A biotecnologia é definida como qualquer aplicação tecnológica que utilize sistemas biológicos, organismos vivos, ou seus derivados, para fabricar ou modificar produtos ou processos para alguma utilização específica (ORGANIZAÇÃO DAS NAÇÕES UNIDAS, 1992). Os produtos biotecnológicos devem atender certas especificações exigidas pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), Food and Drug Administration (FDA), European Medicine Agency (EMEA) e Wood Health Organization (WHO). Para isso, utilizam-se técnicas rotineiras aplicadas à pesquisa e análise de biomoléculas como Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), Western blot, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) e espectrometria de massas (MS). A abordagem do Monitoramento de Reações Múltiplas (MRM) é considerada uma interessante alternativa aos ensaios imunoenzimáticos para caracterização e quantificação total de proteínas terapêuticas, sejam elas recombinantes ou não (KIM e DOYLE, 2010). Esta abordagem é baseada nos fundamentos da proteômica quantitativa pela utilização da cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial (LCMS/MS) cuja plataforma apresenta alta especificidade, sensibilidade e reprodutibilidade quantitativa em suas análises para detecção simultânea de várias regiões da estrutura proteica. Em vista disso, estabeleceu-se uma metodologia para quantificação do FVIII recombinante (FVIIIr) produzido pela linhagem celular humana Sk-Hep-1 ou do FVIII derivado do plasma (FVIIIdp), ambos utilizados no tratamento da Hemofilia A (HEMA). Para o estabelecimento da metodologia, toda uma estratégia de seleção e síntese química de peptídeos representativos das cadeias pesada e leve do FVIII humano foi empregada. Tais peptídeos obtidos foram utilizados como padrões das análises. Além disso, foi demonstrada a relação direta entre a quantificação total do FVIII com técnicas convencionais como ELISA, possibilitando a aplicação rotineira dessa abordagem para quantificação do FVIIIr e do FVIIIdp. / Biotechnology is defined as any technological application that uses biological systems, living organisms, or derivatives thereof, to make or modify products or processes for a specific use (ORGANIZAÇÃO DAS NAÇÕES UNIDAS, 1992). Biotechnological products must meet certain specifications required by Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), Food and Drug Administration (FDA), European Medicine Agency (EMEA), and Wood Health Organization (WHO). For that routine techniques applied to research and analysis of biomolecules such Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), Western blot, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), and mass spectrometry (MS) are utilized as quality control techniques. The MS-based approach termed Multiple Reaction Monitoring (MRM) is considered an interesting alternative to immunoassays for the total quantification and characterization of therapeutic proteins, whether recombinant or not (KIM e DOYLE, 2010). This approach is based on the fundamentals of quantitative proteomics and uses of liquid chromatography coupled to tandem spectrometric mass (LC-MS/MS) to obtain a highly specific, sensitive and reproducible analysis for quantification of multiple regions of a given protein structure. Here, we established a methodology for total quantification of recombinant FVIII (rFVIII) produced in Sk-Hep-1 human cell line or of plasma derived FVIII (pdFVIII), both used in the treatment of Hemophilia A (HEMA). For that, we adopted a strategy of selection and chemical peptide synthesis of representative peptides of the heavy and light chains of human FVIII, which were used as standards in the analysis. The quantitative MRM method developed here indicated a direct correlation with FVIII quantitative techniques such ELISA, which allows routine application of such approach for rFVIII and pdFVIII quantification.

A biotecnologia é definida como qualquer aplicação tecnológica que utilize sistemas biológicos, organismos vivos, ou seus derivados, para fabricar ou modificar produtos ou processos para alguma utilização específica (ORGANIZAÇÃO DAS NAÇÕES UNIDAS, 1992). Os produtos biotecnológicos devem atender certas especificações exigidas pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), Food and Drug Administration (FDA), European Medicine Agency (EMEA) e Wood Health Organization (WHO). Para isso, utilizam-se técnicas rotineiras aplicadas à pesquisa e análise de biomoléculas como Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), Western blot, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) e espectrometria de massas (MS). A abordagem do Monitoramento de Reações Múltiplas (MRM) é considerada uma interessante alternativa aos ensaios imunoenzimáticos para caracterização e quantificação total de proteínas terapêuticas, sejam elas recombinantes ou não (KIM e DOYLE, 2010). Esta abordagem é baseada nos fundamentos da proteômica quantitativa pela utilização da cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial (LCMS/MS) cuja plataforma apresenta alta especificidade, sensibilidade e reprodutibilidade quantitativa em suas análises para detecção simultânea de várias regiões da estrutura proteica. Em vista disso, estabeleceu-se uma metodologia para quantificação do FVIII recombinante (FVIIIr) produzido pela linhagem celular humana Sk-Hep-1 ou do FVIII derivado do plasma (FVIIIdp), ambos utilizados no tratamento da Hemofilia A (HEMA). Para o estabelecimento da metodologia, toda uma estratégia de seleção e síntese química de peptídeos representativos das cadeias pesada e leve do FVIII humano foi empregada. Tais peptídeos obtidos foram utilizados como padrões das análises. Além disso, foi demonstrada a relação direta entre a quantificação total do FVIII com técnicas convencionais como ELISA, possibilitando a aplicação rotineira dessa abordagem para quantificação do FVIIIr e do FVIIIdp. / Biotechnology is defined as any technological application that uses biological systems, living organisms, or derivatives thereof, to make or modify products or processes for a specific use (ORGANIZAÇÃO DAS NAÇÕES UNIDAS, 1992). Biotechnological products must meet certain specifications required by Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), Food and Drug Administration (FDA), European Medicine Agency (EMEA), and Wood Health Organization (WHO). For that routine techniques applied to research and analysis of biomolecules such Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), Western blot, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), and mass spectrometry (MS) are utilized as quality control techniques. The MS-based approach termed Multiple Reaction Monitoring (MRM) is considered an interesting alternative to immunoassays for the total quantification and characterization of therapeutic proteins, whether recombinant or not (KIM e DOYLE, 2010). This approach is based on the fundamentals of quantitative proteomics and uses of liquid chromatography coupled to tandem spectrometric mass (LC-MS/MS) to obtain a highly specific, sensitive and reproducible analysis for quantification of multiple regions of a given protein structure. Here, we established a methodology for total quantification of recombinant FVIII (rFVIII) produced in Sk-Hep-1 human cell line or of plasma derived FVIII (pdFVIII), both used in the treatment of Hemophilia A (HEMA). For that, we adopted a strategy of selection and chemical peptide synthesis of representative peptides of the heavy and light chains of human FVIII, which were used as standards in the analysis. The quantitative MRM method developed here indicated a direct correlation with FVIII quantitative techniques such ELISA, which allows routine application of such approach for rFVIII and pdFVIII quantification.

Neste trabalho foram estudados diversos métodos cromatográficos para a purificação de fatores recombinantes de coagulação VII (FVIIr) e VIII (FVIIIr) derivados de linhagens celulares humanas SK-Hep. O FVIIIr é utilizado para o tratamento da Hemofilia A, enquanto o FVIIr é utilizado para o tratamento da Hemofilia B e também a Hemofilia A. Produzir estes fatores em linhagens celulares humanas faz com os padrões de glicosilação, sulfatação e enovelamento destas proteínas sejam extremamente parecidos com os fatores endógenos produzidos no organismo humano. A purificação do FVIIIr através de técnicas de cromatografia multimodais usando a resina CaptoMMC, afinidade usando a resina FVIIISelect e troca iônica (SP-Sepharose) permitiu obter um produto bastante homogêneo e com perfil de banda (por SDS-PAGE) bem definido que demonstrou a presença esperada das cadeias leve e pesada (o Westen-Blott indicou que os anticorpos comerciais reconheceram a cadeia pesada da molécula estudada). As técnicas permitiram uma alta reprodutibilidade do processo onde sequencias de purificação indicaram o mesmo comportamento de perfis cromatográficos e o processo eliminou 99.5% ± 0,5% de proteínas inespecíficas, recuperando até 64% de FVIIIr. O FVIIr foi purificado com apenas uma única técnica cromatográfica usando a resina FVIISelect que isolou a proteína de interesse eliminando cerca de 99% de impurezas, recuperando praticamente todo o produto. O eluido da cromatografia de afinidade foi dialisado em membranas de 5 kDa o que resultou no processo de auto ativação da molécula de FVIIr, resultando em um aumento de sinal de até 5x em relação a quantidade inicial. O gel de SDS-PAGE e o Westen-Blott comprovaram o processo de auto-ativação no qual uma migração de banda de 50 kDa para 30kDa foi observada e os anticorpos comerciais contra FVII foram capazes de detecta-la. O método de purificação também foi bastante reproduzível e o perfil de banda muito semelhante se comparado ao produto comercial existente no mercado. Sendo assim, foi possível obter plataformas de purificação para as proteínas FVIIr e FVIIIr. / In this work, several chromatographic methods were studied for the purification of recombinant clotting factors VII (FVIIr) and VIII (FVIIIr) derived from human SK-Hep cell lines. The FVIIIr is used for the treatment of Hemophilia A, while the FVIIr is used for the treatment of Hemophilia B and Hemophilia A. Producing these factors in human cell lines results in glycosylation, sulphation and folding patterns similar to the endogenous factors produced in the human organism. Purification of FVIIIr by multimodal chromatography techniques using CaptoMMC resin, affinity using FVIIISelect resin and ion exchange (SP-Sepharose) yielded a fairly homogeneous and well-defined band profile (by SDS-PAGE) which demonstrated the expected presence of the light and heavy chains, Westen-Blott indicated that commercial antibodies recognized the heavy chain of the studied molecule. The techniques allowed a high reproducibility of the process where purification sequences indicated the same behavior of chromatographic profiles and the process eliminated 99.5% ± 0.5% nonspecific proteins and recovering up to 64% FVIIIr. FVIIr was purified with only a single chromatographic technique using the FVIISelect resin which isolated the protein by removing about 99% impurities and recovering virtually the entire product. The affinity chromatography eluate was dialyzed on 5 kDa membranes which resulted in the autoactivation process of the FVIIr molecule resulting in a signal increase of up to 5 fold over the initial amount. The SDS-PAGE gel and Westen-Blott demonstrated the auto-activation process where a migration of 50 kDa to 30 kDa band was observed and the commercial antibodies against FVII were able to detect the band. The purification method was also quite reproducible and the band profile very similar compared to the commercial products. Thus, it was possible to obtain purification platforms for the FVIIr and FVIIIr proteins.

Neste trabalho foram estudados diversos métodos cromatográficos para a purificação de fatores recombinantes de coagulação VII (FVIIr) e VIII (FVIIIr) derivados de linhagens celulares humanas SK-Hep. O FVIIIr é utilizado para o tratamento da Hemofilia A, enquanto o FVIIr é utilizado para o tratamento da Hemofilia B e também a Hemofilia A. Produzir estes fatores em linhagens celulares humanas faz com os padrões de glicosilação, sulfatação e enovelamento destas proteínas sejam extremamente parecidos com os fatores endógenos produzidos no organismo humano. A purificação do FVIIIr através de técnicas de cromatografia multimodais usando a resina CaptoMMC, afinidade usando a resina FVIIISelect e troca iônica (SP-Sepharose) permitiu obter um produto bastante homogêneo e com perfil de banda (por SDS-PAGE) bem definido que demonstrou a presença esperada das cadeias leve e pesada (o Westen-Blott indicou que os anticorpos comerciais reconheceram a cadeia pesada da molécula estudada). As técnicas permitiram uma alta reprodutibilidade do processo onde sequencias de purificação indicaram o mesmo comportamento de perfis cromatográficos e o processo eliminou 99.5% ± 0,5% de proteínas inespecíficas, recuperando até 64% de FVIIIr. O FVIIr foi purificado com apenas uma única técnica cromatográfica usando a resina FVIISelect que isolou a proteína de interesse eliminando cerca de 99% de impurezas, recuperando praticamente todo o produto. O eluido da cromatografia de afinidade foi dialisado em membranas de 5 kDa o que resultou no processo de auto ativação da molécula de FVIIr, resultando em um aumento de sinal de até 5x em relação a quantidade inicial. O gel de SDS-PAGE e o Westen-Blott comprovaram o processo de auto-ativação no qual uma migração de banda de 50 kDa para 30kDa foi observada e os anticorpos comerciais contra FVII foram capazes de detecta-la. O método de purificação também foi bastante reproduzível e o perfil de banda muito semelhante se comparado ao produto comercial existente no mercado. Sendo assim, foi possível obter plataformas de purificação para as proteínas FVIIr e FVIIIr. / In this work, several chromatographic methods were studied for the purification of recombinant clotting factors VII (FVIIr) and VIII (FVIIIr) derived from human SK-Hep cell lines. The FVIIIr is used for the treatment of Hemophilia A, while the FVIIr is used for the treatment of Hemophilia B and Hemophilia A. Producing these factors in human cell lines results in glycosylation, sulphation and folding patterns similar to the endogenous factors produced in the human organism. Purification of FVIIIr by multimodal chromatography techniques using CaptoMMC resin, affinity using FVIIISelect resin and ion exchange (SP-Sepharose) yielded a fairly homogeneous and well-defined band profile (by SDS-PAGE) which demonstrated the expected presence of the light and heavy chains, Westen-Blott indicated that commercial antibodies recognized the heavy chain of the studied molecule. The techniques allowed a high reproducibility of the process where purification sequences indicated the same behavior of chromatographic profiles and the process eliminated 99.5% ± 0.5% nonspecific proteins and recovering up to 64% FVIIIr. FVIIr was purified with only a single chromatographic technique using the FVIISelect resin which isolated the protein by removing about 99% impurities and recovering virtually the entire product. The affinity chromatography eluate was dialyzed on 5 kDa membranes which resulted in the autoactivation process of the FVIIr molecule resulting in a signal increase of up to 5 fold over the initial amount. The SDS-PAGE gel and Westen-Blott demonstrated the auto-activation process where a migration of 50 kDa to 30 kDa band was observed and the commercial antibodies against FVII were able to detect the band. The purification method was also quite reproducible and the band profile very similar compared to the commercial products. Thus, it was possible to obtain purification platforms for the FVIIr and FVIIIr proteins.

A hemofilia A é uma doença ligada ao cromossomo X causada pela deficiência do fator VIII da coagulação sanguínea (FVIII). O tratamento disponível consiste na terapia de reposição da proteína do fator VIII derivada do plasma (FVIIIdp) ou recombinante (FVIIIr). Atualmente, dos 7 produtos recombinantes disponíveis no mercado, 6 são produzidos em linhagens celulares de roedores. A expressão dessa proteína em sistemas celulares não-humanos pode gerar uma molécula com perfil de modificações diferente do endógeno, podendo levar a reações imunogênicas e geração de inibidores anti-FVIIIr. Em função disso, novas estratégias de produção têm sido avaliadas, como a utilização de células hospedeiras mais eficientes no que diz respeito ao potencial de expressão da proteína de interesse. Dentre as linhagens de interesse, a linhagem hepática SK-HEP-1 tem se destacado por apresentar altos níveis de expressão do FVIIIr e potencial para o cultivo em suspensão em meios livres de soro fetal bovino (SFB). Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de FVIIIr na linhagem celular humana SK-Hep-1 comparando duas estratégias para o estabelecimento de processos de produção em condições livres de soro e em suspensão: Estratégia 1 - adaptação para tais condições da linhagem já modificada geneticamente e Estratégia 2 - modificação gênica para a expressão da proteína já em células previamente adaptadas à tais condições. Para a estratégia 1, foram geradas duas linhagens recombinantes produtoras de FVIIIr, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1 aderentes e em cultivos suplementados com SFB. Na caracterização da cinética e produção do FVIIIr as linhagens apresentaram taxas específicas máxima de crescimento (?max) de 0,064 e 0,0031h-1 produzindo 1,0 e 0,78UI/mL de FVIIIr, respectivamente. Diversos protocolos de adaptação foram empregados, entretanto, não foi possível obter sucesso na adaptação das linhagens recombinantes para condições livres de soro e em suspensão. Para a estratégia 2, as células SK-HEP-1 selvagens adaptadas ao meio de cultura livre de SFB SFMII apresentaram um valor de ?max de 0,0186h-1 e Xmax de 1,9x106cels/mL. Para as etapas de modificação gênica da linhagem selvagem foram utilizados os mesmos vetores lentivirais empregados para a geração das células recombinantes aderentes, pLVmpsvFVIII?B-Neo e pLVCMVFVIII?B-GFP. Para o primeiro, não foi possível gerar uma linhagem produtora do FVIIIr. Para o segundo, foi possível obter duas linhagens produtoras do FVIIIr com 0.14 e 0.12IU/mL de atividade pelo ensaio cromogênico. O presente trabalho mostrou que a linhagem humana Sk-Hep-1 é apropriada para a produção de altos níveis de FVIIIr. No entanto, maiores esforços devem ser voltados ao desenvolvimento de meios de cultura livres de soro específicos para a linhagem para possibilitar a produção eficiente do FVIIIr em suspensão em meios livre de soro. / Hemophilia A is a genetic X-linked disorder caused by the coagulation factor VIII (FVIII) deficiency. The current treatment is the replacement therapy with plasma derived FVIII (pdFVIII) or recombinant FVIII (rFVIII) products. Nowadays, of the seven products available in the market, six are produced in rodent expression systems, which can result in a rFVIII molecule with different post-translational modifications and may lead to immune responses to non-human epitopes. Therefore, new production strategies have been evaluated, as the use of more efficient hosts in terms of protein expression potential. Among potential cell lines, the hepatic SK-HEP-1 cell line features high levels of rFVIII production and potential for serum-free suspension culture. In face of the exposed above, the goal of this study was to evaluate rFVIII production in the SK-HEP-1 human cell line comparing two strategies for the establishment of production process in a suspension serum-free condition: strategy 1 - adaptation to these conditions of a genetic modified cell line; strategy 2 - genetic modification of an already adapted cell line to rFVIII protein expression. For strategy 1, two adherent rFVIII producer cell lines were established in serum containing medium, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1. Characterization of cell growth and rFVIII production showed a maximum specific growth rate (?max) of 0.064 and 0.00311h-1 with rFVIII production of 1.0 and 0.78UI/mL, respectively. Different adaptation protocols were used; however, it was not possible to adapt the recombinant cell lines to growth in suspension serum-free conditions. For strategy 2, the wildtype SK-HEP-1 cell line adapted growth in SFMII BSF medium, showed a ?max of 0.0186h-1 and a maximum cell concentration (Xmax) of 1.9x106cells/mL. For the genetic modification, it were employed the same lentiviral vectors used for the recombinant adherent cells generation, pLVmpsvFVIII?B-Neo and pLVCMVFVIII?B-GFP. For the first, no attempts were successful. For the second, it was possible to generate two rFVIII producer populations with 0.14 and 0.12IU/mL activity, measured by chromogenic assay. These results demonstrate that the SK-HEP-1 cell line is appropriate for the production of high levels of rFVIII. Nevertheless, efforts should be made in developing specific medium to support efficient rFVIII production in suspension and suspension serum-free conditions.

A hemofilia A é uma doença ligada ao cromossomo X causada pela deficiência do fator VIII da coagulação sanguínea (FVIII). O tratamento disponível consiste na terapia de reposição da proteína do fator VIII derivada do plasma (FVIIIdp) ou recombinante (FVIIIr). Atualmente, dos 7 produtos recombinantes disponíveis no mercado, 6 são produzidos em linhagens celulares de roedores. A expressão dessa proteína em sistemas celulares não-humanos pode gerar uma molécula com perfil de modificações diferente do endógeno, podendo levar a reações imunogênicas e geração de inibidores anti-FVIIIr. Em função disso, novas estratégias de produção têm sido avaliadas, como a utilização de células hospedeiras mais eficientes no que diz respeito ao potencial de expressão da proteína de interesse. Dentre as linhagens de interesse, a linhagem hepática SK-HEP-1 tem se destacado por apresentar altos níveis de expressão do FVIIIr e potencial para o cultivo em suspensão em meios livres de soro fetal bovino (SFB). Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de FVIIIr na linhagem celular humana SK-Hep-1 comparando duas estratégias para o estabelecimento de processos de produção em condições livres de soro e em suspensão: Estratégia 1 - adaptação para tais condições da linhagem já modificada geneticamente e Estratégia 2 - modificação gênica para a expressão da proteína já em células previamente adaptadas à tais condições. Para a estratégia 1, foram geradas duas linhagens recombinantes produtoras de FVIIIr, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1 aderentes e em cultivos suplementados com SFB. Na caracterização da cinética e produção do FVIIIr as linhagens apresentaram taxas específicas máxima de crescimento (?max) de 0,064 e 0,0031h-1 produzindo 1,0 e 0,78UI/mL de FVIIIr, respectivamente. Diversos protocolos de adaptação foram empregados, entretanto, não foi possível obter sucesso na adaptação das linhagens recombinantes para condições livres de soro e em suspensão. Para a estratégia 2, as células SK-HEP-1 selvagens adaptadas ao meio de cultura livre de SFB SFMII apresentaram um valor de ?max de 0,0186h-1 e Xmax de 1,9x106cels/mL. Para as etapas de modificação gênica da linhagem selvagem foram utilizados os mesmos vetores lentivirais empregados para a geração das células recombinantes aderentes, pLVmpsvFVIII?B-Neo e pLVCMVFVIII?B-GFP. Para o primeiro, não foi possível gerar uma linhagem produtora do FVIIIr. Para o segundo, foi possível obter duas linhagens produtoras do FVIIIr com 0.14 e 0.12IU/mL de atividade pelo ensaio cromogênico. O presente trabalho mostrou que a linhagem humana Sk-Hep-1 é apropriada para a produção de altos níveis de FVIIIr. No entanto, maiores esforços devem ser voltados ao desenvolvimento de meios de cultura livres de soro específicos para a linhagem para possibilitar a produção eficiente do FVIIIr em suspensão em meios livre de soro. / Hemophilia A is a genetic X-linked disorder caused by the coagulation factor VIII (FVIII) deficiency. The current treatment is the replacement therapy with plasma derived FVIII (pdFVIII) or recombinant FVIII (rFVIII) products. Nowadays, of the seven products available in the market, six are produced in rodent expression systems, which can result in a rFVIII molecule with different post-translational modifications and may lead to immune responses to non-human epitopes. Therefore, new production strategies have been evaluated, as the use of more efficient hosts in terms of protein expression potential. Among potential cell lines, the hepatic SK-HEP-1 cell line features high levels of rFVIII production and potential for serum-free suspension culture. In face of the exposed above, the goal of this study was to evaluate rFVIII production in the SK-HEP-1 human cell line comparing two strategies for the establishment of production process in a suspension serum-free condition: strategy 1 - adaptation to these conditions of a genetic modified cell line; strategy 2 - genetic modification of an already adapted cell line to rFVIII protein expression. For strategy 1, two adherent rFVIII producer cell lines were established in serum containing medium, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1. Characterization of cell growth and rFVIII production showed a maximum specific growth rate (?max) of 0.064 and 0.00311h-1 with rFVIII production of 1.0 and 0.78UI/mL, respectively. Different adaptation protocols were used; however, it was not possible to adapt the recombinant cell lines to growth in suspension serum-free conditions. For strategy 2, the wildtype SK-HEP-1 cell line adapted growth in SFMII BSF medium, showed a ?max of 0.0186h-1 and a maximum cell concentration (Xmax) of 1.9x106cells/mL. For the genetic modification, it were employed the same lentiviral vectors used for the recombinant adherent cells generation, pLVmpsvFVIII?B-Neo and pLVCMVFVIII?B-GFP. For the first, no attempts were successful. For the second, it was possible to generate two rFVIII producer populations with 0.14 and 0.12IU/mL activity, measured by chromogenic assay. These results demonstrate that the SK-HEP-1 cell line is appropriate for the production of high levels of rFVIII. Nevertheless, efforts should be made in developing specific medium to support efficient rFVIII production in suspension and suspension serum-free conditions.