Myasthenia Gravis (MG) is an autoimmune disease affecting neuromuscular transmission, in which the thymus is considered pathogenic organ. Earlier ideas suggesting that MG is only the receptors disease have been proven wrong. There are immunopathological changes in both target structures [specific receptors for acetylcholine (AChR] muscle-specific tyrosine kinase (MuSK) and low-density lipoprotein 4 (Lrp4)], the thymus, as well as in peripheral lymphoid organs. Initial findings of the humoral immunity defect with the decisive role of the pathologic autoantibodies, were corrected with findings of the immune dysregulation at the level of T lymphocytes. According to today's knowledge, the development and maintenance of MG involves almost all cell types of immune function in the autoimmune inflammation: helper CD4+ T lymphocytes, cytotoxic CD8+ T lymphocytes, regulatory CD4+CD25+ T lymphocytes, Th17 lymphocytes, B lymphocytes and plasma cells. Thymus plays a dominant immunopathogenetic role in younger patients with MG, while extrathymic mechanisms are applied in older patients. As a result of that, the thymectomy (TE) is generally accepted as part of treatment for MG. However, there is still no data verified by a prospective controlled study, which would demonstrate a useful result of this treatment...

Le syndrome d'Evans est défini par l'existence concomitante ou séquentielle de cytopénies auto-immunes, le plus souvent, anémie hémolytique et thrombopénie immunologique. Chez l'enfant, il peut être secondaire à une infection, une maladie auto-immune systémique ou un déficit immunitaire primitif. Alternativement, chez une grande partie des patients, l'étiologie n'est pas clairement identifiée. Les patients atteints de syndrome d'Evans présentent parfois d'autres atteintes, telles une auto-immunité d'organe, une lymphoprolifération bénigne ou un déficit immunitaire. L'objectif de ce travail était d'identifier des causes génétiques chez des enfants présentant un syndrome d'Evans sans étiologie sous-jacente identifiée. Nous avons centré notre étude sur des formes sévères à début pédiatrique en faisant l'hypothèse qu'une maladie monogénique serait plus fréquente dans ce groupe de patients. Nous avons mis à profit les technologies de séquençage haut débit « nouvelle génération » (NGS) pour réaliser et analyser le séquençage de l'exome de patients et de certains de leurs apparentés afin de mettre en évidence des gènes candidats potentiels. Ce travail a permis l'identification de 4 gènes candidats : LRBA, CTLA-4, STAT3 (mutations gain de fonction) et NFKBIA. L'implication des 3 premiers gènes dans de nouvelles maladies monogéniques où l'auto-immunité est au premier plan a été confirmée par d'autres équipes au cours de ce travail. Pour chacun de ces gènes, nous avons poursuivi 2 objectifs complémentaires : d'une part, tenter de valider l'implication des gènes identifiés dans la maladie des patients. Nous avons pour cela utilisé des approches et techniques variées : biochimie et protéomique afin d'identifier des partenaires protéiques, microscopie confocale pour localiser les protéines et leurs interactions, tests cellulaires in vitro pour mettre en évidence un défaut fonctionnel, marquages en cytométrie en flux pour identifier des modifications dans les sous-populations lymphocytaires. D'autre part, nous avons recherché d'autres mutations de ces gènes chez des patients de phénotype clinique similaire. Nous avons ainsi constitué et exploré 3 cohortes de patients présentant des mutations de LRBA, CTLA-4 ou STAT3. Nous avons rassemblé une cohorte de 18 patients porteurs d'une mutation de LRBA, répartis dans 11 familles. Cela nous a permis de préciser et d'étendre le spectre clinique de cette maladie de découverte récente, avec en particulier des atteintes articulaires sévères s'associant à un diabète précoce, ou des entéropathies. Nous avons identifié 15 nouvelles mutations de transmission autosomique récessive dans le gène LRBA, codant une protéine de fonction inconnue dont l'absence entraine une maladie principalement caractérisée par une poly-auto-immunité. Nous avons identifié 29 partenaires protéiques potentiels de LRBA et précisé la localisation de LRBA dans les différents compartiments cellulaires. Nous avons également établi une cohorte de 12 patients dans 10 familles présentant un déficit en CTLA-4 par haplo-insuffisance. Au delà de la mise en évidence de 9 nouvelles mutations, nous avons décrit une famille où la variation est transmise de façon autosomique récessive. Dans les déficits en LRBA et CTLA-4, nous avons mis en évidence une diminution du pourcentage de lymphocytes T régulateurs parmi les PBMC et une diminution de l'expression de CTLA-4 dans les lymphocytes T activés. Ceci corrobore l'interaction entre ces 2 protéines décrite en parallèle par une autre équipe. Nous avons montré que les spectres cliniques des déficits en LRBA et CTLA-4, fortement chevauchant dans les premières descriptions publiées, pourraient se différencier, malgré l'implication des lymphocytes T régulateurs dans ces 2 maladies. (...) / Evans syndrome is defined by the occurence of autoimmune cytopenias, either at the same time or sequential, mainly autoimmune hemolytic anemia and immune thrombocytopenia. In children, it may be secondary to infections, systemic autoimmune disease, or primary immune deficiency, though in most patients, its etiology isn't obvious. Patients affected with Evans syndrome can also present other features, such as autoimmunity toward a particular organ, benign lymphoproliferation or immunodeficiency. The main goal of this work was to identify genetic causes in children presenting an Evans syndrome without a known underlying etiology. We focused our study on severe, early onset forms of the disease, with the hypothesis that a monogenic disease would be more frequent in this group of patients. Taking advantage of high throughput "Next Generation" sequencing (NGS) techniques, we sequenced and analyzed exome from patients and their relatives in search for adequate candidate genes. We identified 4 candidate genes: LRBA, CTLA-4, STAT3 (gain-of-function mutations), and NFKBA. Implication of the first 3 genes in new monogenic diseases with autoimmunity as a key feature was also confirmed by others during the course of this work. For each gene, we pursued 2 complementary goals: First, we sought to validate the implication of the gene in the patients' disease. To do so, we used various techniques and approaches: biochemistry and proteomics to identify protein partners, confocal microscopy to localize proteins and interactions, in vitro cellular assays to bring to light functional defect, flow cytometry to identify changes in lymphocytes subpopulations. We also looked for other mutations of each gene in patients with a similar clinical presentation. Hence we created and explored 3 cohorts of patients presenting with mutations of LRBA, CTLA-4 or STAT3. We constituted a cohort of 18 patients with LRBA mutations within 11 families. We then were able to precise and extend the clinical spectrum of this recently described disease. In particular, we observed patients with severe chronic arthritis associated with diabetes mellitus or enteropathies. We identified 15 new mutations of autosomal recessive transmission in the LRBA gene, coding a protein of unknown function, which absence is responsible for a disease mainly characterized by autoimmune features. We identified 29 candidate protein partners of LRBA and precized LRBA localisation in cell compartiments. We also established a cohort of 12 patients within 10 families presenting CTLA-4 haploinsufficiency. Beyond describing 9 new mutations, we report a family with autosomal recessive transmission.In LRBA and CTLA-4 deficiencies, we showed a decrease of regulatory T lymphocyte subset proportion among PBMC and a decrease of CTLA-4 expression in activated T cells. These results support the interaction between these 2 proteins, described concurrently by another team. We showed that the clinical spectra of these 2 diseases, although widely overlapping in first published reports, could be different despite a role of regulatory T cells in both. Hence, organ-specific autoimmunity and lymphoproliferation are more frequent in LRBA deficiency whereas granuloma and hypogammaglobulinemia are more present in CTLA-4 deficiency. Theses results suggests a role of genetic modifyers, which remain to identify. Among our cohort of patients with Evans syndrome, we also identified 5 patients within 5 families presenting gain-of-function mutations of STAT3. 3 of those mutations were reported by others during our work and appeared de novo in our patients. Functional validation of the 4th one is in progress. The last mutation follows a recessive transmission and could exemplify a new transmission modality of this disease. (...)

Introduction: L’activation des cellules stellaires hépatiques (CSHs) est un point clé du processus de fibrose hépatique. Les lymphocytes T CD4+ intra-hépatiques sont une source majeure de cytokines anti-inflammatoires comme l’IL-10 et pro-inflammatoire (IL-17A), hépatoprotectrice (IL-22) produites par les Th17. Les Th17 sont impliqués dans de nombreuses pathologies inflammatoires mais l’effet de ces cellules sur les CSHs n’est pas encore élucidé. Objectif: Comprendre le rôle des cytokines de type Th17 dans le processus d’activation des CSHs. Méthodes: La lignée de CSHs humaine LX2 a été stimulée par l’IL-17A ou l’IL-22 puis comparée à des cellules traitées par le TGF-b et le tampon phosphate salin (PBS). L’activation des CSHs a été évaluée en examinant les molécules profibrotique alpha-smooth muscle actin (a-SMA), collagène de type I (COL1A1) et inhibiteur produits par les tissus des métalloprotéases matricielles I (TIMP-I) par q-PCR. L’expression protéique a été validée par immunobuvardage ou coloration au rouge de picro Sirius. L’expression membranaire de l’IL-10Rb, du TGF-b-RII et de l’IL-17RA a été mesurée par cytométrie en flux. Résultats: L’IL-17A et l’IL-22 n’activent pas les cellules LX2, car aucune induction d’a-SMA, de COL1A1 et de TIMP-I n’a été observée. Cependant, l’IL-17A et l’IL-22 sensibilisent les CSHs à l’action du TGF-b, tel que démontré par une forte expression et production d’a-SMA, collagène type I et TIMP-I. L’IL-17A, mais pas l’IL-22, induit la surexpression à la surface cellulaire du TGF-b-RII et inhibe partiellement la baisse d’expression du TGF--RII après stimulation au TGF-b. Conclusion: Nos résultats démontrent une fonction pro-fibrotique de l’IL-17A et de l’IL-22, car les deux cytokines sensibilisent les CSHs à l’action du TGF-b. L’IL-17A agit via la surexpression et la stabilisation du TGF-b-RII tandis que l’IL-22 agit probablement par des mécanismes intracellulaires. / Background: Activated hepatic stellate cells (HSCs) are key initiators of the fibrogenic process. Intrahepatic CD4+ T cells are major producers of hepatoprotective cytokines such as IL-10 produced by regulatory T cells (Tregs) or inflammatory and regulatory cytokines like IL-17 and IL-22 produced by Th17 cells. Th17 cells have been implicated in various conditions or liver damage but the mechanism of action of Th17 cytokines on HSC is still poorly understood. Aims: To understand the role of the different Th17 cytokines (IL17-A and IL-22) in modulating HSC activation. Methods: The HSC line LX2 was stimulated with increasing doses of IL-17A or IL-22, and compared to TGF-b and PBS-treated cells. Activation of HSCs was evaluated by examining the expression of the pro-fibrotic molecules alpha-smooth muscle actin (a-SMA), collagen type I (COL1A1) and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase I (TIMP-I) by q-PCR. Protein expression was validated by either western blot or picro Sirius red stain. Cell surface expression of the cytokine receptors IL-10Rb, TGF-b-RII and IL-17RA was evaluated by flow cytometry. Results: IL-17A and IL-22 alone did not induce LX2 activation, as no induction of a-SMA, COL1A1 and TIMP-I was observed. However, both IL-17A and IL-22 sensitized HSCs to the action of suboptimal doses of TGF-b, confirmed by strong a-SMA, collagen type I and TIMP-I gene expression and protein production. IL-17A but not IL-22 upregulated TGF-b-RII cell surface expression and partially inhibited TGF-b-RII downmodulation upon TGF-b stimulation. Conclusion: Our results demonstrated a pro-fibrotic function for IL-17A and IL-22, as both cytokines sensitize HSC to the action of TGF-b. IL-17A acts through upregulation and stabilization of the TGF-b-RII while IL-22 probably acts through an intracellular mechanism.

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