Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-03Bitstream added on 2015-04-09T12:47:20Z : No. of bitstreams: 1 000809805.pdf: 1812121 bytes, checksum: 46978417cc590a6b8d7c98caac024da7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O Cole latent virus (CoLV) é um fitovírus cuja principal hospedeira é a couve comum. Pertence ao gênero Carlavirus, que é constituído por vírus que infectam diversos grupos de plantas, incluindo aquelas de grande importância econômica no mundo, como a batata, a soja, o amendoim e o milho. O Pepper ringspot virus (PepRSV) foi descrito no Brasil no início dos anos 60, sendo caracterizado como integrante do gênero Tobravirus, podendo causar danos a culturas como tomate e pimentão. Até o momento, o ciclo de vida desses vírus não é completamente conhecido. Sabe-se que algumas proteínas virais são essenciais na infecção. Dentre estas, a proteína capsidial (CP), a do movimento (MP) e a helicase (HEL) que ainda não possuem estruturas definidas. Desta forma, o trabalho teve como objetivo analisar a estrutura da proteína capsidial do Cole latent virus (CP-CoLV); da proteína do movimento do Pepper ringspot vírus (MP-PepRSV) e de um fragmento da helicase do Pepper ringspot virus (HEL-PepRSV). Vetores de expressão, contendo as sequências de interesse, foram transformados. Nos testes de indução de expressão a 37°C observou-se a formação de corpos de inclusão para as três proteínas em questão. Após lavagem dos corpos de inclusão, as proteínas purificadas foram reenoveladas e concentradas. Após reenovelamento, a CP-CoLV e a MP-PepRSV foram analisadas por dicroísmo circular para verificar o seu conteúdo de estrutura secundária. Essa análise confirmou a eficiência do processo de reenovelamento. A CP-CoLV também foi analisada por espalhamento dinâmico de luz, para estimar a distribuição de tamanho das populações de partículas que estão presentes na solução. Os dados do espalhamento dinâmico de luz mostraram que a proteína encontra-se estável e monodispersa. Dessa forma, dentre as proteínas estudadas, a CPCoLV apresentou melhores condições para os testes de cristalização. Através da expressão a 18°C, ... / The Cole latent virus is a plant virus which infects mainly the common cole. It is a member of Carlavirus genus, which contains viruses that infect several plant groups, including those of great economic importance worldwide, as potato, soy, peanut and corn. The Pepper ringspot virus was first described during the 60’s in Brazil. It is characterized as member of Tobravirus genus and it can damage to cultures as tomato and pepper. Until now, the viral life cycle is not completely elucidated. It is known that some viral proteins are essential for infection, including the capsid protein (CP), movement protein (MP) and helicase (HEL). Those proteins do not have the structure determined, yet. Therefore, this work aimed the structural study of the capsid protein of Cole latent virus (CP-CoLV); movement protein of Pepper ringspot virus (MPPepRSV) and a helicase fragment of Pepper ringspot virus (HEL-PepRSV). Expression vectors containing sequences of interest were transformed Tests for protein expression at 37°C resulted in formation of inclusion bodies for the three tested proteins. The proteins present in inclusion bodies were solubilized and purified under denaturing conditions. The purified proteins were refolding by dialysis and concentrated. After refolding CoLV-CP and MP-PepRSV were analyzed by circular dichroism to check its secondary structure content. This analysis confirmed the refolding efficiency. The CP-CoLV was also analyzed by Dynamic Light Scattering to estimate the size distribution of particle populations which are present in the solution. The data of the dynamic light scattering showed that the protein is stable and monodisperse. Thus, among the proteins studied, the CP-CoLV showed better conditions for crystallization trials. When expressed at 18°C, it was possible to obtain the CP -CoLV in its native state. The protein was purified under non-denaturing and analyzed by infra-red spectroscopy. Using homology molecular ...

Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Banca: Andréia Estela Moreira de Souza / Banca: Priscila Belintani / Banca: Anwar Ullah / Banca: José Ramon Beltran Abrego / Resumo: O Cole latent virus (CoLV) é um fitovírus cuja principal hospedeira é a couve comum. Pertence ao gênero Carlavirus, que é constituído por vírus que infectam diversos grupos de plantas, incluindo aquelas de grande importância econômica no mundo, como a batata, a soja, o amendoim e o milho. O Pepper ringspot virus (PepRSV) foi descrito no Brasil no início dos anos 60, sendo caracterizado como integrante do gênero Tobravirus, podendo causar danos a culturas como tomate e pimentão. Até o momento, o ciclo de vida desses vírus não é completamente conhecido. Sabe-se que algumas proteínas virais são essenciais na infecção. Dentre estas, a proteína capsidial (CP), a do movimento (MP) e a helicase (HEL) que ainda não possuem estruturas definidas. Desta forma, o trabalho teve como objetivo analisar a estrutura da proteína capsidial do Cole latent virus (CP-CoLV); da proteína do movimento do Pepper ringspot vírus (MP-PepRSV) e de um fragmento da helicase do Pepper ringspot virus (HEL-PepRSV). Vetores de expressão, contendo as sequências de interesse, foram transformados. Nos testes de indução de expressão a 37°C observou-se a formação de corpos de inclusão para as três proteínas em questão. Após lavagem dos corpos de inclusão, as proteínas purificadas foram reenoveladas e concentradas. Após reenovelamento, a CP-CoLV e a MP-PepRSV foram analisadas por dicroísmo circular para verificar o seu conteúdo de estrutura secundária. Essa análise confirmou a eficiência do processo de reenovelamento. A CP-CoLV também foi analisada por espalhamento dinâmico de luz, para estimar a distribuição de tamanho das populações de partículas que estão presentes na solução. Os dados do espalhamento dinâmico de luz mostraram que a proteína encontra-se estável e monodispersa. Dessa forma, dentre as proteínas estudadas, a CPCoLV apresentou melhores condições para os testes de cristalização. Através da expressão a 18°C, ... / Abstract: The Cole latent virus is a plant virus which infects mainly the common cole. It is a member of Carlavirus genus, which contains viruses that infect several plant groups, including those of great economic importance worldwide, as potato, soy, peanut and corn. The Pepper ringspot virus was first described during the 60's in Brazil. It is characterized as member of Tobravirus genus and it can damage to cultures as tomato and pepper. Until now, the viral life cycle is not completely elucidated. It is known that some viral proteins are essential for infection, including the capsid protein (CP), movement protein (MP) and helicase (HEL). Those proteins do not have the structure determined, yet. Therefore, this work aimed the structural study of the capsid protein of Cole latent virus (CP-CoLV); movement protein of Pepper ringspot virus (MPPepRSV) and a helicase fragment of Pepper ringspot virus (HEL-PepRSV). Expression vectors containing sequences of interest were transformed Tests for protein expression at 37°C resulted in formation of inclusion bodies for the three tested proteins. The proteins present in inclusion bodies were solubilized and purified under denaturing conditions. The purified proteins were refolding by dialysis and concentrated. After refolding CoLV-CP and MP-PepRSV were analyzed by circular dichroism to check its secondary structure content. This analysis confirmed the refolding efficiency. The CP-CoLV was also analyzed by Dynamic Light Scattering to estimate the size distribution of particle populations which are present in the solution. The data of the dynamic light scattering showed that the protein is stable and monodisperse. Thus, among the proteins studied, the CP-CoLV showed better conditions for crystallization trials. When expressed at 18°C, it was possible to obtain the CP -CoLV in its native state. The protein was purified under non-denaturing and analyzed by infra-red spectroscopy. Using homology molecular ... / Doutor

Orientador: Ana Carolina de Mattos Zeri / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T00:57:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nogueira_MariaLuizaCaldas_M.pdf: 8261820 bytes, checksum: 7c9ed2193fd77623b3a8beea794eb743 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A mTOR é uma via de sinalização muito conservada que controla o crescimento celular em resposta à presença de nutrientes e fatores de crescimento. A desregulação dessa via em humanos está relacionada a doenças como câncer e diabetes. A quinase TOR é ativada na presença de aminoácidos e recentemente descobriu-se que as pequenas GTPases da família Rag são mediadoras da sinalização por Leucina. Essas GTPases são ancoradas na superfície do lisossomo por meio da interação com um complexo de três proteínas denominado Ragulator. Esse complexo também ancora um braço da via das MAPKs (MEK-ERK) aos lisossomos. O entendimento deste complexo pode nos ajudar a elucidar doenças em que a via da mTOR se encontra desregulada. Neste trabalho obtivemos o complexo Ragulator, através da expressão da proteína p18 em corpos de inclusão e sua renaturação através da adição de suas parceiras Mp1/p14 à diálise. Foram realizados estudos biofísicos com a intenção de caracterização do complexo, entretanto o alto grau de dissociação do mesmo resultou em certa dificuldade para caracterizá-lo completamente. Neste trabalho caracterizamos os agregados formados pela p18 e conseguimos reduzir sua formação através de diálise contendo agente redutor e suas proteínas parceiras. A renaturação da p18 na presença de MP1/p14 favoreceu seu rendimento, indicando a interação entre estas proteínas, porém não foi possível estabilizar o complexo Ragulator O estudo da divisão bacteriana é centralmente dependente de FtsZ, um homólogo procariótico das tubulinas. FtsZ desencadeia a divisão ao formar o "anel Z", uma estrutura supramolecular constituída por polímeros de FtsZ que circunda o interior da célula e funciona como arcabouço do aparato de divisão. A formação do anel Z é regulada por moduladores, proteínas que afetam tanto negativamente como positivamente a capacidade de FtsZ polimerizar-se. A proteína MinC é um inibidor da polimerização de FtsZ, recrutada por MinD para a face interna da membrana plasmática, onde o complexo MinCD exerce sua função. MinCD representa um inibidor sítio-específico da polimerização da FtsZ, previnindo a formação do anel Z nos pólos das células mas permitindo que isto aconteça na região central. A elucidação deste processo seria de grande valia para o desenho racional de inibidores da divisão bacteriana. Neste trabalho, comprovamos a interação entre MinC e FtsZ por Ressonância Magnética Nuclear. Estes proteínas não se encontravam em sua forma monomérica e o alto peso molecular do complexo impossibilitou a identificação dos aminoácidos envolvidos nesta interação, devido a limites da técnica 15NHSQC. No momento, a proteína MinC está sendo expressa em presença de deutério, o que aumenta significativamente o limite da técnica de 15NHSQC. Foram realizados ainda estudos biofísicos com intuito de caracterização da interação / Abstract: The mTOR signaling pathway is a very well conserved pathway that controls cell growth in response to the presence of nutrients and growth factors. Deregulation of this pathway in humans is related to diseases like cancer and diabetes. The TOR kinase is activated in the presence of amino acids and it was recently discovered that the Rag small GTPases family are mediators of signaling by Leucine. These GTPases are anchored on the surface of the lysosome through interactions with a complex of three proteins called Ragulator. This complex also anchors an arm of the pathway of MAPKs (MEK-ERK) to lysosomes. Understanding this can help us to elucidate complex diseases in which the mTOR pathway is upregulated. In this work, the Ragulator complex was obtained through the expression of p18 protein in inclusion bodies and their refolding by adding their partners MP1/p14 to dialysis. Biophysical studies were conducted with the intention of characterizing the complex, however its high degree of dissociation resulted in some difficulty to characterize it completely. In this work we characterized the aggregates formed by p18 and managed reduce its formation by dialysis containing reducing agent and its partner proteins. The p18 renatuation with MP1/p14 improve its yield, indicating interaction among these proteins, however the Ragulator complex wasn't stabilized. The study of bacterial division is centrally dependent on FtsZ, a prokaryotic homologue of tubulin. FtsZ triggers the division to form the "Z ring", a supramolecular structure consisting in FtsZ polymers that surrounds the cell and acts as a frame of the division apparatus. The formation of the Z ring is regulated by modulators, proteins that affect both negatively and positively the ability of FtsZ to polymerize. The MinC protein is an inhibitor of FtsZ polymerization, recruits MinD to the inner surface of the plasma membrane, where the complex MinCD exerts its function. MinCD is an inhibitor of site-specific polymerization of FtsZ, preventing the formation of the Z ring at the poles of the cells but allowing this to happen in the central region. The elucidation of this process would be invaluable for the rational design of bacterial division inhibitors. In this work, we confirmed the interaction between MinC and FtsZ by Nuclear Magnetic Resonance. These proteins were not in their monomeric form and the high molecular weight of the complex prevented the identification of the amino acids involved in this interaction, due to limitations of the 15NHSQC technology. At present, the MinC protein is being expressed in the presence of deuterium, which significantly increases the limit of this technique 15NHSQC. Biophysical studies were also performed with the aim of characterizing the interaction / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular