Orientador: Robson Francisco Carvalho / Resumo: Os exossomos constituem uma classe de pequenas vesículas extracelulares de aproximadamente 40-150 nm originadas pelo sistema endossomal. Essas vesículas são produzidas constitutivamente por praticamente todos os tipos celulares, e são responsáveis por transportar distintas classes de moléculas, em resposta a diferentes estímulos. O TNF-α é uma citocina pró-inflamatória que em condições tais como AIDS, septicemia, diabetes, insuficiência cardíaca, doença pulmonar obstrutiva crônica, diabetes e câncer, contribui para a atrofia de fibras musculares esqueléticas. Nesse sentido, o objetivo do presente estudo foi caracterizar os RNAs transportados por exossomos de miotubos C2C12 com atrofia induzida por TNF-α e avaliar a ação desses exossomos no fenótipo de mioblastos e miotubos C2C12. Exossomos liberados no meio de cultura de miotubos C2C12 tratados com TNF-α, e de seus respectivos controles, foram isolados por ultracentrifugação e analisados quanto ao seu conteúdo de RNA por RT-qPCR (microRNAs) e sequenciamento de nova geração (RNA total). Além disso, mioblastos e miotubos C2C12 foram tratados com esses mesmos exossomos para analisar a expressão de genes envolvidos com ciclo celular e a capacidade de migração/proliferação (mioblastos), bem como na atrofia celular (miotubos). Nossos resultados demonstraram que exossomos provenientes de miotubos são capazes de alterar os níveis de transcritos de genes envolvidos na proliferação, motilidade e diferenciação de mioblastos em miotubos.... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Exosomes constitute a class of small extracellular vesicles of approximately 40-150 nm originated by the endosomal system. These vesicles are constitutively produced by virtually all cell types and are responsible for carrying distinct classes of molecules in response to different stimuli. TNF-α is a proinflammatory cytokine that in conditions such as AIDS, septicemia, diabetes, heart failure, chronic obstructive pulmonary disease, diabetes and cancer, contributes to atrophy of skeletal muscle fibers. In this sense, the objective of the present study was to evaluate the expression and action of RNAs transported by exosomes from C2C12 myotubes with TNF-α-induced atrophy in the phenotype of myoblasts and myotubes. Exosomes released in the culture medium from TNF-α treated C2C12 myotubes and from their respective controls were isolated by ultracentrifugation and analyzed for their RNA content by RT-qPCR (microRNAs) and new generation sequencing (total RNA). In addition, myoblasts and C2C12 myotubes were treated with these same exosomes to analyze the expression of genes involved in cell cycle and migration / proliferation capacity (myoblasts), as well as cell atrophy (myotubes). Our results demonstrated that exosomes from myotubes alter the expression genes involved in the proliferation, motility and differentiation of myoblasts into myotubes. We also verified that exosomes from TNFα-treated myotubes decreased migration / proliferation capacity of myoblasts. In addition, we iden... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Felipe Lapenda (felipe.lapenda@ufpe.br) on 2015-03-18T14:51:49Z No. of bitstreams: 2 Tese Simone do Nascimento Fraga.pdf: 3534345 bytes, checksum: 577854a1b0ce231306b6ac49197e9bde (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-18T14:51:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese Simone do Nascimento Fraga.pdf: 3534345 bytes, checksum: 577854a1b0ce231306b6ac49197e9bde (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-01-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior ; Ministério da Educação e Cultura / Para estudar o efeito da desnutrição neonatal sobre o tecido muscular esquelético, foi avaliada a sensibilidade dos miotubos em cultura à insulina, bem como os parâmetros biomecânicos das células musculares cultivadas. Para isso, 12 ratos machos Wistar foram divididos em dois grupos, nutrido (N), n = 6, e desnutrido (D), n = 6, segundo a dieta oferecida à mãe durante o período de lactação (21 dias) de sua prole. Para o acompanhamento da evolução ponderal, os animais foram pesados a cada 5 dias durante o período de aleitamento, e uma vez por semana no período após a lactação. Após o desmame, os animais receberam dieta padrão de biotério até o dia da coleta do músculo esquelético (60-70 dias). Através da otimização de protocolos anteriores, um novo protocolo para a cultura de células musculares primárias foi estabelecido com o objetivo de simplificar os procedimentos, reduzir o tempo para a confecção da cultura e torná-lo menos dispendioso. Assim, as células musculares das patas posteriores dos animais foram cultivados na presença de insulina (Ni, Di) ou na ausência desta (grupos controles Nc, Dc) e, ao 10o de cultura, foram observados a taxa de proliferação celular e o percentual de incorporação de núcleos pelos miotubos entre os animais N e D. Além disso, os parâmetros biomecânicos dos miotubos foram caracterizados através da frequência de contração, do percentual de amplitude, bem como pelo período de contração. Ao 21o dia, o peso dos animais D mostrou-se inferior quando comparado ao peso dos animais N (N = 67.8 ± 3.0; D = 40.7 ± 1.9). Esta condição permaneceu até o dia da coleta dos músculos, entre 60-70 dias (N = 394 ± 28.4; D = 342.7 ± 20.7). A insulina não interferiu na taxa de proliferação dos mioblastos (Nc = 2.61 ± 0.56; Ni = 2.49 ± 0.51; Dc = 3.12 ± 0.92; Di = 2.77 ± 0.81), mas reduziu o percentual de incorporação de núcleo pelos miotubos dos animais D (Dc = 11.5 ± 8.9; Di = 7.0 ± 5.6). Miotubos de animais N e D, tratados com insulina, apresentaram maior número de contrações por minuto (Nc = 17.6 ± 1.8, Dc = 16.4 ± 3.6; Ni = 29.2 ± 3.8; Di = 28.2 ± 4.2). O percentual de amplitude não se mostrou diferente entre N e D (p=0.0687). A presença da insulina aumentou o período de contração nos animais N (Ni = 1.2 ± 0.9; Dc = 0.8 ± 0.3), enquanto que no grupo D provocou redução (Di = 0.8 ± 0.1; Dc = 0.9 ± 0.2). Houve redução no período de contração no grupo Di, quando comparado ao grupo Ni (p<0.05). Assim, este estudo permitiu complementar os conhecimentos sobre o efeito da desnutrição neonatal sobre a ação da insulina no tecido muscular, além de possibilitar o surgimento de novas perspectivas sobre o estudo do músculo esquelético em cultura.

A leishmaniose é um grupo de doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania com três manifestações clínicas principais: cutânea, mucocutânea e visceral. No Brasil, a leishmaniose é um importante problema de saúde pública pela alta incidência. O ciclo de vida da Leishmania envolve dois estágios principais de desenvolvimento, o promastigota que está presente no vetor, e o amastigota que é intracelular obrigatório do hospedeiro vertebrado. Este protozoário apresenta um alto grau de promiscuidade em quanto ao tipo de célula hospedeira, já que consegue infectar várias células do sistema imune como neutrófilos, macrófagos e células dendríticas, e também células não fagocíticas profissionais. Além disso, Leishmania pode infectar fibras musculares, como tem sido reportado em trabalhos prévios por meio de analises histológicas. Porém, as características da infecção por Leishmania no músculo têm sido pouco estudadas, o que permitiria estabelecer a importância destas células durante a infecção. O objetivo deste projeto foi avaliar as características biológicas da infecção por promastigotas de L. (L.) amazonensis em células musculares esqueléticas (SkMCs). Para atingir isso, camundongos C57BL/6 e BALB/c foram infectados nas patas traseiras, o musculo Flexor Digitorum Brevis (FDB) foi extraído e processado para coloração com hematoxilina/eosina ou imunohistoquímica. Culturas de SkMCs como mioblastos e miotubos foram infectadas com promastigotas metacíclicos de L. (L.) amazonensis por 72h. As infecções foram caracterizadas por meio de imunofluorescência indireta e microscopia confocal. As culturas de SkMCs foram caracterizadas e padronizadas por médio das proteínas Caveolina-1 e Caveolina-3, também foi medido o Ph dos vacúolos parasitóforos de mioblastos e miotubos com laranja de acridina (AO). Adicionalmente, culturas de SkMCs como miotubos foram pré-tratadas com Streptolisina O (SLO) e/ou infectadas com promastigotas metacíclicos de L. (L.) amazonensis por 72h, com o intuito de esclarecer como ocorre a entrada do parasito nas células musculares. Neste caso foi avaliada a produção de IL-1&#946;, IL-6, IL-10 e NO. Além disso, foi quantificado o mRNA de IL1&#946;, IL-6, iNOS, Ama2, UbH e Lyst. A infecção de células mostrou que L. (L.) amazonensis consegue infectar as fibras musculares in vivo, e também as células musculares esqueléticas (mioblastos e miotubos) in vitro. Além disso, o teste de viabilidade mostrou que L. (L.) amazonensis permanece viável dentro do vacúolo parasitóforo após 72h de infecção. Finalmente, foi observado que o tratamento com SLO pode favorecer a entrada do parasito nas SkMCs, como foi evidenciado pelas diferencias no nível de mRNA entre as células infectadas ou infectadas e tratadas com SLO. Os dados em conjunto sugerem que L. (L.) amazonensis tem a capacidade de infectar as células musculares esqueléticas, dado que consegue entrar nestas células, e permanecer viável dentro do vacúolo parasitóforo. A presença do parasito dentro das células induz uma resposta imune no músculo que pode estar relacionada com os processos de reparo do tecido. A entrada de L. (L.) amazonensis nas células musculares esqueléticas durante a infecção no hospedeiro mamífero é importante devido a sua capacidade de manter o parasito viável. / Leishmaniasis is a group of diseases caused by parasites from genus Leishmania. The main clinical manifestations are cutaneous, mucocutaneus and visceral leishmaniasis. In Brazil, leishmaniasis is an important public health problem because of the high incidence. The Leishmania life cycle has two principal developing stages: promastigote inside the insect vector, and amastigote, an obligate intracellular parasite of vertebrate-host cells. This protozoan is highly promiscuous in host cell type, because it infects different immune cells like neutrophils, macrophages and dendritic cells, and also non-professional phagocytes. Besides, Leishmania might infect muscle fibers, as previous studies suggested from histological analysis. However, the characteristics of Leishmania infection in muscle cells is poorly understood, which is important to understand the role of these cells during the infection. The aim of this study was to characterize the infection process by promastigotes of <i.>L. (L.) amazonensis in skeletal muscle cells (SkMCs). C57BL/6 and BALB/c mice were infected in hind footpads, the Flexor Digitorum Brevis (FDB) muscle was extracted and process to dyed with hematoxylin/eosin or immunohistochemistry. SkMCs as myoblasts and myotubes were infected with metaciclic promastigotes of L. (L.) amazonensis during 72h. The infections were characterized using indirect immunofluorescence and confocal microscopy. SkMCs culture were characterized and standardized through Caveolin-1 and Caveolin-3 proteins, and the pH of parasitophorous vacuoles both in myoblasts and myotubes was measured through acridine orange staining. In order to assess how the parasite invades the cells, myotubes were pretreated with SLO and/or infected with metaciclic promastigotes of L. (L.) amazonensis for 72h. The production of IL-1&#946;, IL-6, IL-10 and NO was quantified, and the mRNA levels of IL-1&#946;, IL-6, iNOS, Ama2, UbH and Lyst. The cell infection showed that L. (L.) amazonensis can infect muscle fibers in vivo, and skeletal muscle cells in vitro. Moreover, viability test showed the parasite remains viable inside the parasitophorous vacuole until 72h of infection. Finally, the SLO treatment can favor parasite entrance in SkMCs, as evidenced by differences in mRNA levels between infected cells or infected and treated with SLO. All data suggest that L. (L.) amazonensis can infect skeletal muscle cells, by entering into the cells, and remaining viable inside the parasitophorous vacuole. The parasite presence inside the muscle cells triggers an immune response that may be related with muscle repair processes. The entrance of L. (L.) amazonensis into SkMCs during infection in a mammal host is important because it contribute with parasite proliferation.

A leishmaniose é um grupo de doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania com três manifestações clínicas principais: cutânea, mucocutânea e visceral. No Brasil, a leishmaniose é um importante problema de saúde pública pela alta incidência. O ciclo de vida da Leishmania envolve dois estágios principais de desenvolvimento, o promastigota que está presente no vetor, e o amastigota que é intracelular obrigatório do hospedeiro vertebrado. Este protozoário apresenta um alto grau de promiscuidade em quanto ao tipo de célula hospedeira, já que consegue infectar várias células do sistema imune como neutrófilos, macrófagos e células dendríticas, e também células não fagocíticas profissionais. Além disso, Leishmania pode infectar fibras musculares, como tem sido reportado em trabalhos prévios por meio de analises histológicas. Porém, as características da infecção por Leishmania no músculo têm sido pouco estudadas, o que permitiria estabelecer a importância destas células durante a infecção. O objetivo deste projeto foi avaliar as características biológicas da infecção por promastigotas de L. (L.) amazonensis em células musculares esqueléticas (SkMCs). Para atingir isso, camundongos C57BL/6 e BALB/c foram infectados nas patas traseiras, o musculo Flexor Digitorum Brevis (FDB) foi extraído e processado para coloração com hematoxilina/eosina ou imunohistoquímica. Culturas de SkMCs como mioblastos e miotubos foram infectadas com promastigotas metacíclicos de L. (L.) amazonensis por 72h. As infecções foram caracterizadas por meio de imunofluorescência indireta e microscopia confocal. As culturas de SkMCs foram caracterizadas e padronizadas por médio das proteínas Caveolina-1 e Caveolina-3, também foi medido o Ph dos vacúolos parasitóforos de mioblastos e miotubos com laranja de acridina (AO). Adicionalmente, culturas de SkMCs como miotubos foram pré-tratadas com Streptolisina O (SLO) e/ou infectadas com promastigotas metacíclicos de L. (L.) amazonensis por 72h, com o intuito de esclarecer como ocorre a entrada do parasito nas células musculares. Neste caso foi avaliada a produção de IL-1&#946;, IL-6, IL-10 e NO. Além disso, foi quantificado o mRNA de IL1&#946;, IL-6, iNOS, Ama2, UbH e Lyst. A infecção de células mostrou que L. (L.) amazonensis consegue infectar as fibras musculares in vivo, e também as células musculares esqueléticas (mioblastos e miotubos) in vitro. Além disso, o teste de viabilidade mostrou que L. (L.) amazonensis permanece viável dentro do vacúolo parasitóforo após 72h de infecção. Finalmente, foi observado que o tratamento com SLO pode favorecer a entrada do parasito nas SkMCs, como foi evidenciado pelas diferencias no nível de mRNA entre as células infectadas ou infectadas e tratadas com SLO. Os dados em conjunto sugerem que L. (L.) amazonensis tem a capacidade de infectar as células musculares esqueléticas, dado que consegue entrar nestas células, e permanecer viável dentro do vacúolo parasitóforo. A presença do parasito dentro das células induz uma resposta imune no músculo que pode estar relacionada com os processos de reparo do tecido. A entrada de L. (L.) amazonensis nas células musculares esqueléticas durante a infecção no hospedeiro mamífero é importante devido a sua capacidade de manter o parasito viável. / Leishmaniasis is a group of diseases caused by parasites from genus Leishmania. The main clinical manifestations are cutaneous, mucocutaneus and visceral leishmaniasis. In Brazil, leishmaniasis is an important public health problem because of the high incidence. The Leishmania life cycle has two principal developing stages: promastigote inside the insect vector, and amastigote, an obligate intracellular parasite of vertebrate-host cells. This protozoan is highly promiscuous in host cell type, because it infects different immune cells like neutrophils, macrophages and dendritic cells, and also non-professional phagocytes. Besides, Leishmania might infect muscle fibers, as previous studies suggested from histological analysis. However, the characteristics of Leishmania infection in muscle cells is poorly understood, which is important to understand the role of these cells during the infection. The aim of this study was to characterize the infection process by promastigotes of <i.>L. (L.) amazonensis in skeletal muscle cells (SkMCs). C57BL/6 and BALB/c mice were infected in hind footpads, the Flexor Digitorum Brevis (FDB) muscle was extracted and process to dyed with hematoxylin/eosin or immunohistochemistry. SkMCs as myoblasts and myotubes were infected with metaciclic promastigotes of L. (L.) amazonensis during 72h. The infections were characterized using indirect immunofluorescence and confocal microscopy. SkMCs culture were characterized and standardized through Caveolin-1 and Caveolin-3 proteins, and the pH of parasitophorous vacuoles both in myoblasts and myotubes was measured through acridine orange staining. In order to assess how the parasite invades the cells, myotubes were pretreated with SLO and/or infected with metaciclic promastigotes of L. (L.) amazonensis for 72h. The production of IL-1&#946;, IL-6, IL-10 and NO was quantified, and the mRNA levels of IL-1&#946;, IL-6, iNOS, Ama2, UbH and Lyst. The cell infection showed that L. (L.) amazonensis can infect muscle fibers in vivo, and skeletal muscle cells in vitro. Moreover, viability test showed the parasite remains viable inside the parasitophorous vacuole until 72h of infection. Finally, the SLO treatment can favor parasite entrance in SkMCs, as evidenced by differences in mRNA levels between infected cells or infected and treated with SLO. All data suggest that L. (L.) amazonensis can infect skeletal muscle cells, by entering into the cells, and remaining viable inside the parasitophorous vacuole. The parasite presence inside the muscle cells triggers an immune response that may be related with muscle repair processes. The entrance of L. (L.) amazonensis into SkMCs during infection in a mammal host is important because it contribute with parasite proliferation.

Avaliou-se os efeitos dos ácidos linoleico e oleico na regeneração do músculo gastrocnêmio lacerado em ratos e em mioblastos, miotubos e fibroblastos em cultura. Houve regeneração incompleta e recuperação parcial da função contrátil do músculo lesionado. O ácido linoleico diminuiu a massa, a atividade contrátil, a área de secção tranversa das fibras, aumentou tecido fibroso no músculo lesionado e elevou a expressão de PCNA, colágeno e fibronectina nos fibroblastos. O ácido oleico aboliu as alterações na atividade contrátil e o aumento de tecido fibroso e elevou a expressão de MyoD em mioblastos e desmina em miotubos e reduziu de PCNA, colágeno e fibronectina em fibroblastos. O ácido linoleico comprometeu a regeneração enquanto que o oleico otimizou a capacidade regenerativa e a função contrátil do músculo lesionado. / The effects of linoleic and oleic acids on regeneration of lacerated gastrocnemius muscle in rats and on cultured myoblasts, myotubes and fibroblasts were examined. There was incomplete regeneration and partial recovery of the contractile function of the injured muscle. Linoleic acid reduced the mass, contratile activity and cross-sectional area of the fibers, raised the fibrous area and reduced the expression of PCNA, collagen and fibronectin in fibroblasts. Oleic acid abolished the changes in contratile activity and the increase in the fibrous area, raised the expressions of MyoD in myoblasts, desmin in myotubes and inhibited the expressions of PCNA, collagen and fibronectin in fibroblasts. Linoleic acid impaired regeneration whereas oleic acid optimized the regenerative capacity and contractile function of the injured muscle.

Avaliou-se os efeitos dos ácidos linoleico e oleico na regeneração do músculo gastrocnêmio lacerado em ratos e em mioblastos, miotubos e fibroblastos em cultura. Houve regeneração incompleta e recuperação parcial da função contrátil do músculo lesionado. O ácido linoleico diminuiu a massa, a atividade contrátil, a área de secção tranversa das fibras, aumentou tecido fibroso no músculo lesionado e elevou a expressão de PCNA, colágeno e fibronectina nos fibroblastos. O ácido oleico aboliu as alterações na atividade contrátil e o aumento de tecido fibroso e elevou a expressão de MyoD em mioblastos e desmina em miotubos e reduziu de PCNA, colágeno e fibronectina em fibroblastos. O ácido linoleico comprometeu a regeneração enquanto que o oleico otimizou a capacidade regenerativa e a função contrátil do músculo lesionado. / The effects of linoleic and oleic acids on regeneration of lacerated gastrocnemius muscle in rats and on cultured myoblasts, myotubes and fibroblasts were examined. There was incomplete regeneration and partial recovery of the contractile function of the injured muscle. Linoleic acid reduced the mass, contratile activity and cross-sectional area of the fibers, raised the fibrous area and reduced the expression of PCNA, collagen and fibronectin in fibroblasts. Oleic acid abolished the changes in contratile activity and the increase in the fibrous area, raised the expressions of MyoD in myoblasts, desmin in myotubes and inhibited the expressions of PCNA, collagen and fibronectin in fibroblasts. Linoleic acid impaired regeneration whereas oleic acid optimized the regenerative capacity and contractile function of the injured muscle.

O objetivo deste estudo foi caracterizar a influência da melatonina sobre a atividade de colinoceptores nicotínicos em miotubos de rato em cultura e determinar seu mecanismo de ação. Neste modelo verificamos que a melatonina reduz a densidade de sítios de ligação para ?-bungarotoxina e também a produção de AMP cíclico induzida por forscolina, adenosina e CGRP, mas não por isoprenalina. Estes efeitos foram mimetizados por N-acetilserotonina e 4-P-PDOT, mas não por 2-Iodo-melatonina e 5-MCA-NAT, e foram bloqueados por luzindol. A redução da produção de AMP cíclico não foi inibida por toxina pertussis. O calmidazolium bloqueia tanto a redução da densidade dos colinoceptores nicotínicos quanto a inibição da produção de AMP cíclico. Avaliando a via da guanilil ciclase determinamos que melatonina e calmidazolium inibem a produção de GMP cíclico induzida por KCl. Podemos concluir que a melatonina não está atuando via receptores de membrana, mas provavelmente, está atuando internamente bloqueando a enzima calmodulina. / The objective of this study was characterize the influence of melatonin on the nicotinic-colinoceptors activity in myotube culture from rats and seeks its action mechanism. In this model we demonstrated that melatonin decreases the binding-sites density to ?-bungarotoxin and cyclic AMP synthesis induced by forskolin, adenosine and CGRP, but not by isoprenaline. These effects were mimetized by N-acetylserotonin and 4-P-PDOT, but not by 2-iodomelatonin and 5-MCA-NAT and were blocked by luzindol. Reduction of the cyclic AMP synthesis was not inhibited by pertussis toxin. Calmidazolium blocked both the reduction of nicotinic colinoceptors density and the inhibition of AMP cyclic synthesis. After evaluate the guanylyl cyclase via, we determined that melatonin and calmidazolium inhibit the cyclic GMP synthesis induced by KCl. Then we concluded that melatonin does not act via membrane receptors, but probably, acts blocking the calmodulin enzyme.

O objetivo deste estudo foi caracterizar a influência da melatonina sobre a atividade de colinoceptores nicotínicos em miotubos de rato em cultura e determinar seu mecanismo de ação. Neste modelo verificamos que a melatonina reduz a densidade de sítios de ligação para ?-bungarotoxina e também a produção de AMP cíclico induzida por forscolina, adenosina e CGRP, mas não por isoprenalina. Estes efeitos foram mimetizados por N-acetilserotonina e 4-P-PDOT, mas não por 2-Iodo-melatonina e 5-MCA-NAT, e foram bloqueados por luzindol. A redução da produção de AMP cíclico não foi inibida por toxina pertussis. O calmidazolium bloqueia tanto a redução da densidade dos colinoceptores nicotínicos quanto a inibição da produção de AMP cíclico. Avaliando a via da guanilil ciclase determinamos que melatonina e calmidazolium inibem a produção de GMP cíclico induzida por KCl. Podemos concluir que a melatonina não está atuando via receptores de membrana, mas provavelmente, está atuando internamente bloqueando a enzima calmodulina. / The objective of this study was characterize the influence of melatonin on the nicotinic-colinoceptors activity in myotube culture from rats and seeks its action mechanism. In this model we demonstrated that melatonin decreases the binding-sites density to ?-bungarotoxin and cyclic AMP synthesis induced by forskolin, adenosine and CGRP, but not by isoprenaline. These effects were mimetized by N-acetylserotonin and 4-P-PDOT, but not by 2-iodomelatonin and 5-MCA-NAT and were blocked by luzindol. Reduction of the cyclic AMP synthesis was not inhibited by pertussis toxin. Calmidazolium blocked both the reduction of nicotinic colinoceptors density and the inhibition of AMP cyclic synthesis. After evaluate the guanylyl cyclase via, we determined that melatonin and calmidazolium inhibit the cyclic GMP synthesis induced by KCl. Then we concluded that melatonin does not act via membrane receptors, but probably, acts blocking the calmodulin enzyme.