In the United States, more than 130,000 people will be diagnosed with colorectal cancer (CRC) each year and an estimated 50,000 people will die from the disease. Standard of care (SOC) therapies for CRC combine multiple cytotoxic chemotherapeutic drugs. These combinations have varying degrees of effectiveness and can often result in significant patient morbidity. For second recurrence patients, the multi-kinase inhibitor, regorafenib, is an approved agent, but is often poorly tolerated at current doses. In the current study, we propose to develop therapeutic regime of combining agents with modest toxicity profiles: curcumin and sildenafil with regorafenib. Using clinically achievable enterohepatic drug concentrations (~2.0 μM), our laboratory has shown that both sildenafil and curcumin interact to synergistically down regulate the expression of multiple cyto-protective molecular chaperones and kill CRC cells in a greater than additive manner in vitro and suppress the growth of colon cancer tumors in vivo. In this study, the expression of PDGFRb and PDGF in the plasma was increased in colon tumor bearing mice previously exposed to curcumin and sildenafil. Further, the in vitro killing potential of curcumin and sildenafil was shown to be reduced in evolved tumor cells from these mice. The purpose of this study was to determine whether down regulation of PDGFRb using regorafenib would increase the lethality of curcumin and sildenafil in colorectal cancer cell lines in vitro and in vivo. In the current study, we have shown that with the [2μM curcumin + 2μM sildenafil + 2μM regorafenib] drug combination reduces of cyto-protective proteins, enhances cytotoxicity and creates a carnage of CRC cells in a greater than additive in vitro. The combination also suppressed growth of colon cancer tumors in vivo, when compared to curcumin and sildenafil alone. In addition we have shown that the [2μM curcumin + 2μM sildenafil + 2μM regorafenib] drug combination can modulate immune checkpoint proteins in vitro. These results suggest that this drug combination may enhanced the anti-tumor efficacy of anti-PD-1 and anti-CTLA4 antibodies.

Résumé en Français:Le régorafénib est une des dernières options thérapeutiques pour les patients atteints d’un cancer colorectal chimio-réfractaire de stade avancé (CCRa). Cet inhibiteur de multiples tyrosine kinases n’est pas dépourvu de toxicité ce qui limite son utilisation en dernière ligne chez ces patients dont l’état général est dégradé, alors même que son efficacité n’est pas certaine chez tous les patients. Son mécanisme d'action reste largement inconnu, ce qui rend difficile l'identification de biomarqueurs prédictifs cliniquement utiles. C’est dans ce contexte que se situe ce projet de thèse, dont l’objectif est d’identifier les patients qui pourraient ou pas bénéficier du regorafenib. Pour atteindre cet objectif, nous avons développé à la fois nous avons entamé des projets de recherche translationnelle et mécanistiques.Nos études translationnelles se sont portées sur le monitoring de la réponse thérapeutique dans des biopsies liquides récoltées dans le cadre d’un essai clinique prospectif incluant des patients souffrant d’un CCRa et traités au régorafénib (RegARd-C). Nous avons d’abord confirmé la valeur pronostique de l’ADN libre circulant (ADNlc) avant traitement. De même, nous avons démontré qu'un haut volume tumoral métaboliquement actif avant traitement était associé à un mauvais pronostic. Combinés, ces marqueurs sont restés des prédicteurs de la survie sans progression (SSP) et globale (SG) des patients. Par la suite, nous avons mesuré l’ADN tumoral circulant (ADNtc) en suivant les mutations tumorales pré-identifiées dans le tissu tumoral des patients par séquençage. Nous avons démontré qu’une augmentation de plus de 50% de l’ADNtc après seulement 14 jours de traitement quel que soit le nombre de mutations suivies, indiquait un moins bon pronostic en termes SSP et SG. En outre, nos données suggèrent que ADNtc et ADNlc sont indépendants mais complémentaires dans leur valeur prédictive. Aussi, nous avons mis en évidence le rôle important de l’antigène carbohydrate 19-9 en tant que marqueur pronostique et prédictif précoce de la survie de ces patients.Ayant observé un profil général de résistance chez les patients, nous avons investigué les mécanismes potentiels de résistance intrinsèque et acquise au régorafénib dans des lignées cellulaires représentatives de CCR et avons trouvé différents degrés de résistance intrinsèque dans ces lignées. Nous avons dès lors exploré les mécanismes de résistance au régorafénib dans des cellules que nous avons rendues plus résistantes que les lignées parentales. L’investigation des voies de signalisation des MAPK et de PI3K/AKT a montré que cette dernière est un acteur majeur dans la résistance acquise dans la lignée HCT-116. Une autre observation basée sur des changements morphologiques particuliers des cellules nous a conduits à investiguer en détail un phénotype sénescent induit par le régorafénib, la sénescence étant reconnue comme causant la résistance aux médicaments. A cet égard, le comportement des deux lignées était différent. Les cellules SW480 étaient capables d'acquérir des propriétés de sénescence stables suite à la sécrétion de facteurs favorisant celle-ci ainsi qu’un arrêt du cycle cellulaire. En accord avec le fait que ces cellules tumorales dormantes peuvent avoir un effet positif sur le devenir du patient, tant que celui-ci reste sous traitement, elles pourraient contribuer à la rechute de la maladie dès l’arrêt du traitement. Les cellules HCT-116 quant à elles présentent des propriétés de sénescence à court terme et développent une résistance acquise sous traitement au régorafénib continu via une transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), également associée à une résistance aux médicaments. Ce dernier mécanisme pourrait avoir un effet délétère sur le patient comme l’apparition de sous-clones plus agressifs qui induise la progression de la maladie et assombrit le pronostic.Nous avons également investigué la p-glycoprotéine comme un possible mécanisme de résistance additionnel et avons montré que dans les cellules SW480 traitées au régorafénib, ce dernier serait capable de surmonter la résistance induite par cette protéine. Cependant, une augmentation de l'expression de la p-glycoprotéine n’est observée dans les cellules HCT-116 qu'après une courte exposition au régorafénib et plus dans les cellules traitées en continu.En conclusion, nous avons contribué à une meilleure compréhension des différents mécanismes de résistance au régorafénib dans le CCR. Nous avons indiqué la sénescence, la TEM et probablement la p-glycoprotéine comme acteurs majeurs potentiels; et avons souligné l’hétérogénéité de cette maladie. Est-ce que le régorafénib gagnera-t-il une meilleure place comme traitement efficace dans le CCR ?Notre travail propose plusieurs pistes pour répondre à cette question. / Abstract:Regorafenib is one of the last treatment options for patients with chemo-refractory metastatic colorectal cancer (mCRC), associated with some efficacy but with important toxicities impairing its use in patients with poor general condition. As a multi-targeted tyrosine kinase inhibitor, its mechanism of action remains largely unknown, challenging the identification of clinically useful predictive biomarkers. The ultimate aim of our work was to contribute to the identification of mCRC patients unlikely to benefit from regorafenib. To achieve this objective, we moved from translational to mechanistic studies.Our translational studies focused on therapy response monitoring using liquid biopsies obtained from a prospective clinical trial in mCRC patients treated with regorafenib (RegARd-C trial). We first, confirmed the prognostic value of cell-free DNA (cfDNA) level before treatment. Similarly, we found that high level of pre-treatment metabolically active tumor volume was associated with poor prognosis. When combined, these markers remained predictors of patients’ progression-free (PFS) and overall survival (OS).Then, we measured circulating tumor DNA (ctDNA) based on tumor-specific mutations already identified in patients’ tumor tissue by NGS. We demonstrated that an increasing ctDNA level more than 50% after 14 days of treatment, either based on one or on multiple mutations, is correlated with patients’ clinical outcome in terms of PFS and OS. Furthermore, our data strongly suggested that both baseline cfDNA and ctDNA dynamics are strong complementary predictors of both PFS and OS. Also, we highlighted the leading role of Carbohydrate Antigen 19-9 as a prognostic and early predictive biomarker of mCRC patients’ outcome.Having observed an overall resistance to regorafenib in the majority of patients, we investigated the potential related intrinsic and acquired resistance mechanisms in representative CRC cell lines and found rather different degrees of intrinsic resistance to regorafenib in these cell lines. We then explored potential mechanisms of resistance after short and long-term exposure to regorafenib. The investigation of MAPK and PI3K/AKT pathways pointed to the latter as a major player in acquired resistance.Another observation based on particular cell morphological changes led us to investigate in deep a drug-initiated senescence-like phenotype that is also known to cause drug resistance. SW480 cells were able to acquire stable senescent-like properties, also promoted by a specific senescence-associated secretome, and cell cycle arrest. In line with tumor cell dormancy this phenotype may have a positive impact on patient’s outcome as long as he is under treatment. However, dormant cells contribute to disease recurrence after drug withdrawal. In contrast, HCT-116 cells undergo senescent properties after short exposure and develop acquired resistance triggering EMT, which is also associated with drug resistance. This latter mechanism could be deleterious for the patient as the appearance of more aggressive tumor subclones may induce disease progression and worsen clinical outcome.We also investigated Multi-Drug Resistant protein 1 (MDR1) as a possible additional mechanism of resistance and we found that regorafenib seems to overcome MDR in SW480 treated cells while in HCT-116, an increase of MDR1 expression was observed after short and long exposure compared to parental cells.In conclusion, we contributed to a better understanding of different mechanisms of resistance to regorafenib in CRC. We pointed to cell plasticity such as senescence and EMT in addition to possible MDR as major players; and certainly highlighted the high heterogeneity of the disease. Will regorafenib gain a better place as an efficient drug in CRC? Our work provides some insights for answering this question. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

The cancers of liver, colon and breast are amongst the top five most prevalent and most fatal worldwide. As the Raf/MEK/ERK pathway is frequently deregulated in hepatocellular carcinoma (HCC), sorafenib, a Raf kinase inhibitor, became the first systemic therapy approved for the treatment of patients with HCC. However, sorafenib only produced modest effects with low response rates in the clinic. Similarly, regorafenib, which was approved for the treatment of metastatic colorectal cancer (CRC), has had a poor response rate in the clinic. Since phosphodiesterase type 5 has been reported to be overexpressed in HCC and CRC, we hypothesized that sildenafil, a phosphodiesterase type 5 inhibitor, could enhance the toxicities of sorafenib and regorafenib in HCC and CRC cells, respectively. Our in vitro data indicated that the drugs interacted strongly to kill cancer cells via induction of ER stress, autophagy and apoptosis. In accordance with these findings, our in vivo data demonstrated a significant reduction in tumor growth. The second study in this manuscript was conducted based on the growing body of evidence about the significant contribution of EGFR and JAK/STAT signaling to the breast tumorigenesis. Our preliminary in vitro data demonstrated that the concurrent inhibition of these two pathways by lapatinib, a dual ERBB1/2 inhibitor, and ruxolitinib, a JAK1/2 inhibitor, synergistically killed breast cancer cells of all types, including the resistant triple negative subtype. Our mechanistic studies showed that the combination of ruxolitinib and lapatinib triggered cytotoxic mitophagy, and autophagy-dependent activation of BAX and BAK leading to the mitochondrial dysfunction.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23067号 / 医博第4694号 / 新制||医||1049(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 今中 雄一, 教授 武藤 学, 教授 妹尾 浩 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Le domaine de l'oncologie progresse de manière rapide, surtout depuis l'avènement des thérapies ciblées. Parmi elles, les inhibiteurs de tyrosine kinase multicible (ITK) antiangiogéniques ont fait la preuve de leur efficacité dans plusieurs types de cancers métastatiques. Le sorafenib, le sunitinib, le pazopanib, l'axtinib, et le regorafenib sont aujourd'hui utilisés en pratique courante. Ces premières thérapeutiques ont ouvert la voie au développement de nombreuses autres molécules ciblant d'autres récepteurs TK (crizotinib, céritinib). Les ITK ciblant les récepteurs de l'angiogénèse inhibent des récepteurs membranaires tels que les VEGFR, les PDGFR, les FGFR etc. Ces molécules améliorent généralement survie et/ou survie sans progression dans les essais cliniques pivots mais il existe une grande variabilité interindividuelle en termes de bénéfice clinique. Nous avons cherché à mettre en évidence des biomarqueurs moléculaires prédictifs de la réponse, afin de mieux sélectionner les patients susceptibles de bénéficier de ces ITKs. L'objectif final de ce travail est ainsi de mieux sélectionner les patients candidats à ce traitement, mais il est également médico économique. La part la plus importante de ce travail est axée sur le regorafenib, qui a fait preuve de son efficacité dans les cancers colorectaux métastatiques prétraités et les tumeurs stromales gastro-intestinalesen échec d'imatinib et de sunitinib. Cependant, aucun paramètre clinique ou histologique n'a été identifié pour sélectionner les patients potentiels pouvant bénéficier de ce traitement, ou, à l'inverse pour éviter de traiter les patients chez lesquels la balance bénéfice/risque est défavorable. Ce travail a été réalisé dans le cadre de programme ProfiLER (NCT01774409) en partenariat avec les plateformes de génomique tumorale (Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, Centre Léon Bérard). Cette étude avait pour objectif de tester l'hypothèse que l'ensemble des altérations des gènes codant pour les kinases cibles d'un ITK donné pourrait être associé au bénéfice clinique de ce traitement. Dans notre étude, nous avons observé que les cancers des patients présentant un bénéfice clinique accumulent des gains chromosomiques sur les gènes cibles, et à l'inverse, les cancers des patients nonrépondeurs possèdent plutôt un profil inverse. L'index génomique, un paramètre évaluant l'instabilité chromosomique ne permet pas de différencier les patients répondeurs, mais nous avons mis en évidence que l'accumulation de certains gains sur les gènes cibles est associée à une meilleure survie. Nous avons ainsi proposé un nouveau concept : celui de TTC (Tumor Target Charge), la somme des gains sur les gènes cibles ; et à l'inverse, celui de TTL (Tumor Target Loss), la somme des pertes sur les gènes cibles. En nous appuyant sur ces définitions de TTC et TTL, nous avons généré un algorithme nommé SUMSCAN traduisant donc la somme des gains et des pertes sur les gènes cibles. Le score SUMSCAN a été appliqué à une première cohorte composée essentiellement de patients ayant un cancer colorectal métastatique et traités par regorafenib, ainsi qu'à une 2ème cohorte de validation composée des patients ayant différentes pathologies néoplasiques. Chez les patients ayant un cancer colorectal « moléculairement sélectionné», la médiane de survie sans progression était de 9 mois contre 3 mois dans la cohorte de patients non sélectionnés (X. JIANG et al, Oncotarget, 2015). Nous avons pu montrer que le principe de ce score pronostique pouvait s'appliquer aux autres antiangiogéniques multi-ITKs.. Nous sommes ainsi en cours de validation de ce score pour la prédiction de la survie sur de larges populations de patients présentant divers types tumoraux : sarcome des tissus mous, carcinomes ovariens de haut grade, carcinome rénal carcinome de la thyroïde, etc.) / Small molecule antiangiogenic tyrosine kinase inhibitors (TKI), such as regorafenib, sorafenib, sunitinib, pazopanib, axitinib, and cabozantinib, are active in a variety of advanced cancers, including renal cell carcinoma (RCC), gastrointestinal stromal tumors (GIST), hepatocellular carcinoma (HCC), colorectal cancer (CRC) and thyroid cancers. Predictive criteria for response to these multiple kinase inhibitors (MTKI) are not as well determined as for tumors harboring key driver alterations, such as BCR-ABL translocations in chronic myeloid leukemia (CML), KIT-mutant GIST, BRAF-mutant melanoma, and ALK-positive non-small cell lung cancer among others. Regorafenib, for instance, has been shown to yield a progression-free survival (PFS) improvement in pretreated metastatic colorectal cancer (mCRC) and in imatinib and sunitinib refractory gastrointestinal stromal tumors (GIST). We report that the antitumor activity of MTKIs in tumors lacking a well-defined oncogenic driver is strongly correlated with copy number alterations of genes encoding the protein kinases targeted by these drugs. A concept of tumor target charge (TTC), defined as the total gains of the genes encoding for targets of MTKIs as well as tumor target loss (TTL) was developed, and correlated to response to regorafenib in 2 cohorts of patients composed of mCRC and STS patients. A predictive model, called SUMSCAN, was conceived as a binary classifier to identify patients as either good or poor candidates for use of MTKIs. Moreover, the PFS and OS of patients with a favorable SUMSCAN score were significantly improved. Importantly, SUMSCAN predicted exclusively response to regorafenib, but not the response to conventional chemotherapy in mCRC