En la presente Tesis Doctoral se muestra el estudio de la proteína Ankyrin repeat and kinase domain containing 1 (ANKK1) en el linaje miogénico durante el desarrollo y en la edad adulta. El gen ANKK1 ha sido ampliamente relacionado con trastornos neuropsiquiátricos y endofenotipos dopaminérgicos en el cerebro. Sin embargo, la función de su proteína es todavía desconocida. La localización del gen ANKK1 en un clúster genómico conservado a lo largo de la evolución que podría estar implicado en neurogénesis, y la expresión de su proteína en progenitores neurales y su relación con el ciclo celular, han relacionado este gen con el neurodesarrollo. ANKK1 pertenece a la familia Receptor-Interacting Proteins (RIP), cuyos miembros participan en la diferenciación de diversos tejidos, incluyendo el muscular. La observación de ANKK1 en miotúbulos embrionarios murinos nos llevó a plantearnos la hipótesis de la posible participación de esta proteína en el origen, el desarrollo y la regeneración muscular. Nuestros resultados muestran que ANKK1 es una proteína que participa en la biología muscular. Se localiza en precursores miogénicos durante el desarrollo embrionario murino y en las células satélite del músculo adulto. Además, los estudios in vitro utilizando mioblastos murinos y humanos muestran un patrón específico de la dinámica de sus isoformas: las isoformas ANKK1 quinasa (ANKK1-k) y ANKK1 completa (ANKK1-fl) se expresan en mioblastos y células satélite (SCs) quiescentes, mientras que sólo ANKK1-fl está presente en miotúbulos y SCs activadas. El transporte núcleo-citoplasmático de ANKK1 en mioblastos durante la diferenciación temprana se bloquea mediante la adición de leptomicina B, lo que indica que su salida del núcleo está mediada por exportinas. En el músculo adulto ANKK1 se expresa en las fibras de contracción rápida tipo II de metabolismo glicolítico. La activación de la vía glicolítica en mioblastos murinos incrementa la expresión de Ankk1. Todo ello confirma la relación entre la expresión de ANKK1 y el metabolismo glicolítico y explica la localización específica de la proteína en fibras musculares de contracción rápida. También se ha investigado la localización de ANKK1 en músculos de pacientes con diferentes distrofias musculares. Los mioblastos de pacientes con Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) presentan una expresión alterada de ANKK1. La disminución de ANKK1 nuclear en estos mioblastos se asocia con un estadio celular más indiferenciado, definido por el incremento de expresión de PAX7. Paralelamente, en biopsias procedentes de pacientes con diferentes distrofias musculares, la expresión de ANKK1 se asocia con poblaciones celulares regenerativas, es decir, SCs y fibras regenerativas. En cuanto al estudio de su función, se ha investigado la participación de ANKK1 en el ciclo celular. La sobreexpresión de las variantes polimórficas de ANKK1 (A1-A2) en células HeLa incrementa la velocidad de progresión del ciclo celular, mientras que la sobreexpresión de la isoforma catalíticamente inactiva (K51R) la disminuye. En todos los casos, el porcentaje de células que alcanza la mitosis está reducido. Todo esto indica que la expresión de ANKK1 afecta tanto a la progresión del ciclo celular como al número de células que completan el ciclo. Finalmente, hemos estudiado la actividad quinasa de ANKK1. En las condiciones estudiadas, no se ha detectado esta actividad in vitro. Sin embargo, dado que es una RIP quinasa y su dominio quinasa es homólogo al resto de los miembros de la familia RIP, no podemos descartar que ANKK1 presente dicha actividad. En resumen, este Tesis Doctoral muestra por primera vez la participación de la proteína ANKK1 en la biología muscular desde el desarrollo embrionario hasta el músculo del adulto. Sin duda, ANKK1 es una proteína candidata a ser estudiada como biomarcador de enfermedad muscular. / The present Doctoral Thesis shows the study of the Ankyrin repeat and kinase domain containing 1 (ANKK1) protein in the myogenic lineage during development and in adulthood. The ANKK1 gene has been widely related to neuropsychiatric disorders and dopaminergic endophenotypes in the brain. However, the function of its protein is still unknown. The location of ANKK1 gene in a genomic cluster conserved throughout the evolution thay may be involved in neurogenesis, and the expression of its protein in neural progenitors and its relationship with the cell cycle, have linked ANKK1 gene to neurodevelopment. ANKK1 belongs to the Receptor-Interacting Proteins family (RIP), whose members participate in the differentiation of several tissues, including muscle tissue. The finding of the location of ANKK1 in murine embryonic myotubes led us to consider the hypothesis of the possible participation of this protein in muscles origin, development and regeneration. Our results show that ANKK1 is a protein that participates in muscle biology. It is located in myogenic precursors during murine embryonic development and in adult muscle satellite cells. In addition, in vitro studies using murine and human myoblasts show a specific pattern of the dynamics of its isoforms: the isoforms ANKK1 kinase (ANKK1-k) and ANKK1 full-length (ANKK1-fl) are expressed in myoblasts and quiescent satellite cells (SCs), whereas only ANKK1-fl is present in myotubes and activated SCs. The nuclear-cytoplasmic shuttle of ANKK1 in myoblasts during early differentiation is blocked by the addition of leptomycin B, which indicates that its exit from the nucleus is mediated by exportins. In the adult muscle ANKK1 is expressed in the Fast-Twitch muscle fibers type II with glycolytic metabolism. The activation of the glycolytic pathway in murine myoblasts increases Ankk1 expression. All this confirms the relationship between the expression of ANKK1 and the glycolytic metabolism and explains the specific location of the protein in Fast-twitch muscle fibers. The location of ANKK1 in the muscles of patients with different muscular dystrophies has also been investigated. The myoblasts of patients with Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) present an altered expression of ANKK1. The decrease in nuclear ANKK1 in these myoblasts is associated with a more undifferentiated cell stage, defined by the increase in the expression of PAX7. In parallel, in biopsies from patients with different muscular dystrophies, the expression of ANKK1 is associated with regenerative cell populations, that is to say, SCs and regenerating fibers. Regarding the study of its function, we have investigated the participation of ANKK1 in the cell cycle. The overexpression of the polymorphic variants of ANKK1 (A1-A2) in HeLa cells increases the rate of progression of the cell cycle, while overexpression of the catalytically inactive isoform (K51R) decreases it. In all cases, the percentage of cells that reach mitosis is reduced. All this indicates that the expression of ANKK1 affects both the progression of the cell cycle and the number of cells that complete the cycle. Finally, we have studied the kinase activity of ANKK1. Under the conditions studied, this activity has not been detected in vitro. However, given that it is a RIP kinase and its kinase domain is homologous to the rest of the members of the RIP family, we cannot rule out that ANKK1 does not present this activity. In summary, this Doctoral Thesis shows for the first time the participation of the ANKK1 protein in muscle biology from embryonic development to adult muscle. Thus, we propose ANKK1 as a candidate protein to be studied as a biomarker of muscular disease. / En la present tesi doctoral es mostra l'estudi de la proteïna Ankyrin repeat and kinase domain containing 1 (ANKK1) en el llinatge miogènic durant el desenvolupament i en l'edat adulta. El gen ANKK1 ha estat àmpliament relacionat amb trastorns neuropsiquiàtrics i endofenotips dopaminèrgics en el cervell. No obstant això, la funció de la seua proteïna és encara desconeguda. La localització del gen ANKK1 en un clúster genòmic conservat al llarg de l'evolució que podria estar implicat en neurogènesi, i l'expressió de la seua proteïna en progenitors neurals i la seua relació amb el cicle cel¿lular, han relacionat aquest gen amb el neurodesenvolupament. ANKK1 pertany a la família Receptor-interacting Proteins (RIP), els membres de la qual participen en la diferenciació de diversos teixits incloent el muscular. L'observació d'ANKK1 en miotúbuls embrionaris murins ens va portar a plantejar-nos la hipòtesi de la possible participació d'aquesta proteïna en l'origen, el desenvolupament i la regeneració muscular. Els nostres resultats mostren que ANKK1 és una proteïna que participa en la biologia muscular. Es localitza en precursors miogènics durant el desenvolupament embrionari murí i en les cèl¿lules satèl¿lit del múscul adult. A més, els estudis in vitro utilitzant mioblasts murins i humans mostren un patró específic de la dinàmica de les seues isoformes: les isoformes ANKK1 quinasa (ANKK1-k) i ANKK1 completa (ANKK1-fl) s'expressen en mioblasts i cèl¿lules satèl¿lit (SCs) quiescents, mentre que només ANKK1-fl està present en miotúbuls i SCs activades. El transport nucli-citoplasmàtic d'ANKK1 a mioblasts durant la diferenciació primerenca es bloqueja mitjançant l'addició de leptomicina B, el que indica que la seua eixida del nucli està mediada per exportines. En el múscul adult ANKK1 s'expressa en les fibres de contracció ràpida tipus II de metabolisme glicolític. L'activació de la via glicolítica en mioblasts murins incrementa l'expressió d'Ankk1. Tot això confirma la relació entre l'expressió d'ANKK1 i el metabolisme glicolític i explica la localització específica de la proteïna en fibres musculars de contracció ràpida. També s'ha investigat la localització d'ANKK1 en músculs de pacients amb diferents distròfies musculars. Els mioblasts de pacients amb distròfia muscular de Duchenne (DMD) presenten una expressió alterada d'ANKK1. La disminució d'ANKK1 nuclear en aquests mioblasts s'associa amb un estadi cel¿lular més indiferenciat, definit per l'increment d'expressió de PAX7. Paral¿lelament, en biòpsies procedents de pacients amb diferents distròfies musculars, l'expressió d'ANKK1 s'associa amb poblacions cel¿lulars regeneratives, és a dir, SCs i fibres regeneratives. En quant a l'estudi de la seua funció, s'ha investigat la participació d'ANKK1 en el cicle cel¿lular. La sobreexpressió de les variants polimòrfiques d'ANKK1 (A1-A2) en cèl¿lules HeLa incrementa la velocitat de progressió del cicle cel¿lular, mentre que la sobreexpressió de la isoforma catalíticament inactiva (K51R) la disminueix. En tots els casos, el percentatge de cèl¿lules que arriba a la mitosi està reduït. Tot això indica que l'expressió d'ANKK1 afecta tant la progressió del cicle cel¿lular com al nombre de cèl¿lules que completen el cicle. Finalment, hem estudiat l'activitat quinasa d'ANKK1. En les condicions estudiades, no s'ha detectat aquesta activitat in vitro. No obstant això, atès que és una RIP quinasa i el seu domini quinasa és homòleg a la resta dels membres de la família RIP, no podem descartar que ANKK1 presente aquesta activitat. En resum, aquesta tesi doctoral mostra per primera vegada la participació de la proteïna ANKK1 en la biologia muscular des del desenvolupament embrionari fins al múscul de l'adult. Sens dubte, ANKK1 és una proteïna candidata a ser estudiada com a biomarcador de malaltia muscular. / Rubio Solsona, E. (2018). ESTUDIO DE LA PROTEÍNA ANKK1 EN LA FIBRA MUSCULAR: IMPLICACIONES EN DISTROFIAS MUSCULARES [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/100850 / TESIS

Tesis por compendio / [ES] El sistema musculoesquelético tiene una capacidad de regeneración limitada. Las pérdidas importantes de tejido no se pueden regenerar, lo que provoca necrosis y deterioro funcional. Los tratamientos tradicionales basados en implantes o trasplantes no han demostrado ser del todo exitosos, con múltiples efectos secundarios como inmunogenicidad o rechazos. Por ello, es muy importante desarrollar nuevas alternativas para tratar la degeneración muscular. La ingeniería tisular combina biomateriales, células y agentes bioactivos para desarrollar constructos biológicos biocompatibles donde las células encuentran un entorno que imita sus condiciones in vivo para crecer, proliferar y diferenciarse en tejido muscular y restaurar su funcionalidad. Los biomateriales conductores son de particular interés en tejidos electro-sensibles como es el caso del sistema musculoesquelético. Se ha demostrado que los polímeros conductores (polipirrol, polianilina, etc.), los materiales de carbono (grafeno, óxido de grafeno reducido, etc.) y los nanomateriales metálicos mejoran la diferenciación muscular, incluso sin estimulación eléctrica externa. Además, diferentes moléculas bioactivas como factores de crecimiento (FGF-2, IGF-1, etc.) o iones inorgánicos "terapéuticos" (zinc, magnesio, etc.) son alternativas para potenciar la diferenciación celular en diferentes tejidos. Por lo tanto, la combinación de biomateriales conductores y moléculas bioactivas para mejorar la regeneración muscular representa una gran oportunidad en la ingeniería de tejidos musculares. El objetivo de este proyecto de tesis es desarrollar y caracterizar nuevos biomateriales electroactivos con diferentes composiciones, estructuras y propiedades y evaluar su potencial para tratar la regeneración musculoesquelética, así como la combinación de estos biomateriales electroactivos con iones inorgánicos buscando descubrir nuevas sinergias biomateriales conductores-iones terapéuticos en términos de diferenciación muscular. ¿ / [CA] El sistema musculoesquelètic té una capacitat de regeneració limitada. Les pèrdues importants de teixit no es poden regenerar, cosa que provoca necrosi i deteriorament de la funcionalitat. Els tractaments tradicionals basats en implants o trasplantaments no han demostrat ser del tot exitosos, amb múltiples efectes secundaris com ara immunogenicitat o rebutjos. Per això, és molt important desenvolupar noves alternatives per tractar la degeneració muscular. L'enginyeria tissular combina biomaterials, cèl·lules i agents bioactius per desenvolupar constructes biològics biocompatibles on les cèl·lules troben un entorn que imita les seves condicions in vivo per créixer, proliferar i diferenciar-se en teixit muscular i restaurar-ne la funcionalitat. Els biomaterials conductors són de particular interès en teixits electrosensibles com és el cas del sistema musculoesquelètic. S'ha demostrat que els polímers conductors (polipirrol, polianilina, etc.), els materials de carboni (grafè, òxid de grafè reduït, etc.) i els nanomaterials metàl·lics milloren la diferenciació muscular, fins i tot sense estimulació elèctrica externa. A més, diferents molècules bioactives com a factors de creixement (FGF-2, IGF-1, etc.) o ions inorgànics "terapèutics" (zinc, magnesi, etc.) són alternatives per potenciar la diferenciació cel·lular en diferents teixits. Per tant, la combinació de biomaterials conductors i molècules bioactives per millorar la regeneració muscular representa una gran oportunitat a l'enginyeria de teixits musculars. L'objectiu d'aquest projecte de tesi és desenvolupar i caracteritzar nous biomaterials electroactius amb diferents composicions, estructures i propietats i avaluar-ne el potencial per tractar la regeneració musculoesquelètica, així com la combinació d'aquests biomaterials electroactius amb ions inorgànics buscant descobrir noves sinergies biomaterials conductors-ions terapèutics en termes de diferenciació muscular. / [EN] The musculoskeletal system can self-regenerate in a limited way. Major tissue losses cannot be regenerated, resulting in necrosis and functional impairment. Traditional treatments based on implants or transplants have not proven to be completely successful, with multiple side effects such as immunogenicity or rejections. Therefore, it is very important to develop new alternatives to treat muscle degeneration. Tissue engineering combines biomaterials, cells and bioactive agents to develop biological and biocompatible constructs where cells find an in vivo likely environment to grow, proliferate and differentiate into muscle tissue and restore its functionality. Conductive biomaterials are of particular interest in electrosensitive tissues such as the musculoskeletal system. Conductive polymers (polypyrrole, polyaniline, etc.), carbon materials (graphene, reduced graphene oxide, etc.) and metal nanomaterials have proved to enhance cell differentiation, even without external electrical stimulation. Moreover, different bioactive molecules such as growth factors (FGF-2, IGF-1, etc.) or inorganic "therapeutic" ions (zinc, magnesium, etc.) are alternatives to enhance cell differentiation into different tissues. Therefore, the combination of conductive biomaterials and bioactive molecules to enhance muscle regeneration represents an exciting opportunity in muscle tissue engineering. This thesis project aims to develop and characterize novel electroactive biomaterials with different compositions, structures and properties and evaluate their potential to treat musculoskeletal regeneration, as well as its combination with inorganic ions looking forward to discovering new conductive biomaterial-therapeutic ions synergies in terms of muscle differentiation. / Gracias a la financiación del Ministerio de Ciencia e Innovación, a la Agencia Estatal de Investigación y a los fondos FEDER por la financiación del proyecto RTI2018- 097862-B-C21 que ha permitido llevar a cabo esta tesis doctoral. / Aparicio Collado, JL. (2023). Development of Novel Biomimetic Electroactive Environments with Bioactive Molecules for Musculoskeletal Regeneration [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/195233 / Compendio