Made available in DSpace on 2015-11-04T13:36:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 leandro_alves_ioc_mest_2014.pdf: 112755376 bytes, checksum: b2de2958661b65ce907ca9c107efa88b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Existem diversas doenças crônico degenerativas que afetam diretamente a capacidade contrátil e força muscular da musculatura esquelética e/ou cardíaca, sejam elas doenças de cunho inflamatório ou genético. Dentre elas, podemos destacar as distrofias musculares e a miopatias inflamatórias (MI), que além da fraqueza progressiva e perda da resistência dos músculos esqueléticos, exibem importante infiltração inflamatória. A infiltração inflamatória gera danos secundários ao tecido muscular, agravando a doença com a perda da força muscular. A histopatologia do músculo lesionado é caracterizada pela presença de células inflamatórias, tais como linfócitos T, macrófagos e células dendríticas (DC). Em diversas MI, as DC são encontradas circundando fibras musculares lesionadas ou não ou mesmo invadindo fibras necróticas e não necróticas. Esta propriedade ilustra a importância da interação entre as DC e as células musculares e que exercem potencial papel na progressão das doenças musculares degenerativas. Além disso, as DC são células chave na indução da resposta imune adaptativa assim como na integração das respostas inata e específica. Entretanto a interação existente entre as DC e os mioblastos, células responsáveis pela regeneração do tecido muscular, ainda não foi claramente determinada. O objetivo desse estudo é, portanto, determinar se há interação entre as DC e mioblastos, e também que alterações morfológicas e funcionais ocorre nos mioblastos após a interação Para responder o objetivo do trabalho realizamos co-cultivos in vitro de mioblastos e DC. Para tal utilizamos DC imaturas (iDC), cultivadas apenas com meio de cultura, e DC ativadas (actDC), cultivadas ativadas por LPS. Por microscopia de luz e eletrônica observamos que as iDC e actDC aderem aos mioblastos, principalmente às actDC. Nós observamos por microscopia óptica e eletrônica que as DC aderem firmemente aos mioblastos nos estágios de proliferação e diferenciação. No estágio de diferenciação, o co-cultivo com iDC e actDC observamos que as miofibras formadas foram mais finas e desorganizadas, principalmente com actDC. Além disso também observamos a diminuição na formação de miotubos e diminuição na de myoD e miogenina, com diferenças mais pronunciadas no co-cultivo com actDC. No estágio de proliferação o cocultivo com iDC e actDC aumentou a marcação de mioblastos BrdU+, principalmente no co-cultivo com actDC. A expressão de fibronectina, caderina e laminina no co-cultivo não foi alterado. Entretanto no estágio de diferenciação, observamos por imunofluorescência, que a marcação para aactinina, b-catenina e laminina não foi alterada. Fato interessante foi a indoleamina 2,3 dioxigenase (IDO), uma enzima que degrada o aminoácido triptofano e promove imunotolerância foi observada marcação nos mioblastos. Quando realizamos o co-cultivo, principalmente com actDC, houve aumento na expressão de IDO nas células musculares tanto no estágio de proliferação como no de diferenciação. Analisamos que houve diminuição na capacidade de migração dos mioblastos no cocultivo com iDC e actDC, e que a diferença é pronunciada com actDC. Por fim, houve aumento na liberação de citocinas e aumento na expressão de HLA-ABC e HLA-DR no co-cultivo com actDC. Nos dados sugerem que o co-cultivo de DC e mioblastos alteram os mioblastos e que essa mudança indica uma contribuição das DC na evolução das MI / There are several chronic degenerative diseases that are either inflammatory diseases or genetic diseases which directly affect the contractile capacity and muscle strength in skeletal muscle and / or the heart. It is possible to highlight the muscular dystrophies and inflammatory myopathies (IM), which have clinical symptoms such as progressive weakness and loss of skeletal muscle strength and the exhibition of significant inflammatory infiltration. Inflammatory infiltration generates secondary muscle tissue damage and exacerbates the progression of the disease and muscle weakness. The sick muscle histopathology is characterized by the presence of inflammatory cells such as T lymphocytes, macrophages and dendritic cells (DC). In several IM, DC are found surrounding or even invading necrotic and non-necrotic muscle fibers and this facet illustrates the importance of the interaction between the aforementioned cells and the potential in the progression of degenerative muscle diseases. Furthermore, DC cells are key for the induction of the adaptive immune response as well as the integration of innate and specific responses. However the interaction between DCs and myoblasts, the cells which are responsible for muscle tissue regeneration, has not been clearly determined. Therefore, the aim of this study is to determine whether there is interaction between DCs and myoblasts and also any morphological and functional changes that occur in the myoblasts as a result of the interaction. In order to answer our question, we designed an in vitro co-culture of myoblasts plus DCs. We used immature DCs (iDC) cultured with medium only and activated DCs (actDC) cultured with medium and LPS. We observed by optical and electron microscopy that DCs have a tight adhesion with myoblasts in the proliferation or differentiation phases. Upon the co-culturing of iDC and actDC in the differentiation phase, we observed that the myofibers formed were thinner and more disorganized, especially in the actDC co-culture. In addition, we also observed a decrease in myotube formation, and a decrease in myoD and myogenin expression in the co-cultures of iDC and actDC. Furthermore, the aforementioned decreases in formation and expression were more pronounced in the actDC co-culture. During myoblast proliferation the co-culturing of iDC and actDC increased the staining in myoblasts for BrdU, especially in myoblasts from the actDC co-culture. In addition, the expression of fibronectin, cadherin and laminin in the co-cultures did not change. However, during myoblast differentiation, we observed via immunoflourescence that the staining of α-actinin, β-catenin, and laminin was unaltered in the different co-cultures. Interestingly, indoleamine 2,3 dioxigenase (IDO), an enzyme that degrades the essential amino acid tryptophan and promotes immune tolerance, was found to be expressed in myoblasts. Moreover, this expression was increased during co-culture, in both the proliferation and differentiation phases. We also analyzed the myoblasts migration ability and observed that myoblast migration is decreased during co-culture. The decrease in migration was greater in the actDC co-culture than the iDC. Finally, there was a greater release of cytokines and increased expression of HLA-ABC and HLA-DR in the co-culture with actDC. In conclusion, our data suggests that the use of co-culture changes the myoblast profile and indicates that DCs can contribute to IM evolution.

Doenças cardiovasculares estão intimamente relacionadas ao estresse oxidativo, o qual leva à produção aumentada de espécies reativas do oxigênio e nitrogênio (ERO e ERN), e o acúmulo destas pode representar uma perturbação no estado de equilíbrio entre pró-oxidantes/antioxidantes. Este cenário está relacionado com o desenvolvimento de inúmeras doenças. Por isso, estimular o aumento das defesas antioxidantes é uma estratégia eficaz na redução dano oxidativo. Desta forma, o uso do pterostilbeno, um polifenol encontrado em frutas pretas (tal como mirtilo), pode ser uma relevante estratégia de intervenção terapêutica a ser considerada. Os estilbenos apresentam a capacidade de aumentar as defesas antioxidantes, reduzindo, dessa maneira, ação deletéria das ERO. Assim, o objetivo deste trabalho foi analisar o efeito protetor de diferentes concentrações de pterostilbeno em cultura de mioblastos cardíacos (células H9c2) e tecido cardíaco in vitro submetidos ao a dano oxidativo. Mioblastos cardíacos foram submetidas à incubação com diferentes doses de pterostilbeno (curva de dose: 50, 100 e 150 μM), 24 horas antes da indução ao dano oxidativo por peróxido de hidrogênio (H2O2 - 6,67μM), durante 10 min. O estudo foi desenvolvido com três grupos distintos para células em cultura: G1– somente cultura de células H9c2 com meio DMEM; G2 - cultura de células H9c2 submetidas ao dano oxidativo induzido pelo H2O2; G3 - cultura de células H9c2 somente com incubação de pterostilbeno (50 μM) e dano oxidativo induzido pelo H2O2. Já o tecido cardíaco foi homogeneizado e pré-incubado com pterostilbeno (25 e 50 μM) pelo período de 1 h, e submetido ao dano oxidativo por um sistema gerador de radical hidroxil (solução contendo FeCl2, ácido ascórbico e H2O2) durante 30 minutos. Os grupos foram alocados em: G1- homogeneizado de tecido sem intervenção (grupo Controle); G2 – homogeneizado de tecido com pterostilbeno (25 μM); G3 - homogeneizado de tecido com pterostilbeno (50 μM); G4 – Grupo submetido apenas ao dano oxidativo por meio do sistema gerador de radical hidroxil; G5 - grupo com pterostilbeno 25 μM associado ao dano oxidativo; G6 - grupo com pterostilbeno 50 μM associado ao dano oxidativo. A viabilidade celular dos mioblastos em cultura foi avaliada por meio do ensaio de MTT. Os marcadores de estresse oxidativo foram avaliados pela dosagem de carbonilas, lipoperoxidação por TBA-RS e níveis de EROs totais. Atividade das enzimas antioxidantes (superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase) e níveis totais de sulfidrilas foram mensurados em ambos os experimentos. Foi observado que os modelos de dano oxidativo induzido em ambas as condições experimentais foram efetivos, pois estes causaram redução da viabilidade celular dos mioblastos cardíacos, assim como aumentando os níveis de EROs, carbonilas e lipoperoxidação no tecido cardíaco in vitro. Adicionalmente, foi constatado aumento na atividade da catalase, nas células em cultura como resposta contra regulatória ao estresse. Entretanto, no homogeneizado cardíaco houve redução na atividade da catalase e da glutationa peroxidase, nos grupos submetidos ao estresse. Por outro lado, o pterostilbeno foi efetivo na indução da atividade da superóxido dismutase no tecido cardíaco, assim como na redução dos níveis de EROs totais após incubação com o sistema gerador de radical hidroxil. Tomados em conjunto, os dados sugerem que o pterostilbeno sem associação com estresse, demonstrou ação benéfica. A substância, entretanto, mostrou efeitos distintos em células e tecido submetidos ao estresse oxidativo. Dessa maneira, são necessários mais estudos, como estudos in vivo, a fim de aumentar a complexidade do sistema e entender a substância de forma plena, visto que os marcadores antioxidantes que aumentaram no experimento celular e tecidual não foram os mesmos.

Doenças cardiovasculares estão intimamente relacionadas ao estresse oxidativo, o qual leva à produção aumentada de espécies reativas do oxigênio e nitrogênio (ERO e ERN), e o acúmulo destas pode representar uma perturbação no estado de equilíbrio entre pró-oxidantes/antioxidantes. Este cenário está relacionado com o desenvolvimento de inúmeras doenças. Por isso, estimular o aumento das defesas antioxidantes é uma estratégia eficaz na redução dano oxidativo. Desta forma, o uso do pterostilbeno, um polifenol encontrado em frutas pretas (tal como mirtilo), pode ser uma relevante estratégia de intervenção terapêutica a ser considerada. Os estilbenos apresentam a capacidade de aumentar as defesas antioxidantes, reduzindo, dessa maneira, ação deletéria das ERO. Assim, o objetivo deste trabalho foi analisar o efeito protetor de diferentes concentrações de pterostilbeno em cultura de mioblastos cardíacos (células H9c2) e tecido cardíaco in vitro submetidos ao a dano oxidativo. Mioblastos cardíacos foram submetidas à incubação com diferentes doses de pterostilbeno (curva de dose: 50, 100 e 150 μM), 24 horas antes da indução ao dano oxidativo por peróxido de hidrogênio (H2O2 - 6,67μM), durante 10 min. O estudo foi desenvolvido com três grupos distintos para células em cultura: G1– somente cultura de células H9c2 com meio DMEM; G2 - cultura de células H9c2 submetidas ao dano oxidativo induzido pelo H2O2; G3 - cultura de células H9c2 somente com incubação de pterostilbeno (50 μM) e dano oxidativo induzido pelo H2O2. Já o tecido cardíaco foi homogeneizado e pré-incubado com pterostilbeno (25 e 50 μM) pelo período de 1 h, e submetido ao dano oxidativo por um sistema gerador de radical hidroxil (solução contendo FeCl2, ácido ascórbico e H2O2) durante 30 minutos. Os grupos foram alocados em: G1- homogeneizado de tecido sem intervenção (grupo Controle); G2 – homogeneizado de tecido com pterostilbeno (25 μM); G3 - homogeneizado de tecido com pterostilbeno (50 μM); G4 – Grupo submetido apenas ao dano oxidativo por meio do sistema gerador de radical hidroxil; G5 - grupo com pterostilbeno 25 μM associado ao dano oxidativo; G6 - grupo com pterostilbeno 50 μM associado ao dano oxidativo. A viabilidade celular dos mioblastos em cultura foi avaliada por meio do ensaio de MTT. Os marcadores de estresse oxidativo foram avaliados pela dosagem de carbonilas, lipoperoxidação por TBA-RS e níveis de EROs totais. Atividade das enzimas antioxidantes (superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase) e níveis totais de sulfidrilas foram mensurados em ambos os experimentos. Foi observado que os modelos de dano oxidativo induzido em ambas as condições experimentais foram efetivos, pois estes causaram redução da viabilidade celular dos mioblastos cardíacos, assim como aumentando os níveis de EROs, carbonilas e lipoperoxidação no tecido cardíaco in vitro. Adicionalmente, foi constatado aumento na atividade da catalase, nas células em cultura como resposta contra regulatória ao estresse. Entretanto, no homogeneizado cardíaco houve redução na atividade da catalase e da glutationa peroxidase, nos grupos submetidos ao estresse. Por outro lado, o pterostilbeno foi efetivo na indução da atividade da superóxido dismutase no tecido cardíaco, assim como na redução dos níveis de EROs totais após incubação com o sistema gerador de radical hidroxil. Tomados em conjunto, os dados sugerem que o pterostilbeno sem associação com estresse, demonstrou ação benéfica. A substância, entretanto, mostrou efeitos distintos em células e tecido submetidos ao estresse oxidativo. Dessa maneira, são necessários mais estudos, como estudos in vivo, a fim de aumentar a complexidade do sistema e entender a substância de forma plena, visto que os marcadores antioxidantes que aumentaram no experimento celular e tecidual não foram os mesmos.

Doenças cardiovasculares estão intimamente relacionadas ao estresse oxidativo, o qual leva à produção aumentada de espécies reativas do oxigênio e nitrogênio (ERO e ERN), e o acúmulo destas pode representar uma perturbação no estado de equilíbrio entre pró-oxidantes/antioxidantes. Este cenário está relacionado com o desenvolvimento de inúmeras doenças. Por isso, estimular o aumento das defesas antioxidantes é uma estratégia eficaz na redução dano oxidativo. Desta forma, o uso do pterostilbeno, um polifenol encontrado em frutas pretas (tal como mirtilo), pode ser uma relevante estratégia de intervenção terapêutica a ser considerada. Os estilbenos apresentam a capacidade de aumentar as defesas antioxidantes, reduzindo, dessa maneira, ação deletéria das ERO. Assim, o objetivo deste trabalho foi analisar o efeito protetor de diferentes concentrações de pterostilbeno em cultura de mioblastos cardíacos (células H9c2) e tecido cardíaco in vitro submetidos ao a dano oxidativo. Mioblastos cardíacos foram submetidas à incubação com diferentes doses de pterostilbeno (curva de dose: 50, 100 e 150 μM), 24 horas antes da indução ao dano oxidativo por peróxido de hidrogênio (H2O2 - 6,67μM), durante 10 min. O estudo foi desenvolvido com três grupos distintos para células em cultura: G1– somente cultura de células H9c2 com meio DMEM; G2 - cultura de células H9c2 submetidas ao dano oxidativo induzido pelo H2O2; G3 - cultura de células H9c2 somente com incubação de pterostilbeno (50 μM) e dano oxidativo induzido pelo H2O2. Já o tecido cardíaco foi homogeneizado e pré-incubado com pterostilbeno (25 e 50 μM) pelo período de 1 h, e submetido ao dano oxidativo por um sistema gerador de radical hidroxil (solução contendo FeCl2, ácido ascórbico e H2O2) durante 30 minutos. Os grupos foram alocados em: G1- homogeneizado de tecido sem intervenção (grupo Controle); G2 – homogeneizado de tecido com pterostilbeno (25 μM); G3 - homogeneizado de tecido com pterostilbeno (50 μM); G4 – Grupo submetido apenas ao dano oxidativo por meio do sistema gerador de radical hidroxil; G5 - grupo com pterostilbeno 25 μM associado ao dano oxidativo; G6 - grupo com pterostilbeno 50 μM associado ao dano oxidativo. A viabilidade celular dos mioblastos em cultura foi avaliada por meio do ensaio de MTT. Os marcadores de estresse oxidativo foram avaliados pela dosagem de carbonilas, lipoperoxidação por TBA-RS e níveis de EROs totais. Atividade das enzimas antioxidantes (superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase) e níveis totais de sulfidrilas foram mensurados em ambos os experimentos. Foi observado que os modelos de dano oxidativo induzido em ambas as condições experimentais foram efetivos, pois estes causaram redução da viabilidade celular dos mioblastos cardíacos, assim como aumentando os níveis de EROs, carbonilas e lipoperoxidação no tecido cardíaco in vitro. Adicionalmente, foi constatado aumento na atividade da catalase, nas células em cultura como resposta contra regulatória ao estresse. Entretanto, no homogeneizado cardíaco houve redução na atividade da catalase e da glutationa peroxidase, nos grupos submetidos ao estresse. Por outro lado, o pterostilbeno foi efetivo na indução da atividade da superóxido dismutase no tecido cardíaco, assim como na redução dos níveis de EROs totais após incubação com o sistema gerador de radical hidroxil. Tomados em conjunto, os dados sugerem que o pterostilbeno sem associação com estresse, demonstrou ação benéfica. A substância, entretanto, mostrou efeitos distintos em células e tecido submetidos ao estresse oxidativo. Dessa maneira, são necessários mais estudos, como estudos in vivo, a fim de aumentar a complexidade do sistema e entender a substância de forma plena, visto que os marcadores antioxidantes que aumentaram no experimento celular e tecidual não foram os mesmos.

Mitochondria are central players in cell metabolism, responsible for the vast majority of ATP production in most cells. Although originally thought to be passive organelles focused only in keeping cellular ATP at adequate levels, complex interplay between mitochondrial function and cell signaling has been largely recognized over the last decades. Not surprisingly, given their role, changes in nutritional status promoted by chronic interventions like caloric restriction or short-term situations like fasting in animals or nutrient deprivation in cultured cells are one of the main factors that can activate those signaling mechanisms. One particular way in which this mitochondria-cell crosstalk can occur is through mitochondrial Ca2+ handling, a process in which Ca2+ signals generated by the cell are able to translate into elevations in mitochondrial matrix [Ca2+] due to the presence of the mitochondrial Ca2+ uniporter in the organelle. While the impact of mitochondrial Ca2+ handling on cellular function has been widely studied, the conditions which can modulate the process of mitochondrial Ca2+ handling itself are still not well characterized. In this work, we sought to test the effects of different interventions linked to nutritional status on mitochondrial Ca2+ handling. We found that caloric restriction, physiological fasting and modulations of mitochondrial dynamics resulted in modulation of mitochondrial Ca2+ handling through changes in their maximal Ca2+ retention capacity or Ca2+ uptake rates. These changes were, measured by following mitochondrial Ca2+ uptake using different strategies, employing the fluorescent Ca2+ probe Ca2+ Green 5N for experiments in isolated mitochondria and permeabilized cells and the cytosolic probe Fura2-AM in intact cells. Caloric restriction resulted in higher calcium uptake and retention in liver mitochondria, protecting against pathological conditions of Ca2+ overload during ischemia/reperfusion. On the other hand, overnight and short term fasting resulted in lower mitochondrial Ca2+ retention and oxidative phosphorylation capacity in the liver. Modulating mitochondrial morpholoy in C2C12 myoblasts showed that more fragmented mitochondria were less capable of taking up Ca2+, while more fusioned mitochondria showed the opposite phenotype. This modulation in Ca2+ handling through changes in mitochondrial morphology interfered with the process of Store-Operated Ca2+ entry in the cells, showing that these modulations can have impacts in physiological contexts as well. Overall, this work both establishes novel mechanisms of modulation of mitochondrial Ca2+ handling and demonstrates their relevance both in pathology and normal cellular physiology. / Mitocôndrias possuem um papel central no metabolismo das células, sendo responsáveis pela maioria da produção de ATP na maioria dos tipos celulares. Embora originalmente se pensasse nas mitocôndrias como organelas estáticas, focadas somente em manter os níveis adequados de ATP na célula, a interação entre a função mitocondrial e a sinalização celular tem sido fortemente reconhecida nas ultimas décadas. Dado este papel, não é surpreendente que mudanças no estado nutricional, tanto crônicas como na restrição calórica quanto em situações como o jejum em animais e a privação de nutrientes em cultura de células foram demonstradas como sendo um dos principais fatores que podem ativar estes mecanismos de sinalização. Uma das formas em que esta interação entre a mitocôndria e a célula ocorre é através do manejo de Ca2+ mitocondrial, um processo em que sinais de Ca2+ gerados pela célula podem resultar em aumentos na [Ca2+] na matriz mitocondrial devido à presença do uniportador de Ca2+ mitocondrial na organelaEmbora o impacto do manejo de Ca2+ mitocondrial na função da célula tenha sido amplamente estudado, a regulação do processo de manejo de Ca2+ mitocondrial em si não é bem conhecida. Neste trabalho, nós nos propusemos a testar os efeitos de diferentes intervenções ligadas ao estado nutricional no manejo de Ca2+ mitocondrial e o possível impacto destas modulações nacapacidade de retenção e na taxa de captação de Ca2+ mitochondrial. As intervenções estudadas foram a restrição calórica, jejum e mudanças na dinâmica mitocondrial, e todas elas resultando em mudanças no manejo de Ca2+ mitocondrial, que foram medidos acompanhando a captação de Ca2+ em mitocôndrias isoladas ou células permeabilizadas utilizando a sonda Ca2+ Green 5N e em células intactas utilizando a sonda de Ca2+ citosólica Fura2-AM. Enquanto a restrição calórica resultou em uma maior capacidade de retenção de Ca2+ e em maiores taxas de captação, protegendo contra as condições patológicas de desregulação de Ca2+ observadas durante a isquemia/reperfusão, o jejum curto ou pela duração da noite resultou em uma diminuição na capacidade de retenção de Ca2+ e na oxidação fosforilativa mitocondriais. As mudanças observadas modulando a dinâmica mitocôndria (feitas utilizando-se mioblastos da linhagem C2C12) revelaram que mitocôndrias mais fragmentadas são menos capazes de captar Ca2+, enquanto mitocôndrias mais fusionadas possuem o fenótipo oposto. Essas mudanças no manejo de Ca2+ mitocondrial interferem com o processo de Store-Operated Ca2+ entry nestas células, demonstrando que essas modulações da captação de Ca2+ mitocondrial também podem ser relevantes em contextos fisiológicos. Em resumo, este trabalho ajudou a estabelecer novos mecanismos de modulação do manejo de Ca2+ mitocondrial que podem ser relevantes tanto em condições patológicas quanto na fisiologia normal das células.

A leishmaniose é um grupo de doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania com três manifestações clínicas principais: cutânea, mucocutânea e visceral. No Brasil, a leishmaniose é um importante problema de saúde pública pela alta incidência. O ciclo de vida da Leishmania envolve dois estágios principais de desenvolvimento, o promastigota que está presente no vetor, e o amastigota que é intracelular obrigatório do hospedeiro vertebrado. Este protozoário apresenta um alto grau de promiscuidade em quanto ao tipo de célula hospedeira, já que consegue infectar várias células do sistema imune como neutrófilos, macrófagos e células dendríticas, e também células não fagocíticas profissionais. Além disso, Leishmania pode infectar fibras musculares, como tem sido reportado em trabalhos prévios por meio de analises histológicas. Porém, as características da infecção por Leishmania no músculo têm sido pouco estudadas, o que permitiria estabelecer a importância destas células durante a infecção. O objetivo deste projeto foi avaliar as características biológicas da infecção por promastigotas de L. (L.) amazonensis em células musculares esqueléticas (SkMCs). Para atingir isso, camundongos C57BL/6 e BALB/c foram infectados nas patas traseiras, o musculo Flexor Digitorum Brevis (FDB) foi extraído e processado para coloração com hematoxilina/eosina ou imunohistoquímica. Culturas de SkMCs como mioblastos e miotubos foram infectadas com promastigotas metacíclicos de L. (L.) amazonensis por 72h. As infecções foram caracterizadas por meio de imunofluorescência indireta e microscopia confocal. As culturas de SkMCs foram caracterizadas e padronizadas por médio das proteínas Caveolina-1 e Caveolina-3, também foi medido o Ph dos vacúolos parasitóforos de mioblastos e miotubos com laranja de acridina (AO). Adicionalmente, culturas de SkMCs como miotubos foram pré-tratadas com Streptolisina O (SLO) e/ou infectadas com promastigotas metacíclicos de L. (L.) amazonensis por 72h, com o intuito de esclarecer como ocorre a entrada do parasito nas células musculares. Neste caso foi avaliada a produção de IL-1&#946;, IL-6, IL-10 e NO. Além disso, foi quantificado o mRNA de IL1&#946;, IL-6, iNOS, Ama2, UbH e Lyst. A infecção de células mostrou que L. (L.) amazonensis consegue infectar as fibras musculares in vivo, e também as células musculares esqueléticas (mioblastos e miotubos) in vitro. Além disso, o teste de viabilidade mostrou que L. (L.) amazonensis permanece viável dentro do vacúolo parasitóforo após 72h de infecção. Finalmente, foi observado que o tratamento com SLO pode favorecer a entrada do parasito nas SkMCs, como foi evidenciado pelas diferencias no nível de mRNA entre as células infectadas ou infectadas e tratadas com SLO. Os dados em conjunto sugerem que L. (L.) amazonensis tem a capacidade de infectar as células musculares esqueléticas, dado que consegue entrar nestas células, e permanecer viável dentro do vacúolo parasitóforo. A presença do parasito dentro das células induz uma resposta imune no músculo que pode estar relacionada com os processos de reparo do tecido. A entrada de L. (L.) amazonensis nas células musculares esqueléticas durante a infecção no hospedeiro mamífero é importante devido a sua capacidade de manter o parasito viável. / Leishmaniasis is a group of diseases caused by parasites from genus Leishmania. The main clinical manifestations are cutaneous, mucocutaneus and visceral leishmaniasis. In Brazil, leishmaniasis is an important public health problem because of the high incidence. The Leishmania life cycle has two principal developing stages: promastigote inside the insect vector, and amastigote, an obligate intracellular parasite of vertebrate-host cells. This protozoan is highly promiscuous in host cell type, because it infects different immune cells like neutrophils, macrophages and dendritic cells, and also non-professional phagocytes. Besides, Leishmania might infect muscle fibers, as previous studies suggested from histological analysis. However, the characteristics of Leishmania infection in muscle cells is poorly understood, which is important to understand the role of these cells during the infection. The aim of this study was to characterize the infection process by promastigotes of <i.>L. (L.) amazonensis in skeletal muscle cells (SkMCs). C57BL/6 and BALB/c mice were infected in hind footpads, the Flexor Digitorum Brevis (FDB) muscle was extracted and process to dyed with hematoxylin/eosin or immunohistochemistry. SkMCs as myoblasts and myotubes were infected with metaciclic promastigotes of L. (L.) amazonensis during 72h. The infections were characterized using indirect immunofluorescence and confocal microscopy. SkMCs culture were characterized and standardized through Caveolin-1 and Caveolin-3 proteins, and the pH of parasitophorous vacuoles both in myoblasts and myotubes was measured through acridine orange staining. In order to assess how the parasite invades the cells, myotubes were pretreated with SLO and/or infected with metaciclic promastigotes of L. (L.) amazonensis for 72h. The production of IL-1&#946;, IL-6, IL-10 and NO was quantified, and the mRNA levels of IL-1&#946;, IL-6, iNOS, Ama2, UbH and Lyst. The cell infection showed that L. (L.) amazonensis can infect muscle fibers in vivo, and skeletal muscle cells in vitro. Moreover, viability test showed the parasite remains viable inside the parasitophorous vacuole until 72h of infection. Finally, the SLO treatment can favor parasite entrance in SkMCs, as evidenced by differences in mRNA levels between infected cells or infected and treated with SLO. All data suggest that L. (L.) amazonensis can infect skeletal muscle cells, by entering into the cells, and remaining viable inside the parasitophorous vacuole. The parasite presence inside the muscle cells triggers an immune response that may be related with muscle repair processes. The entrance of L. (L.) amazonensis into SkMCs during infection in a mammal host is important because it contribute with parasite proliferation.

As E3 ligases MuRF1 e MuRF2 tem sido descritas com importantes papéis na estabilidade de proteínas da estrutura muscular, além de contribuírem para marcação de proteínas que devem ser degradadas. Nosso objetivo foi verificar o papel de MuRF1 e MuRF2 na diferenciação de células miogênicas, além de caracterizar seu papel em fibroblastos. Foram utilizados animais nocautes para MuRF1 e MuRF2 e verificamos o processo de regeneração 28 dias após a injeção de cardiotoxina no tibial anterior. Posteriormente, através de análises in vitro, realizamos o silenciamento de MuRF1 e MuRF2 utilizando RNAis e verificamos a capacidade de diferenciação de células miogênicas. Os resultados mostram que os animais nocautes apresentaram aumento de marcadores adipogênicos. Além disso, as células silenciadas com RNAis apresentaram queda na formação de miotubos e um aumento em marcadores adipogênicos. Em fibroblastos, identificamos as E3 ligases MuRF1 e MuRF2 e o RNAi nessas células prejudicou o processo de migração. Esses resultados realçam a importância de MuRF1 e MuRF2 na diferenciação miogênica além de sugerir um importante papel para a formação correta do citoesqueleto durante a migração celular. / The E3 ligases MuRF1 and MuRF2 has been proposed to act as a linker for myofibril machinery, also by acting as an Atrogene during muscle wasting. Our aim was to verify the role of MuRF1 and MuRF2 during the myogenic differentiation of skeletal muscle and its role on skeletal muscle fibroblasts. We used MuRF1 and MuRF2 knockout mice and analyzed the regenerative process. Using in vitro analyzes, we silenced MuRF1 and MuRF2 expression by siRNA. Our results suggest that knockout mice had an important impairment on skeletal muscle regeneration, showing positive staining to white adipocytes. Moreover, siRNA on myogenic primary cultures showed impaired myotube formation and increase the expression of adipogenic markers. Another interesting finding was that skeletal muscle fibroblasts can express MuRF1 and MuRF2, and its silencing by siRNA impairs the migration capacity of fibroblasts. These results demonstrate the importance of MuRF1 and MuRF2 during myogenic differentiation of skeletal muscle and an important role at intracellular coordination of stress fiber formation of skeletal muscle fibroblasts.

A leishmaniose é um grupo de doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania com três manifestações clínicas principais: cutânea, mucocutânea e visceral. No Brasil, a leishmaniose é um importante problema de saúde pública pela alta incidência. O ciclo de vida da Leishmania envolve dois estágios principais de desenvolvimento, o promastigota que está presente no vetor, e o amastigota que é intracelular obrigatório do hospedeiro vertebrado. Este protozoário apresenta um alto grau de promiscuidade em quanto ao tipo de célula hospedeira, já que consegue infectar várias células do sistema imune como neutrófilos, macrófagos e células dendríticas, e também células não fagocíticas profissionais. Além disso, Leishmania pode infectar fibras musculares, como tem sido reportado em trabalhos prévios por meio de analises histológicas. Porém, as características da infecção por Leishmania no músculo têm sido pouco estudadas, o que permitiria estabelecer a importância destas células durante a infecção. O objetivo deste projeto foi avaliar as características biológicas da infecção por promastigotas de L. (L.) amazonensis em células musculares esqueléticas (SkMCs). Para atingir isso, camundongos C57BL/6 e BALB/c foram infectados nas patas traseiras, o musculo Flexor Digitorum Brevis (FDB) foi extraído e processado para coloração com hematoxilina/eosina ou imunohistoquímica. Culturas de SkMCs como mioblastos e miotubos foram infectadas com promastigotas metacíclicos de L. (L.) amazonensis por 72h. As infecções foram caracterizadas por meio de imunofluorescência indireta e microscopia confocal. As culturas de SkMCs foram caracterizadas e padronizadas por médio das proteínas Caveolina-1 e Caveolina-3, também foi medido o Ph dos vacúolos parasitóforos de mioblastos e miotubos com laranja de acridina (AO). Adicionalmente, culturas de SkMCs como miotubos foram pré-tratadas com Streptolisina O (SLO) e/ou infectadas com promastigotas metacíclicos de L. (L.) amazonensis por 72h, com o intuito de esclarecer como ocorre a entrada do parasito nas células musculares. Neste caso foi avaliada a produção de IL-1&#946;, IL-6, IL-10 e NO. Além disso, foi quantificado o mRNA de IL1&#946;, IL-6, iNOS, Ama2, UbH e Lyst. A infecção de células mostrou que L. (L.) amazonensis consegue infectar as fibras musculares in vivo, e também as células musculares esqueléticas (mioblastos e miotubos) in vitro. Além disso, o teste de viabilidade mostrou que L. (L.) amazonensis permanece viável dentro do vacúolo parasitóforo após 72h de infecção. Finalmente, foi observado que o tratamento com SLO pode favorecer a entrada do parasito nas SkMCs, como foi evidenciado pelas diferencias no nível de mRNA entre as células infectadas ou infectadas e tratadas com SLO. Os dados em conjunto sugerem que L. (L.) amazonensis tem a capacidade de infectar as células musculares esqueléticas, dado que consegue entrar nestas células, e permanecer viável dentro do vacúolo parasitóforo. A presença do parasito dentro das células induz uma resposta imune no músculo que pode estar relacionada com os processos de reparo do tecido. A entrada de L. (L.) amazonensis nas células musculares esqueléticas durante a infecção no hospedeiro mamífero é importante devido a sua capacidade de manter o parasito viável. / Leishmaniasis is a group of diseases caused by parasites from genus Leishmania. The main clinical manifestations are cutaneous, mucocutaneus and visceral leishmaniasis. In Brazil, leishmaniasis is an important public health problem because of the high incidence. The Leishmania life cycle has two principal developing stages: promastigote inside the insect vector, and amastigote, an obligate intracellular parasite of vertebrate-host cells. This protozoan is highly promiscuous in host cell type, because it infects different immune cells like neutrophils, macrophages and dendritic cells, and also non-professional phagocytes. Besides, Leishmania might infect muscle fibers, as previous studies suggested from histological analysis. However, the characteristics of Leishmania infection in muscle cells is poorly understood, which is important to understand the role of these cells during the infection. The aim of this study was to characterize the infection process by promastigotes of <i.>L. (L.) amazonensis in skeletal muscle cells (SkMCs). C57BL/6 and BALB/c mice were infected in hind footpads, the Flexor Digitorum Brevis (FDB) muscle was extracted and process to dyed with hematoxylin/eosin or immunohistochemistry. SkMCs as myoblasts and myotubes were infected with metaciclic promastigotes of L. (L.) amazonensis during 72h. The infections were characterized using indirect immunofluorescence and confocal microscopy. SkMCs culture were characterized and standardized through Caveolin-1 and Caveolin-3 proteins, and the pH of parasitophorous vacuoles both in myoblasts and myotubes was measured through acridine orange staining. In order to assess how the parasite invades the cells, myotubes were pretreated with SLO and/or infected with metaciclic promastigotes of L. (L.) amazonensis for 72h. The production of IL-1&#946;, IL-6, IL-10 and NO was quantified, and the mRNA levels of IL-1&#946;, IL-6, iNOS, Ama2, UbH and Lyst. The cell infection showed that L. (L.) amazonensis can infect muscle fibers in vivo, and skeletal muscle cells in vitro. Moreover, viability test showed the parasite remains viable inside the parasitophorous vacuole until 72h of infection. Finally, the SLO treatment can favor parasite entrance in SkMCs, as evidenced by differences in mRNA levels between infected cells or infected and treated with SLO. All data suggest that L. (L.) amazonensis can infect skeletal muscle cells, by entering into the cells, and remaining viable inside the parasitophorous vacuole. The parasite presence inside the muscle cells triggers an immune response that may be related with muscle repair processes. The entrance of L. (L.) amazonensis into SkMCs during infection in a mammal host is important because it contribute with parasite proliferation.

Introdução: O remodelamento cardíaco patológico é um processo complexo que ocorre no coração após dano, com eventos de morte celular, hipertrofia, fibrose e inflamação que favorecem a progressão para a insuficiência cardíaca. Envolvido na patogênese do remodelamento cardíaco está o estresse oxidativo, onde espécies reativas de oxigênio (ERO) podem modular vias de sinalização relacionadas com sobrevivência e morte celular. O aumento das defesas antioxidantes é uma estratégia eficaz na redução dano oxidativo, atenuando a progressão do remodelamento cardíaco patológico. O uso do sulforafano (SFN), um isotiocianato encontrado em vegetais crucíferos (ex. broto de brócolis), pode ser uma estratégia de intervenção. Este tem capacidade de aumentar as defesas antioxidantes e as proteínas detoxificadoras intracelulares, por sua ação sobre fatores de transcrição intracelulares, como Nrf-2 e PGC-1α, os quais aumentam a expressão das defesas antioxidantes citoplasmáticas e mitocondriais, tal como a heme oxigenase-1 (HO-1). Objetivos: Estudar o efeito do sulforafano como um agente estimulador das defesas antioxidantes endógenas em células cardíacas em cultura, assim como no coração em processo de remodelamento após infarto do miocárdio. Neste contexto, enfocar a relação do estresse oxidativo com a modulação de vias de sinalização para a sobrevivência e morte celular, assim como do processo de autofagia. Materiais e Métodos: Mioblastos cardíacos (H9c2) foram incubados com R-sulforafano (5 μmol/L), durante 24 horas. A viabilidade celular, os marcadores de estresse oxidativo e as proteínas relacionadas com a via intrínseca da apoptose foram investigados. No modelo de infarto do miocárdio, ratos Wistar machos foram divididos em quatro grupos: SHAM, SHAM + sulforafano (SHAM+SFN), infarto (MI), infarto + sulforafano (MI+SFN). Os grupos SHAM+SFN e MI+SFN receberam R-S-sulforafano (5 mg/Kg/dia, i.p.), durante 25 dias. Análise ecocadiográfica, conteúdo total de colágeno, análises bioquímicas e moleculares de marcadores de estresse oxidativo, via de sinalização para sobrevivência e morte celular, proteínas envolvidas no processo apoptótico e autofágico foram realizadas. Resultados: Células tratadas com SFN apresentaram elevação da viabilidade quando comparadas às células controle. O sulforafano aumentou a atividade das defesas antioxidantes da SOD (103%), catalase (101%) e GST (72%), assim como a expressão da HO-1 (400%) e reduziu o estresse oxidativo observado pela diminuição das EROs (15%) e da peroxidacão lipídica (65%). Somado a isso, a via associada com apoptose intrínseca reduziu, pois aumentou a expressão da proteína anti-apoptótica Bcl-2, reduzindo a razão Bax/Bcl-2, a atividade da caspase 3/7 reduziu, assim como os níveis de fosforilação da JNK. Essas respostas foram associadas com aumento da expressão do co-fator de transcrição PGC-1α (42%). Foi observado que os grupos MI e MI+SFN apresentaram disfunção cardíaca e remodelamemto patológico. No entanto, o SFN atenuou a progressão do remodelamento cardíaco no grupo MI+SFN, observada pela manutenção do índice de estresse de parede em níveis controle, redução da fibrose intersticial e preservação da musculatura cardíaca. Somado a isso, o tratamento com SFN reduziu a deterioração da função cardíaca observada pela manutenção das dilatações da câmara ventricular esquerda e dos índices de contratilidade (fração de ejeção e mudança da área fracional), quando comparados os dados ecocardiográficos do 3º dia com o 28 º dia pós-cirúrgico. O grupo MI apresentou maiores níveis de peroxidação lipídica e elevação das defesas antioxidantes (GPx, CuZn-SOD). Por outro lado, o grupo MI+SFN apresentou redução das EROs e elevação da proteína HO-1, sem mostrar elevação da peroxidação lipídica. Além disso, o grupo MI apresentou elevação da fosforilação das MAPKs ERK 1/2 e p38, sendo que o grupo MI+SFN apresentou aumento apenas da ERK 1/2, mantendo os níveis da p38 iguais aos do grupo SHAM. Adicionalmente, apenas o grupo MI+SFN apresentou redução da razão Bax/Bcl-2 (pela diminuição da proteína pró-apoptótica Bax). A atividade autofágica foi reduzida no grupo IM, quando comparada ao grupo SHAM, enquanto que, no grupo MI+SFN, manteve-se semelhante ao seu controle SHAM+SFN. Conclusão: Em cultura de cardiomioblastos, uma baixa concentração de sulforafano (5 μmol/L) foi capaz de aumentar as defesas antioxidantes, em especial a expressão da HO-1, sendo estes efeitos associados à redução de estresse oxidativo e atenuação da via intrínseca do processo de apoptose celular. Semelhante ação deste isotiocianato foi observada no remodelamento cardíaco patológico após infarto do miocárdio. O sulforafano atenuou eventos críticos para a manutenção da função cardíaca, tais como redução do conteúdo de colágeno e preservação da musculatura cardíaca. Estes efeitos benéficos foram associados a um aumento da expressão da HO-1, com consequente redução de EROs. Estas adaptações do ambiente redox celular foram associadas com uma modulação da sinalização intracelular em direção à sobrevivência, com preservação da função autofágica. O conjunto de resultados aponta para a ativação da HO-1 como um mecanismo central da cardioproteção oferecida pelo sulforafano, envolvendo a modulação de vias de morte e sobrevivência celular, culminando com um remodelamento cardíaco mais favorável.

Introdução: O remodelamento cardíaco patológico é um processo complexo que ocorre no coração após dano, com eventos de morte celular, hipertrofia, fibrose e inflamação que favorecem a progressão para a insuficiência cardíaca. Envolvido na patogênese do remodelamento cardíaco está o estresse oxidativo, onde espécies reativas de oxigênio (ERO) podem modular vias de sinalização relacionadas com sobrevivência e morte celular. O aumento das defesas antioxidantes é uma estratégia eficaz na redução dano oxidativo, atenuando a progressão do remodelamento cardíaco patológico. O uso do sulforafano (SFN), um isotiocianato encontrado em vegetais crucíferos (ex. broto de brócolis), pode ser uma estratégia de intervenção. Este tem capacidade de aumentar as defesas antioxidantes e as proteínas detoxificadoras intracelulares, por sua ação sobre fatores de transcrição intracelulares, como Nrf-2 e PGC-1α, os quais aumentam a expressão das defesas antioxidantes citoplasmáticas e mitocondriais, tal como a heme oxigenase-1 (HO-1). Objetivos: Estudar o efeito do sulforafano como um agente estimulador das defesas antioxidantes endógenas em células cardíacas em cultura, assim como no coração em processo de remodelamento após infarto do miocárdio. Neste contexto, enfocar a relação do estresse oxidativo com a modulação de vias de sinalização para a sobrevivência e morte celular, assim como do processo de autofagia. Materiais e Métodos: Mioblastos cardíacos (H9c2) foram incubados com R-sulforafano (5 μmol/L), durante 24 horas. A viabilidade celular, os marcadores de estresse oxidativo e as proteínas relacionadas com a via intrínseca da apoptose foram investigados. No modelo de infarto do miocárdio, ratos Wistar machos foram divididos em quatro grupos: SHAM, SHAM + sulforafano (SHAM+SFN), infarto (MI), infarto + sulforafano (MI+SFN). Os grupos SHAM+SFN e MI+SFN receberam R-S-sulforafano (5 mg/Kg/dia, i.p.), durante 25 dias. Análise ecocadiográfica, conteúdo total de colágeno, análises bioquímicas e moleculares de marcadores de estresse oxidativo, via de sinalização para sobrevivência e morte celular, proteínas envolvidas no processo apoptótico e autofágico foram realizadas. Resultados: Células tratadas com SFN apresentaram elevação da viabilidade quando comparadas às células controle. O sulforafano aumentou a atividade das defesas antioxidantes da SOD (103%), catalase (101%) e GST (72%), assim como a expressão da HO-1 (400%) e reduziu o estresse oxidativo observado pela diminuição das EROs (15%) e da peroxidacão lipídica (65%). Somado a isso, a via associada com apoptose intrínseca reduziu, pois aumentou a expressão da proteína anti-apoptótica Bcl-2, reduzindo a razão Bax/Bcl-2, a atividade da caspase 3/7 reduziu, assim como os níveis de fosforilação da JNK. Essas respostas foram associadas com aumento da expressão do co-fator de transcrição PGC-1α (42%). Foi observado que os grupos MI e MI+SFN apresentaram disfunção cardíaca e remodelamemto patológico. No entanto, o SFN atenuou a progressão do remodelamento cardíaco no grupo MI+SFN, observada pela manutenção do índice de estresse de parede em níveis controle, redução da fibrose intersticial e preservação da musculatura cardíaca. Somado a isso, o tratamento com SFN reduziu a deterioração da função cardíaca observada pela manutenção das dilatações da câmara ventricular esquerda e dos índices de contratilidade (fração de ejeção e mudança da área fracional), quando comparados os dados ecocardiográficos do 3º dia com o 28 º dia pós-cirúrgico. O grupo MI apresentou maiores níveis de peroxidação lipídica e elevação das defesas antioxidantes (GPx, CuZn-SOD). Por outro lado, o grupo MI+SFN apresentou redução das EROs e elevação da proteína HO-1, sem mostrar elevação da peroxidação lipídica. Além disso, o grupo MI apresentou elevação da fosforilação das MAPKs ERK 1/2 e p38, sendo que o grupo MI+SFN apresentou aumento apenas da ERK 1/2, mantendo os níveis da p38 iguais aos do grupo SHAM. Adicionalmente, apenas o grupo MI+SFN apresentou redução da razão Bax/Bcl-2 (pela diminuição da proteína pró-apoptótica Bax). A atividade autofágica foi reduzida no grupo IM, quando comparada ao grupo SHAM, enquanto que, no grupo MI+SFN, manteve-se semelhante ao seu controle SHAM+SFN. Conclusão: Em cultura de cardiomioblastos, uma baixa concentração de sulforafano (5 μmol/L) foi capaz de aumentar as defesas antioxidantes, em especial a expressão da HO-1, sendo estes efeitos associados à redução de estresse oxidativo e atenuação da via intrínseca do processo de apoptose celular. Semelhante ação deste isotiocianato foi observada no remodelamento cardíaco patológico após infarto do miocárdio. O sulforafano atenuou eventos críticos para a manutenção da função cardíaca, tais como redução do conteúdo de colágeno e preservação da musculatura cardíaca. Estes efeitos benéficos foram associados a um aumento da expressão da HO-1, com consequente redução de EROs. Estas adaptações do ambiente redox celular foram associadas com uma modulação da sinalização intracelular em direção à sobrevivência, com preservação da função autofágica. O conjunto de resultados aponta para a ativação da HO-1 como um mecanismo central da cardioproteção oferecida pelo sulforafano, envolvendo a modulação de vias de morte e sobrevivência celular, culminando com um remodelamento cardíaco mais favorável.