentage of cells with low mitochondrial activity. Furthermore, in the epididymis, SHBG gene expression was positively correlated to the percentage of cells with intact plasma membrane and protein expression of SHBG in the testis. In relation to the protein expression, the OTR in the testis correlated positively with blood plasma testosterone and negatively with sperm with no mitochondrial activity. In the epididymis, OTR protein expression correlated positively with sperm showing intact acrosome and negatively with cells with no mitochondrial activity. With regards to SHBG proteins expression, there was a positive correlation to SHBG gene expression in the epididymis, normal cells and some patterns of sperm velocity. In the immunohistochemistry, we observed the OTR and SHBG immunostainings in the smooth muscle and Leydig cells of the testis while, in the epididymis, the OTR immunostaining could be observed only in the smooth muscle. Interestingly, there was no immunostaining or protein expression of SHBG in the epididymis. Our results demonstrated that OTR and SHBG are expressed in the testis and epididymis of dogs and are related to important sperm functions, essential for reproductive success