A leishmaniose é um grupo de doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania com três manifestações clínicas principais: cutânea, mucocutânea e visceral. No Brasil, a leishmaniose é um importante problema de saúde pública pela alta incidência. O ciclo de vida da Leishmania envolve dois estágios principais de desenvolvimento, o promastigota que está presente no vetor, e o amastigota que é intracelular obrigatório do hospedeiro vertebrado. Este protozoário apresenta um alto grau de promiscuidade em quanto ao tipo de célula hospedeira, já que consegue infectar várias células do sistema imune como neutrófilos, macrófagos e células dendríticas, e também células não fagocíticas profissionais. Além disso, Leishmania pode infectar fibras musculares, como tem sido reportado em trabalhos prévios por meio de analises histológicas. Porém, as características da infecção por Leishmania no músculo têm sido pouco estudadas, o que permitiria estabelecer a importância destas células durante a infecção. O objetivo deste projeto foi avaliar as características biológicas da infecção por promastigotas de L. (L.) amazonensis em células musculares esqueléticas (SkMCs). Para atingir isso, camundongos C57BL/6 e BALB/c foram infectados nas patas traseiras, o musculo Flexor Digitorum Brevis (FDB) foi extraído e processado para coloração com hematoxilina/eosina ou imunohistoquímica. Culturas de SkMCs como mioblastos e miotubos foram infectadas com promastigotas metacíclicos de L. (L.) amazonensis por 72h. As infecções foram caracterizadas por meio de imunofluorescência indireta e microscopia confocal. As culturas de SkMCs foram caracterizadas e padronizadas por médio das proteínas Caveolina-1 e Caveolina-3, também foi medido o Ph dos vacúolos parasitóforos de mioblastos e miotubos com laranja de acridina (AO). Adicionalmente, culturas de SkMCs como miotubos foram pré-tratadas com Streptolisina O (SLO) e/ou infectadas com promastigotas metacíclicos de L. (L.) amazonensis por 72h, com o intuito de esclarecer como ocorre a entrada do parasito nas células musculares. Neste caso foi avaliada a produção de IL-1&#946;, IL-6, IL-10 e NO. Além disso, foi quantificado o mRNA de IL1&#946;, IL-6, iNOS, Ama2, UbH e Lyst. A infecção de células mostrou que L. (L.) amazonensis consegue infectar as fibras musculares in vivo, e também as células musculares esqueléticas (mioblastos e miotubos) in vitro. Além disso, o teste de viabilidade mostrou que L. (L.) amazonensis permanece viável dentro do vacúolo parasitóforo após 72h de infecção. Finalmente, foi observado que o tratamento com SLO pode favorecer a entrada do parasito nas SkMCs, como foi evidenciado pelas diferencias no nível de mRNA entre as células infectadas ou infectadas e tratadas com SLO. Os dados em conjunto sugerem que L. (L.) amazonensis tem a capacidade de infectar as células musculares esqueléticas, dado que consegue entrar nestas células, e permanecer viável dentro do vacúolo parasitóforo. A presença do parasito dentro das células induz uma resposta imune no músculo que pode estar relacionada com os processos de reparo do tecido. A entrada de L. (L.) amazonensis nas células musculares esqueléticas durante a infecção no hospedeiro mamífero é importante devido a sua capacidade de manter o parasito viável. / Leishmaniasis is a group of diseases caused by parasites from genus Leishmania. The main clinical manifestations are cutaneous, mucocutaneus and visceral leishmaniasis. In Brazil, leishmaniasis is an important public health problem because of the high incidence. The Leishmania life cycle has two principal developing stages: promastigote inside the insect vector, and amastigote, an obligate intracellular parasite of vertebrate-host cells. This protozoan is highly promiscuous in host cell type, because it infects different immune cells like neutrophils, macrophages and dendritic cells, and also non-professional phagocytes. Besides, Leishmania might infect muscle fibers, as previous studies suggested from histological analysis. However, the characteristics of Leishmania infection in muscle cells is poorly understood, which is important to understand the role of these cells during the infection. The aim of this study was to characterize the infection process by promastigotes of <i.>L. (L.) amazonensis in skeletal muscle cells (SkMCs). C57BL/6 and BALB/c mice were infected in hind footpads, the Flexor Digitorum Brevis (FDB) muscle was extracted and process to dyed with hematoxylin/eosin or immunohistochemistry. SkMCs as myoblasts and myotubes were infected with metaciclic promastigotes of L. (L.) amazonensis during 72h. The infections were characterized using indirect immunofluorescence and confocal microscopy. SkMCs culture were characterized and standardized through Caveolin-1 and Caveolin-3 proteins, and the pH of parasitophorous vacuoles both in myoblasts and myotubes was measured through acridine orange staining. In order to assess how the parasite invades the cells, myotubes were pretreated with SLO and/or infected with metaciclic promastigotes of L. (L.) amazonensis for 72h. The production of IL-1&#946;, IL-6, IL-10 and NO was quantified, and the mRNA levels of IL-1&#946;, IL-6, iNOS, Ama2, UbH and Lyst. The cell infection showed that L. (L.) amazonensis can infect muscle fibers in vivo, and skeletal muscle cells in vitro. Moreover, viability test showed the parasite remains viable inside the parasitophorous vacuole until 72h of infection. Finally, the SLO treatment can favor parasite entrance in SkMCs, as evidenced by differences in mRNA levels between infected cells or infected and treated with SLO. All data suggest that L. (L.) amazonensis can infect skeletal muscle cells, by entering into the cells, and remaining viable inside the parasitophorous vacuole. The parasite presence inside the muscle cells triggers an immune response that may be related with muscle repair processes. The entrance of L. (L.) amazonensis into SkMCs during infection in a mammal host is important because it contribute with parasite proliferation.

A leishmaniose é um grupo de doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania com três manifestações clínicas principais: cutânea, mucocutânea e visceral. No Brasil, a leishmaniose é um importante problema de saúde pública pela alta incidência. O ciclo de vida da Leishmania envolve dois estágios principais de desenvolvimento, o promastigota que está presente no vetor, e o amastigota que é intracelular obrigatório do hospedeiro vertebrado. Este protozoário apresenta um alto grau de promiscuidade em quanto ao tipo de célula hospedeira, já que consegue infectar várias células do sistema imune como neutrófilos, macrófagos e células dendríticas, e também células não fagocíticas profissionais. Além disso, Leishmania pode infectar fibras musculares, como tem sido reportado em trabalhos prévios por meio de analises histológicas. Porém, as características da infecção por Leishmania no músculo têm sido pouco estudadas, o que permitiria estabelecer a importância destas células durante a infecção. O objetivo deste projeto foi avaliar as características biológicas da infecção por promastigotas de L. (L.) amazonensis em células musculares esqueléticas (SkMCs). Para atingir isso, camundongos C57BL/6 e BALB/c foram infectados nas patas traseiras, o musculo Flexor Digitorum Brevis (FDB) foi extraído e processado para coloração com hematoxilina/eosina ou imunohistoquímica. Culturas de SkMCs como mioblastos e miotubos foram infectadas com promastigotas metacíclicos de L. (L.) amazonensis por 72h. As infecções foram caracterizadas por meio de imunofluorescência indireta e microscopia confocal. As culturas de SkMCs foram caracterizadas e padronizadas por médio das proteínas Caveolina-1 e Caveolina-3, também foi medido o Ph dos vacúolos parasitóforos de mioblastos e miotubos com laranja de acridina (AO). Adicionalmente, culturas de SkMCs como miotubos foram pré-tratadas com Streptolisina O (SLO) e/ou infectadas com promastigotas metacíclicos de L. (L.) amazonensis por 72h, com o intuito de esclarecer como ocorre a entrada do parasito nas células musculares. Neste caso foi avaliada a produção de IL-1&#946;, IL-6, IL-10 e NO. Além disso, foi quantificado o mRNA de IL1&#946;, IL-6, iNOS, Ama2, UbH e Lyst. A infecção de células mostrou que L. (L.) amazonensis consegue infectar as fibras musculares in vivo, e também as células musculares esqueléticas (mioblastos e miotubos) in vitro. Além disso, o teste de viabilidade mostrou que L. (L.) amazonensis permanece viável dentro do vacúolo parasitóforo após 72h de infecção. Finalmente, foi observado que o tratamento com SLO pode favorecer a entrada do parasito nas SkMCs, como foi evidenciado pelas diferencias no nível de mRNA entre as células infectadas ou infectadas e tratadas com SLO. Os dados em conjunto sugerem que L. (L.) amazonensis tem a capacidade de infectar as células musculares esqueléticas, dado que consegue entrar nestas células, e permanecer viável dentro do vacúolo parasitóforo. A presença do parasito dentro das células induz uma resposta imune no músculo que pode estar relacionada com os processos de reparo do tecido. A entrada de L. (L.) amazonensis nas células musculares esqueléticas durante a infecção no hospedeiro mamífero é importante devido a sua capacidade de manter o parasito viável. / Leishmaniasis is a group of diseases caused by parasites from genus Leishmania. The main clinical manifestations are cutaneous, mucocutaneus and visceral leishmaniasis. In Brazil, leishmaniasis is an important public health problem because of the high incidence. The Leishmania life cycle has two principal developing stages: promastigote inside the insect vector, and amastigote, an obligate intracellular parasite of vertebrate-host cells. This protozoan is highly promiscuous in host cell type, because it infects different immune cells like neutrophils, macrophages and dendritic cells, and also non-professional phagocytes. Besides, Leishmania might infect muscle fibers, as previous studies suggested from histological analysis. However, the characteristics of Leishmania infection in muscle cells is poorly understood, which is important to understand the role of these cells during the infection. The aim of this study was to characterize the infection process by promastigotes of <i.>L. (L.) amazonensis in skeletal muscle cells (SkMCs). C57BL/6 and BALB/c mice were infected in hind footpads, the Flexor Digitorum Brevis (FDB) muscle was extracted and process to dyed with hematoxylin/eosin or immunohistochemistry. SkMCs as myoblasts and myotubes were infected with metaciclic promastigotes of L. (L.) amazonensis during 72h. The infections were characterized using indirect immunofluorescence and confocal microscopy. SkMCs culture were characterized and standardized through Caveolin-1 and Caveolin-3 proteins, and the pH of parasitophorous vacuoles both in myoblasts and myotubes was measured through acridine orange staining. In order to assess how the parasite invades the cells, myotubes were pretreated with SLO and/or infected with metaciclic promastigotes of L. (L.) amazonensis for 72h. The production of IL-1&#946;, IL-6, IL-10 and NO was quantified, and the mRNA levels of IL-1&#946;, IL-6, iNOS, Ama2, UbH and Lyst. The cell infection showed that L. (L.) amazonensis can infect muscle fibers in vivo, and skeletal muscle cells in vitro. Moreover, viability test showed the parasite remains viable inside the parasitophorous vacuole until 72h of infection. Finally, the SLO treatment can favor parasite entrance in SkMCs, as evidenced by differences in mRNA levels between infected cells or infected and treated with SLO. All data suggest that L. (L.) amazonensis can infect skeletal muscle cells, by entering into the cells, and remaining viable inside the parasitophorous vacuole. The parasite presence inside the muscle cells triggers an immune response that may be related with muscle repair processes. The entrance of L. (L.) amazonensis into SkMCs during infection in a mammal host is important because it contribute with parasite proliferation.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-10-29T13:31:11Z No. of bitstreams: 1 Beatriz Rocha Simone Dias Vacúolos....pdf: 43303992 bytes, checksum: 310fce5b6b7557207067a51be3ca3c64 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-29T13:31:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Beatriz Rocha Simone Dias Vacúolos....pdf: 43303992 bytes, checksum: 310fce5b6b7557207067a51be3ca3c64 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A Leishmania é um parasito intracelular obrigatório que vive e se multiplic adentro dos vacúolos parasitóforos em macrófagos no hospedeiro vertebrado. Apesar dos vacúolos induzidos por diferentes espécies de Leishmania apresentarem semelhanças bioquímicas, esses compartimentos apresentam diferenças significativas nos seus tamanhos. Os vacúolos parasitóforos induzidos por Leishmania mexicana e Leishmania amazonensis apresentam grandes dimensões e contêm uma grande quantidade de amastigotas, enquanto que os induzidos por Leishmania major e Leishmania donovani são pequenos e com pouco espaço ao redor das amastigotas. Estudos recentes demonstraram que compartimentos induzidos por microrganismos intracelulares são capazes de interagir com a via autofágica e esta pode controlar ou promover o estabelecimento da infecção a depender da natureza do microrganismo. Até o momento, poucos estudos foram realizados para avaliar o papel da autofagia na biogênese e maturação dos vacúolos parasitóforos induzidos por Leishmania. Recentemente, foi demonstrado que em macrófagos de camundongos BALB/c, a indução de autofagia provoca um aumento na carga parasitária de L. amazonensis, no entanto, não é capaz de aumentar a carga parasitária de L. major. Além disso, estudos indicam que vacúolos parasitóforos de L. mexicana adquirem macromoléculas do citoplasma da célula hospedeira por meio de microautofagia. Uma vez que L. amazonensis integra o mesmo complexo que L. mexicana, nossa hipótese é que vacúolos parasitóforos induzidos por L. amazonensis interagem com a via autofágica.Assim, o presente estudo tem como bjetivo verificar e comparar a participação da autofagia na infecção por L. amazonensis ou L. major em macrófagos murinos. Para este fim, avaliamos quanto a características autofágicas, os vacúolos parasitóforos induzidos por L. amazonensis ou L. major em macrófagos de camundongo CBA e analisamos a influência da superexpressão de LC3 sobre a sobrevivência de L. amazonensis ou L. major em macrófagos infectados. Inicialmente, macrófagos de camundongos CBA foram infectados com L. amazonensis ou L. major e incubados com ysoTracker, marcador de compartimentos lisossomais, ou DQ-BSA, marcador de compartimentos degradativos. Além disso, foi avaliada a presença de LAMP, proteína lisossomal, e LC3, proteína específica de autofagossomo, na membrana destes vacúolos. Em seguida, a co- localização dos parasitos com os vacúolos parasitóforos contendo estes marcadores foi quantificada. Nossos resultados demostraram um maior percentual de co-localização tanto do LysoTracker como doDQ-BSAcom parasitos em vacúolos no interior de macrófagos infectados com L. major em comparação com aqueles infectados com L. amazonensis. No entanto, não houve diferença no percentual de co-localização de LAMP com L. major ou L. amazonensis e foi observado um maior percentual de co-localização do LC3 com parasitos em macrófagos infectados com L. amazonensis em comparação com aqueles infectados com L. major. Posteriormente, avaliamos o efeito da superexpressão da LC3 na infecção por L. amazonensis ou L. major. Células de linhagem macrofágica RAW foram transfectadas com o plasmídeo contendo a sequência codificante para a LC3 e infectadas com L. amazonensis ou L. major. Nós observamos uma reduçãono percentual de infecção por L. amazonensis e L. major nas células RAW- pmRFP-LC3 em comparação às controle. Essa diminuição na infecção se deu por inibição da fagocitose de L. amazonensis e L. major pois os parasitos continuam a interagir com a membrana das células RAW-pmRFP-LC3, mas não são internalizadas. Em conjunto, estes dados demonstram que os vacúolos parasitóforos de L. amazonensis e L. major interagem com compartimentos da via autofágica de forma distinta e que a superexpressão de LC3 reduz a fagocitose de L. amazonensis e L. major por células RAW, o que resulta na redução da infecção / Leishmania is an intracellular parasite that lives and multiplies within parasitophorous vacuoles in macrophages in the vertebrate host. Despite the fact that vacuoles induced by different species of Leishmania present biochemical similarities, these compartments have significant differences in their sizes and composition. The parasitophorous vacuoles induced by Leishmania mexicana and Leishmania amazonensis are large and contain a large number of amastigotes, while vacuoles induced by Leishmania major and Leishmania donovani are small and tight. Recent studies have demonstrated that depending on the type of intracellular microorganism, the induced compartments can interact with the autophagic pathway and control or promote the establishment of infection. To date, few studies have been conducted to evaluate the role autophagic process plays in the biogenesis and maturation of parasitophorous vacuoles induced by Leishmania. Recently, it has been demonstrated that in macrophages of BALB/c mice, the induction of autophagic causes an increase in parasitic load of L. amazonensis, but not L. major. Furthermore, other studies indicate that L. mexicana-induced parasitophorous vacuoles acquire macromolecules from the cytoplasm of the host cell through microautophagy. Once L. amazonensis belongs to the same complex that L. mexicana, our hypothesis is that L. amazonensis-induced parasitophorous vacuoles interact with the autophagic pathway. Thus, the present study aims to evaluate and compare the role autophagic process plays in Leishmania infection. We evaluated L. amazonensis- or L. major-induced parasitophorous vacuoles regarding their autophagic characteristics and we analyzed the influence of the overexpression of LC3 on the survival of parasites in infected macrophages. Initially, macrophages of CBA mice were infected with L. amazonensis or L. major and incubated with a marker of lysosomal compartments, LysoTracker, or a marker of degrading compartments, DQ-BSA. In addition, we evaluated the presence of the lysosomal membrane protein, LAMP-1, and a protein specific of autophagossomes, LC3 in the membrane of these vacuoles. Then, the colocalization of parasites with the marker labeled-compartments was quantified. Our results demonstrated a higher percentage of colocalization of both LysoTracker and DQ-BSA with parasites in vacuoles within macrophages infected with L. major in comparison with those infected with L. amazonensis. However, there was no difference in the percentage of colocalization of LAMP with L. major or L. amazonensis. We also observed a higher percentage of LC3-co-localizing with parasites in macrophages infected with L. amazonensis in comparison with those infected with L. major. Subsequently, we evaluated the effect of overexpression of LC3 in macrophages infected with L. amazonensis or L. major. RAW cells were transfected with the plasmid containing the coding sequence for the LC3 (RAW-pmRFP-LC3) and then were infected with L. amazonensis or L. major stationary phase promastigotas. A reduction was observed in the percentage of infected RAW-pmRFP-LC3 cells with L. amazonensis and L. major compared to control cells. This decrease in the percentage of infected cells is due to the inhibition of phagocytic ability of RAW-pmRFP-LC3 cells, since the parasites continue to interact with cell membrane, but is not internalized. Together, these findings show that L. amazonensis- and L. major-induced parasitophorous vacuoles interact differently with compartments of the autophagic pathway and that the overexpression of LC3 reduces phagocytosis of both L. amazonensis and L. major by RAW-pmRFP-LC3 cells resulting in the reduction of infection.

Parasitos do gênero Leishmania causam um espectro de doenças chamadas de leishmaniose. Para compreender de melhor forma a imunobiologia da Leishmania, o estudo de outras células envolvidas no processo de infecção do parasito se torna importante. As células B-1 são encontradas principalmente nas cavidades peritoneal e pleural, tendo como característica a capacidade de se diferenciar em células fagocíticas. Este trabalho teve como objetivo avaliar o papel das células B-1 na infecção por L. (L.) amazonensis. Os resultados mostraram que, assim como os macrófagos, os B-1CDPs são infectados pelo mecanismo de fagocitose e permitem a multiplicação da Leishmania no seu interior. Além disso, os vacúolos parasitóforos formados nos B-1CDPs apresentaram ser maiores do que dos macrófagos. Portanto, os dados com B1CDPs sugerem que estas células podem possuir um papel relevante na infecção por L. (L.) amazonensis, podendo ser considerados células hospedeiras importantes durante a infecção devido à incapacidade de responder de maneira eficaz para a eliminação dos parasitos. / The genus Leishmania parasites cause a spectrum of diseases called leishmaniasis. To better understand the immunobiology of Leishmania, the study of other cells involved in parasite infection process becomes important. The B-1 cells are found predominantly in the peritoneal and pleural cavities, whose feature consist on an ability to differentiate into phagocytic cells. This study aimed to evaluate the role of B-1 cells in the infection by L. (L.) amazonensis. The results showed that, like macrophages, B-1CDPs are infected by a mechanism of phagocytosis and allow the multiplication of Leishmania within. Furthermore, the parasitophorous vacuoles in the B-1CDPs showed to be larger than those formed in the macrophages. Therefore, B1CDPs can have an important role in infection by L. (L.) amazonensis and can be considered important host cells during infection due to inability to respond effectively to the elimination of parasites.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-22 / Quase todos os patógenos intracelulares não virais de importância humana e animal penetram nas células hospedeiras por fagocitose “clássica” ou modificada. Por este motivo os fagossomos constituem o primeiro e, às vezes, o último habitat dos patógenos intracelulares. Sua sobrevida e multiplicação na célula hospedeira dependem da modulação do fenótipo composicional e funcional dos fagossomos em que habitam, como o pH intravacuolar, a aquisição de substratos e nutrientes pela presença de canais e transportadores e a fusão com lisossomos, outros fagossomos e vesículas. Cada fagossomo ou fagolisossomo é uma entidade particular, cuja biogênese depende de sinais expressos ou disparados pela célula e pela partícula ou organismo internalizado. Uma vez internalizados pelas células hospedeiras, alguns patógenos escapam do fagossomo e se instalam no citosol. Outros interferem com a maturação dos fagossomos, de forma a excluí-los das vias endocítica e secretória ou gerar vacúolos de capacidade fusogênica seletiva. Os parasitas do gênero Leishmania permanecem, durante todo o ciclo de vida intracelular no hospedeiro mamífero, em estruturas semelhantes a fagolisossomos denominadas vacúolos parasitóforos (VPs). A diversidade morfológica e bioquímica desses vacúolos foi pouco estudada. Os VPs formados pelas espécies mais estudadas – (L.) L. major, L. (L.) donovani e L. (V.) braziliensis - abrigam uma ou duas formas amastigotas e apresentam pouco espaço vacuolar livre. À medida que os amastigotas se dividem, os VPs que os hospedam fissionam, porém os mecanismos envolvidos neste processo são desconhecidos. Já parasitas do complexo (L.) (L.) mexicana, incluindo L. (L.) amazonensis, L. (L.) mexicana e L. (L.) pifanoi, ocupam VPs espaçosos contendo mais de um amastigota. O presente estudo experimental teve como objetivo responder à questão: “qual a importância de um VP espécie-específico para o parasitismo intracelular de Leishmania?”. Nos experimentos descritos, macrófagos derivados de precursores de medula óssea de camundongo foram coinfectados por duas espécies de Leishmania para investigar a possibilidade de fusão entre VPs que hospedam diferentes parasitas e as consequências de uma possível coabitação intravacuolar sobre a viabilidade e multiplicação dos dois parasitas. Os macrófagos foram inicialmente infectados com L. (L.) amazonensis e em seguida superinfectados por L. (L.) major, espécies que desenvolvem VPs de tamanho, número de parasitas e biogênese distintos. Para permitir o reconhecimento inequívoco da espécie dos parasitas, os macrófagos foram infectados por amastigotas não fluorescentes de L. (L.) amazonensis e superinfectados com amastigotas ou promastigotas de L. (L.) major que expressam proteínas fluorescentes GFP ou DsRed2. Constatamos que os VPs contendo amastigotas de L. (L.) major aderiram aos espaçosos VPs de L. (L.) amazonensis mas a fusão entre os vacúolos não foi detectada. A multiplicação da L. (L.) major e a fissão de seus VPs nos macrófagos superinfectados não foram afetadas pela infecção pelos dois parasitas. Já os VPs contendo promastigotas da L. (L.) major se fundiram com os VPs da L. (L.) amazonensis. Nestes VPs “quiméricos” (contendo ambas as espécies de parasitas) os promastigotas de L. (L.) major dividiram-se mas não se diferenciaram em amastigotas. Essa diferenciação só ocorreu nos pequenos VPs que abrigavam exclusivamente a L. (L.) major. / Most non-viral intracellular pathogens gain entrance into human and animal host cells by “classic” or modifIed phagocytosis and are thus lodged in phagosomes which they may or not continue to occupy in the course of infection. Their survival and multiplication within host cells depend on modulation of the compositional and functional phenotypes of the phagosomes they occupy, including intravacuolar pH, substrate acquisition through membrane transporters and channels, and fusion with lysosomes, and other cell phagosomes and vesicles. Each phagosome thus exhibits particular features, whose biogenesis is conditioned to different signals triggered by both the host cell and the internalized particle/microorganism. Once internalized by host cells, some pathogens escape the phagosome and assume the host cell cytosol as their intracellular niche. Other pathogens interfere with phagosomal maturation, leading to the development of phagosomes excluded from host cell endocytic and secretory pathways or vacuoles with selective fusogenic properties. During their intracelular lifecycle, protozoan parasites of the genus Leishmania remain enclosed in phagolysosome-like structures called Parasitophorous Vacuoles (PVs). The morphological and biochemical diversity of Leishmania PVs were not extensively studied. Most species – such as L. major, L. donovani and L. braziliensis – are lodged in membrane-bound PVs, containing one or two amastigotes, that undergo fission as parasites divide. The mechanisms involved in PV fission remain to be elucidated. In contrast, species from the L. mexicana complex, such as L. amazonensis, L. mexicana and L. pifanoi, occupy large PVs which may contain many parasites. The present experimental aimed to answer the question: “what is the importance of a speciesspecific PV to Leishmania intracellular parasitism?”. In the experiments herewith described, mouse bone marrow-derived macrophages were co-infected with two Leishmania species to investigate the possibility of fusion between PVs that shelter different parasites, and the consequences of a possible intravacuolar cohabitation on their survival and multiplication. Macrophages were initially infected with L. amazonensis and later on superinfected with L. major, which represent species with different PV size, parasite content and biogenesis. In order to distinguish the two species, macrophages were infected with non-fluorescent L. amazonensis amastigotes and superinfected with either amastigotes or promastigotes of L. major transfected with the fluorescent proteins GFP or DsRed2. Although PVs contacted each other, fusion between L. amazonensis and L. major amastigote PVs was not detected. Leishmania major multiplication and PV fission were not affected by coinfection. In contrast, PVs containing L. major promastigotes fused with pre-established L. amazonensis PVs. In these “chimeric” vacuoles (containing both Leishmania), L. major promastigotes multiplied, however they did not differentiate into amastigotes. The differentiation of L. major promastigotes into amastigotes occurred exclusively within their own, unfused PVs. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Parasitos do gênero Leishmania causam um espectro de doenças chamadas de leishmaniose. Para compreender de melhor forma a imunobiologia da Leishmania, o estudo de outras células envolvidas no processo de infecção do parasito se torna importante. As células B-1 são encontradas principalmente nas cavidades peritoneal e pleural, tendo como característica a capacidade de se diferenciar em células fagocíticas. Este trabalho teve como objetivo avaliar o papel das células B-1 na infecção por L. (L.) amazonensis. Os resultados mostraram que, assim como os macrófagos, os B-1CDPs são infectados pelo mecanismo de fagocitose e permitem a multiplicação da Leishmania no seu interior. Além disso, os vacúolos parasitóforos formados nos B-1CDPs apresentaram ser maiores do que dos macrófagos. Portanto, os dados com B1CDPs sugerem que estas células podem possuir um papel relevante na infecção por L. (L.) amazonensis, podendo ser considerados células hospedeiras importantes durante a infecção devido à incapacidade de responder de maneira eficaz para a eliminação dos parasitos. / The genus Leishmania parasites cause a spectrum of diseases called leishmaniasis. To better understand the immunobiology of Leishmania, the study of other cells involved in parasite infection process becomes important. The B-1 cells are found predominantly in the peritoneal and pleural cavities, whose feature consist on an ability to differentiate into phagocytic cells. This study aimed to evaluate the role of B-1 cells in the infection by L. (L.) amazonensis. The results showed that, like macrophages, B-1CDPs are infected by a mechanism of phagocytosis and allow the multiplication of Leishmania within. Furthermore, the parasitophorous vacuoles in the B-1CDPs showed to be larger than those formed in the macrophages. Therefore, B1CDPs can have an important role in infection by L. (L.) amazonensis and can be considered important host cells during infection due to inability to respond effectively to the elimination of parasites.