Os linfócitos T regulatórios (Tregs) desempenham um papel essencial no controle da tolerância periférica, regulando a homeostase do sistema imune, e, por este motivo, são consideradas a população celular - com fenótipo regulatório - mais importante do sistema imune. Sob estímulos específicos, as Tregs podem ser geradas naturalmente no timo (nTregs), ou serem induzidas na periferia (pTreg) a partir de células T naive. É possível gerar Tregs in vitro (iTreg) a partir de células T CD4+ naive isoladas de sangue de cordão umbilical, suplementando a cultura com TGF-?, atRA e IL-2. Haja vista o grande potencial terapêutico das iTregs, a comunidade científica apresenta grande interesse no entendimento dos mecanismos envolvidos em sua geração. Os mais recentes trabalhos indicam um importante papel da via NF-?B na geração destas células, especialmente no que tange o componente c-Rel. Entretanto, na literatura, não existem dados suficientes sobre a avaliação dos genes potencialmente orquestrados por este fator. Permeado por todo este questionamento, o presente trabalho avalia a interação de c-Rel com as regiões promotoras do genoma, em células T naive e nas células iTregs geradas in vitro. Em adição, também avalia o efeito do silenciamento da proteína c-Rel no perfil de geração das iTregs. Para isso, foi utilizada a metodologia de imunoprecipitação de cromatina atrelada à técnica de PCR em tempo real com primers, que cobrem as regiões promotoras de alguns genes com papel importante na biologia de células T naive e de iTreg. Também foi avaliado a eficiência de transfecção de siRNA contra c-Rel e também do siRNA marcado com molécula fluorescente FITC em conjunto com diferentes concentrações e diferentes reagentes de transfecção, utilizando células Jurkat e T naive. Nossos resultados mostraram uma melhor eficiência de transfecção do siRNA FITC, considerando as células viáveis transfectadas, com os agentes DharmaFECT®1 (22,14%), DharmaFECT®4 (43,14%) e DMRIE-C (27,59%) em células Jurkat e DharmaFECT®1 (16,35%) e DMRIE-C (25,94%) em células T naive, nas maiores concentrações, entretanto não é muito eficiente para a avaliação do silenciamento proteico por qPCR. Além disso demonstramos que em uma pureza média de 80,46% de células Tnaive isoladas obtivemos a geração das iTregs (CD4+CD25+CD127-FOXP3+) com 98,42%, em média, na expressão do marcador FOXP3, e essas células iTregs apresentam maior ligação de cRel aos promotores de genes como IL2RA (CD25) (média de 8,26 vezes), CD69 (3,71 vezes), regiões do gene FOXP3 (região promotora (20,15 vezes), região CNS - kb1 (16,9 vezes), kb2 (17,2 vezes) e kb3 (23,29 vezes)) e do próprio Rel (8,12 vezes). Estes resultados evidenciam os potenciais mecanismos de regulação exercidos por c-Rel, durante o processo de geração das iTregs. / Regulatory T lymphocytes (Tregs) play an essential role in the control of peripheral tolerance, regulating the homeostasis of the immune system, and are considered the cellular population - with regulatory phenotype - most important of the immune system. Tregs can be generated naturally in the thymus (nTregs), or be induced at the periphery (pTreg) from naive T cells, in dependence of specifcs stimuli. In cell culture, supplemented with factors such as IL-2, TGF-? and atRA, it is possible to generate in vitro Tregs (iTreg) from naive CD4 + T cells isolated from umbilical cord blood. Knowing the great therapeutic potential of iTregs, the scientific community has shown great interest in understanding the mechanisms involved in this process. Recent works indicate an important role of the NF-?B pathway in the generation of these cells, especially relating the involvement of the c-Rel componente, however, in the literature, there are not enough data on the evaluation of genes potentially orchestrated by this factor. With all this questioning, this thesis aimed to evaluate the interaction of c-Rel with the some promoter regions of the genome, naive T cells and in vitro generated iTregs cells, in addition, we have also attempted to evaluate the effect of c-Rel protein silencing on the generation profile of iTregs. For this, the methodology of chromatin immunoprecipitation coupled to the real-time PCR technique with primers was used, which cover the promoter regions of some genes with important role in the biology of naive and iTreg T cells, The efficiency of siRNA transfection against c-Rel and also the siRNA labeled with FITC fluorescence molecule in conjunction with different concentrations and different transfection reagentes, using Jurkat and naive T cells, was also evaluated. Our results showed a better transfection efficiency of the FITC siRNA, considering the viable cells transfected with the highest concentrations of the reagents DharmaFECT®1 (22,14%), DharmaFECT®4 (43,14%) e DMRIE-C (27,59%) with Jurkat cells and DharmaFECT®1 (16,35%) e DMRIE-C (25,94%) with naive T cells, however, was not very efficient for the evaluation by qPCR of silencing, that is, the reduction of c-Rel mRNA and RNA of other genes. In addition, we demonstrated that in an average purity of 80.46% of isolated naive T cells we obtained the generation of iTregs (CD4 + CD25 + CD127-FOXP3 +) with 98.42%, on average, in the expression of the FOXP3 marker, and in these iTregs cells, when compared to naive T cells, c-Rel subunit has bound to the promoters of the genes as IL2RA (CD25) (average de 8,26 folds), CD69 (3,71 folds), regions of the FOXP3 gene (promoter region (20,15 folds), CNS regions - kb1 (16,9 folds), kb2 (17,2 folds) and kb3 (23,29 folds)) and c-Rel promoter - Rel (8,12 folds). Our results demonstrate the possible regulatory mechanisms, such as some of the main roles of the c-Rel subunit during the generation process of iTregs.

L’hépatite autoimmune (HAI) est une maladie grave affectant le foie et présentant un haut taux de mortalité lorsque non traitée. Les traitements disponibles sont efficaces, mais de graves effets secondaires leur sont associés. Ces effets secondaires sont généralement le résultat d'une forte immunosuppression et d’autres sont spécifiques à chaque médicament. Aucune immunothérapie spécifique n’est présentement disponible pour le traitement de l’HAI. Récemment, un modèle murin d’HAI a été développé dans notre laboratoire par xénoimmunisation des souris C57BL/6 avec les antigènes humains de l'HAI de type 2. Ce modèle présente la plupart des caractéristiques biochimiques et cliniques retrouvées chez les patients atteints d'HAI de type 2. Dans cette étude, nous avons évaluée l’efficacité de deux types de traitement pour l’HAI de type 2 à l’aide de notre modèle murin. Dans un premier temps, l’anticorps anti-CD3ε a été étudié en prophylaxie et en traitement. Nous avons montré qu’une posologie de 5µg d’anti-CD3 i.v. par jour pendant 5 jours consécutifs induit une rémission chez les souris avec HAI de type 2 établie (traitement). Cette rémission est caractérisée par une normalisation des niveaux d’alanine aminotransférase et une diminution significative de l’inflammation hépatique. Cette rémission semble être associée à une déplétion partielle et transitoire des lymphocytes T CD3+ dans la périphérie et une augmentation des lymphocytes T régulateurs CD4+, CD25+ et Foxp3+ dans le foie. La même posologie lorsqu’elle est appliquée en prophylaxie n’a pas réussi à prévenir l’apparition de l’HAI de type 2. La deuxième voie de traitement consiste en l’administration par voie intranasale d’un forte dose de formiminotransférase cyclodésaminase murin (mFTCD), un autoantigène reconnu dans l’HAI de type 2. Une administration en prophylaxie par voie intranasale de 100µg de mFTCD par jour durant 3 jours consécutifs arrive à prévenir l’HAI de type 2 en diminuant l’inflammation hépatique au bout de deux semaines post-traitement. / Autoimmune hepatitis (AIH) is a severe liver disease with high mortality rates if left untreated. Current treatments, while effective, are associated with deleterious side-effects. These side effects are specific to each drug and the result of broad immunosuppression. Recently, a murine model of type 2 AIH has been created in our laboratory in wild-type naïve mice. In this model, DNA immunization with type 2 AIH human autoantigens breaks immune tolerance and induces an autoimmune response against the liver. Lately, new therapeutic strategies based on depletion of specific immune cell populations have been proposed for the treatment of several diseases, including autoimmune diseases. Currently, no immunotherapies using biological agents are available for the treatment of autoimmune liver diseases. Therefore, the goal of this project is to study the efficacy of new immunotherapeutic agents for the treatment of type 2 AIH in an experimental model. We evaluated the effectiveness of two approaches for treating type 2 AIH. First, we tested the anti-CD3ε antibody in prophylaxis and in treatment of type 2 AIH. We showed that a dosage of 5µg i.v. of anti-CD3ε antibody per day for 5 consecutive days induced remission in mice with established type 2 AIH. This remission was defined as a normalization of serum alanine aminostransferase levels and a significant decrease of liver inflammation in treated mice. This remission seems to be associated with a transitory depletion of CD3+ T lymphocytes in peripheral blood mononuclear cells and increased CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes in the liver. But when this dosage was applied in prophylaxis, it could not prevent the induction of type 2 AIH. The second approach was to induce tolerance by nasal administration of murin formiminotransferase cyclodeaminase (mFTCD), an autoantigen of type 2 AIH. We showed that nasal administration of 100µg of mFTCD for 3 consecutive days prevented development of type 2 AIH in prophylaxis by reducing liver inflammation.

La détection de lymphocytes T (LT) CD8+ infiltrant les tumeurs (TIL), est généralement associée à un bon pronostic chez des patients atteints du cancer. A l’inverse, l'infiltration des tumeurs par des LT CD4+ régulateurs (Treg), est quant à elle, souvent corrélée à un mauvais pronostic. Plusieurs vaccins « thérapeutiques » capables d’induire des réponses T CD8+ spécifiques d’antigènes tumoraux ont été développés. Cependant, à ce jour, les résultats cliniques obtenus par ces vaccins restent décevants. Dans un premier travail, nous avons développé puis testé un vaccin thérapeutique composé de trois longs peptides synthétiques (LSP) dérivés de la protéine survivine (SVX). La survivine est une protéine surexprimée dans la majorité des cancers humains, mais absente dans les tissus adultes sains, ce qui fait d’elle une cible thérapeutique privilégiée pour les vaccins anti-tumoraux. Nous avons démontré l'efficacité thérapeutique élevée du vaccin SVX contre diverses tumeurs murines. Ceci a été associé à l'induction de réponses T spécifiques de la survivine, un prolongement de la survie et la génération de réponses mémoires antitumorales. De plus, SVX a induit à la fois des LT CD8+ cytotoxiques spécifiques et LT CD4+ auxiliaires de type 1 multifonctionnelles, dans la rate et au sein des tumeurs. Il a aussi induit une diminution des Treg, favorisant ainsi une réponse immunitaire très efficace. Enfin, une étude préliminaire menée chez des patients atteints de différents types de cancers, nous a révélé la présence de taux élevés de précurseurs spontanés de LT spécifiques du vaccin SVX. Ces résultats suggèrent que SVX pourrait potentiellement stimuler l'activation de ces précurseurs spécifiques. Ces résultats constituent une preuve de concept pour amener ce vaccin comme un produit de première génération en essai clinique chez l’homme. Dans le but d’étudier plus en détails la cinétique des réponses immunitaires T spécifiques, associées aux vaccins LSP, nous avons étudié dans un second travail, l’efficacité d’un vaccin LSP dérivé de la protéine Ovalbumine (OVA). Nous avons montré dans plusieurs modèles de tumeurs murines, que la combinaison du vaccin LSP-OVA à un adjuvant approprié, induisait une forte régression de la croissance tumorale, l’expansion des cellules spécifiques T CD4+ et T CD8+ dans les organes lymphoïdes, ainsi que leur migration vers les tumeurs. De plus, le vaccin a induit des cellules T spécifiques fonctionnelles, comme le témoignent les niveaux élevés de cytokines cytotoxiques mesurées. De manière intéressante, le vaccin n’a pas induit de Treg spécifiques d’OVA ou de Treg polyclonaux et ce, malgré la présence de la tumeur. Enfin, lorsque LSP-OVA ne parvenait pas à induire une régression complète de la tumeur, celle-ci était infiltrée par des TIL CD4+ conventionnels et CD8+ exprimant fortement les récepteurs inhibiteurs (PD-1, TIM-3 et TIGIT). Nos résultats suggèrent que pour optimiser ce vaccin LSP, une association à des anticorps bloquant un ou plusieurs de ces récepteurs inhibiteurs, devrait être envisagée. / The presence of tumor-infiltrating CD8+ T lymphocytes (TIL) is generally associated with a good prognosis in cancer patients. Conversely, the infiltration of tumors by CD4+ regulators T cells (Treg), is often associated with poor prognosis. Several "therapeutic" vaccines able to induce tumor-specific CD8+ T cell responses have been developed. However, to date, the clinical results of these vaccines remain insufficient. In a first work, we developed and analyzed the immunogenicity and therapeutic efficacy of a new survivin vaccine (SVX) composed of three long synthetic peptides (LSP) containing several CD4 and CD8 T-cell epitopes. Survivin is over-expressed by most human cancers, but absent in healthy adult tissues, making it an interesting therapeutic target for cancer vaccines. We demonstrated the high therapeutic efficacy of SVX vaccine against various established murine tumor models, associated with its capacity to generate both specific cytotoxic CD8+ and multifunctional Th1 CD4+ T-cell responses but also effective memory T-cell responses for long-term protection against relapses. Treatment with SVX vaccine was also found to strongly increase the tumor infiltration of both CD4+ and CD8+ T cells over Treg cells therefore tipping the balance toward a highly efficient immune response. Finally, a preliminary study in patients with different types of cancer revealed the presence of high levels of SVX-specific spontaneous T-cell precursors. This suggests that SVX can potentially stimulate the activation of these specific precursors. Altogether, our results strongly suggest that SVX is a promising cancer vaccine and warrants its further clinical development. In order to study the kinetics of tumor-specific immune responses associated with LSP vaccines, we studied the efficacy of a LSP vaccine derived from the Ovalbumin (OVA) protein. We showed in two tumor models that the combination of LSP-OVA with a suitable adjuvant induced a strong tumor regression, an important expansion of both OVA-specific CD4+ and CD8+ T cells in the lymphoid organs, as well as their migration to the tumor. In addition, the vaccine induced functional specific T cells, as shown by the high levels of cytotoxic cytokines. Interestingly, the vaccine did not induce either OVA-specific or polyclonal Treg, despite the presence of the tumor. Finally, when LSP-OVA failed to induce a complete depletion of the tumor, we observed an important expression of inhibitory receptors (PD-1, TIM-3 and TIGIT) on conventional CD4+ and CD8+ TIL. Our results suggest that to optimize this LSP vaccine, a combination with one or more immune checkpoint blockade agents should be considered.

L’hépatite autoimmune (HAI) est une maladie grave affectant le foie et présentant un haut taux de mortalité lorsque non traitée. Les traitements disponibles sont efficaces, mais de graves effets secondaires leur sont associés. Ces effets secondaires sont généralement le résultat d'une forte immunosuppression et d’autres sont spécifiques à chaque médicament. Aucune immunothérapie spécifique n’est présentement disponible pour le traitement de l’HAI. Récemment, un modèle murin d’HAI a été développé dans notre laboratoire par xénoimmunisation des souris C57BL/6 avec les antigènes humains de l'HAI de type 2. Ce modèle présente la plupart des caractéristiques biochimiques et cliniques retrouvées chez les patients atteints d'HAI de type 2. Dans cette étude, nous avons évaluée l’efficacité de deux types de traitement pour l’HAI de type 2 à l’aide de notre modèle murin. Dans un premier temps, l’anticorps anti-CD3ε a été étudié en prophylaxie et en traitement. Nous avons montré qu’une posologie de 5µg d’anti-CD3 i.v. par jour pendant 5 jours consécutifs induit une rémission chez les souris avec HAI de type 2 établie (traitement). Cette rémission est caractérisée par une normalisation des niveaux d’alanine aminotransférase et une diminution significative de l’inflammation hépatique. Cette rémission semble être associée à une déplétion partielle et transitoire des lymphocytes T CD3+ dans la périphérie et une augmentation des lymphocytes T régulateurs CD4+, CD25+ et Foxp3+ dans le foie. La même posologie lorsqu’elle est appliquée en prophylaxie n’a pas réussi à prévenir l’apparition de l’HAI de type 2. La deuxième voie de traitement consiste en l’administration par voie intranasale d’un forte dose de formiminotransférase cyclodésaminase murin (mFTCD), un autoantigène reconnu dans l’HAI de type 2. Une administration en prophylaxie par voie intranasale de 100µg de mFTCD par jour durant 3 jours consécutifs arrive à prévenir l’HAI de type 2 en diminuant l’inflammation hépatique au bout de deux semaines post-traitement. / Autoimmune hepatitis (AIH) is a severe liver disease with high mortality rates if left untreated. Current treatments, while effective, are associated with deleterious side-effects. These side effects are specific to each drug and the result of broad immunosuppression. Recently, a murine model of type 2 AIH has been created in our laboratory in wild-type naïve mice. In this model, DNA immunization with type 2 AIH human autoantigens breaks immune tolerance and induces an autoimmune response against the liver. Lately, new therapeutic strategies based on depletion of specific immune cell populations have been proposed for the treatment of several diseases, including autoimmune diseases. Currently, no immunotherapies using biological agents are available for the treatment of autoimmune liver diseases. Therefore, the goal of this project is to study the efficacy of new immunotherapeutic agents for the treatment of type 2 AIH in an experimental model. We evaluated the effectiveness of two approaches for treating type 2 AIH. First, we tested the anti-CD3ε antibody in prophylaxis and in treatment of type 2 AIH. We showed that a dosage of 5µg i.v. of anti-CD3ε antibody per day for 5 consecutive days induced remission in mice with established type 2 AIH. This remission was defined as a normalization of serum alanine aminostransferase levels and a significant decrease of liver inflammation in treated mice. This remission seems to be associated with a transitory depletion of CD3+ T lymphocytes in peripheral blood mononuclear cells and increased CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes in the liver. But when this dosage was applied in prophylaxis, it could not prevent the induction of type 2 AIH. The second approach was to induce tolerance by nasal administration of murin formiminotransferase cyclodeaminase (mFTCD), an autoantigen of type 2 AIH. We showed that nasal administration of 100µg of mFTCD for 3 consecutive days prevented development of type 2 AIH in prophylaxis by reducing liver inflammation.