In der vorliegenden prospektiven Studie wurde der postoperative Krankheitsverlauf von 93 Hündinnen mit Mammatumoren untersucht. Ziel der Studie war es, eine präoperative Einschätzung der Dignität der Tumoren und der Prognose für die Hündin anhand der Relaxin-Plasmakonzentration zu gewinnen. In einer humanmedizinischen Studie konnte gezeigt werden, dass an Brustkrebs erkrankte Frauen mit einer hohen Relaxin-Plasmakonzentration häufiger an einem malignen Tumor erkrankt sind, der Tumor häufiger bereits metastasiert hatte und die Frauen früher starben. Der Kastrationsstatus (p = 0,132), eine hormonelle Läufigkeitsunterdrückung (p = 0,960), vorausgegangene Graviditäten (p = 0,780) und das Auftreten von Pseudograviditäten (p = 0,138) bei den an Mammatumoren erkrankten Hündinnen hatten keinen Einfluss auf die präoperativ bestimmte Relaxin-Plasmakonzentration. An Mammatumoren erkrankte Hündinnen und gesunde Kontrolltiere hatten keine unterschiedlichen Relaxin-Plasmakonzentrationen (p = 0,813). Die Relaxin-Plasma-konzentrationen von Hündinnen mit einer Herzerkrankung aus der Patientengruppe waren identisch mit denen der herzgesunden Hündinnen aus der Kontrollgruppe (p = 0,328). Innerhalb der Patientengruppe war es hinsichtlich der gemessenen Relaxin-Plasmakonzentration unerheblich, ob die Hündinnen einerseits an einem solitären oder an multiplen Mammatumoren erkrankt waren (p = 0,470), oder ob andererseits bei ihnen einseitig oder beidseitig Mammatumoren feststellbar waren (p = 0,371). Weder die Tumorgröße (p = 0,518) noch eine Ulzeration (p = 0,746) wirkten sich auf die Relaxin-Plasmakonzentration aus. Das Vorliegen von Nahmetastasen (p = 0,131) oder eines malignen Mammatumors (p = 0,240) führte zu keiner erhöhten Relaxin-Plasmakonzentration. Entsprechend war auch das Stadium der Erkrankung ohne Einfluss auf das gemessene Relaxin (p = 0,829). Im Rahmen der Verlaufsuntersuchung gab es keinen Unterschied zwischen den präoperativ und den sechs Monate postoperativ bestimmten Relaxin-Plasmakonzentrationen (p = 0,983). Weder eine Rezidivierung des Mammatumors (p = 0,084) noch eine Metastasierung des Tumors in die Lunge sechs Monate postoperativ (p = 0,200) waren anhand der präoperativ bestimmten Relaxin-Plasmakonzentrationen vorhersehbar. Auch lieferte Relaxin keinen Hinweis auf einen Tod infolge der Mammatumoren (p = 0,205). In dieser Arbeit konnte nach Auswertung der vorliegenden Daten kein Hinweis auf die Verwendbarkeit der Relaxin-Plasmakonzentration als prognostischer Marker für an Mammatumoren erkrankte Hündinnen gefunden werden. Es konnte, wie in vorherigen Studien, bestätigt werden, dass Hündinnen mit Tumoren kleiner 3 cm (p = 0,001) und Hündinnen im Stadium I der Erkrankung (p = 0,009, p = 0,022) eine signifikant niedrigere Wahrscheinlichkeit haben innerhalb des ersten Jahres postoperativ an den Folgen des Mammatumors zu versterben als Hündinnen mit größeren Tumoren oder in einem höheren Stadium der Erkrankung. Hündinnen, die an einem ulzerierenden Mammatumor erkrankt waren (p = 0,002) oder bei denen histopathologisch nachweisbare Metastasen in den regionären Lymphknoten vorlagen (p = 0,001), hatten eine signifikant niedrigere Wahrscheinlichkeit das erste postoperative Jahr zu überleben. Die Tiere, bei denen sechs Monate postoperativ Metastasen in der Lunge festgestellt werden konnten (p = 0,001) oder bei denen es zu einer Rezidivierung des Mammatumors kam (p = 0,001), hatten eine sehr hohe Wahrscheinlichkeit innerhalb des ersten postoperativen Jahres zu versterben.

Relaxin is a small peptide hormone that has demonstrated potential therapeutic actions for cardiovascular disease and fibrosis. Additionally, relaxin has demonstrated the ability to protect the heart from injuries caused by ischemia and reperfusion, promote the healing of ischemic ulcers, and counteract allergic responses. The objective of this research was to express fully processed porcine relaxin in transgenic tobacco plants, as an alternative to current methods of producing relaxin. Two recombinant relaxin genes were constructed that contained the patatin signal peptide cDNA fused in frame to prorelaxin cDNA, which was codon-optimized for expression in Nicotiana tabacum, under the control of either the "super" promoter or the dual enhanced cauliflower mosaic virus 35S promoter. Eighteen transgenic tobacco plants were generated that were transformed with the above recombinant genes. Preprorelaxin, mRNA was detected in 12 of the transgenic plants. Fully processed relaxin protein was not found in any tobacco plants that had demonstrated gene expression by northern blot analysis. Preprorelaxin was only identified in extracts from transgenic plants that contained the insoluble protein fraction, as determined by western blot analysis. Additionally, an increased yield of preprorelaxin was identified after incubation of tobacco leaves in an ubiquitin inhibitor. / Master of Science

Introduction: Hepatorenal syndrome (HRS) is a common complication of advanced cirrhosis with a high mortality rate and limited treatment options. Central to its pathogenesis is severe, but potentially reversible, renal vasoconstriction leading to functional renal failure. Current pharmacological treatment using splanchnic vasoconstrictors is suboptimal and prognosis without liver transplantation is dismal. The peptide hormone relaxin (RLN) mediates haemodynamic adaptations to pregnancy including increased renal blood flow (RBF) and glomerular filtration rate (GFR). I hypothesised that exogenous RLN could be used therapeutically to improve RBF and renal function in the context of experimental cirrhosis and HRS. Methods: To address this I generated pathologically distinct rat models of liver cirrhosis with features of human HRS including renal vasoconstriction and renal failure. Compensated cirrhosis was induced in male rats by 16 weeks of i.p. carbon tetrachloride (CCl4) and decompensated cirrhosis by bile duct ligation (BDL). I studied the effects of acute i.v. or sustained (72 hr) s.c. infusion of RLN compared with vehicle on systemic haemodynamics, RBF, GFR and kidney histology. I used blood oxygen dependent-magnetic resonance imaging (BOLD-MRI) to detect changes in kidney parenchymal oxygenation and Doppler ultrasound to monitor changes in RBF (velocity time integral, VTI) and renal arterial resistance (resistive index, RI). Hepatic and renal expression of the relaxin receptor RXFP1 was determined by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and immunohistochemistry (IHC). Vascular functional responses in isolated renal arteries were assessed by wire myography. Relaxin mediated changes in key vaso-regulatory signalling pathways in the kidney and renal vessels were analysed by qPCR, IHC and ELISA. Results: I showed using in vitro myography that the pathophysiological mechanism that underlies renal vasoconstriction in experimental cirrhosis models is an impairment of endothelium-dependent vasodilatation. Selective targeting of renal vasoconstriction using relaxin improved renal blood flow, tissue oxygenation, and normalized glomerular filtration rate in both compensated and decompensated rat cirrhosis. Furthermore, relaxin treatment restored endothelium-dependent vasodilation in isolated renal vessels from CCl4 cirrhotic rats. Relaxin-induced effects on renal blood flow and glomerular filtration rate were mediated though activation of the AKT/eNOS/nitric oxide signalling pathway in kidney, though systemic nitric oxide levels were unaffected. Crucially for human translation, relaxin did not reduce mean arterial blood pressure even in advanced cirrhosis. Conclusion: My findings identify relaxin as the first potential targeted treatment reversing the vascular dysfunction which causes HRS and directly improving renal function in HRS. Clinical translation in carefully selected populations is warranted.

Die heute in der Krebstherapie vorherrschenden konventionellen Therapiemethoden weisen Defizite bezüglich ihrer Wirksamkeit auf und rufen oftmals gravierende Nebenwirkungen hervor. Eine Alternative für die Behandlung von Tumoren ist der Einsatz onkolytischer Viren. Um einen erfolgreichen klinischen Einsatz onkolytischer Viren zu ermöglichen, ist eine Verstärkung von deren Wirksamkeit durch die Insertion therapeutischer Gene wünschenswert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte der Abbau von Proteinen der extrazellulären Matrix durch die Insertion des Relaxin- oder Matrixmetalloproteinase 9-Gens (MMP-9) in das Vaccinia-Virus Genom erreicht und dadurch die Virusausbreitung im Tumorgewebe erleichtert werden. Hierfür wurden die rekombinanten Vaccinia-Viren GLV-1h169, codierend für das Hormon Relaxin und GLV-1h255, codierend für das Enzym MMP-9, eingesetzt. Es wurde analysiert, ob die Expression dieser Proteine zu einem Abbau von Matrixproteinen führt, dies die Virusausbreitung erleichtert und die Lyse infizierter Tumorzellen gegenüber dem parentalen Virus GLV-1h68 verstärkt. GLV-1h169 wurde in DU145-, PC3- und C33A-Tumor-tragende Mäuse injiziert und die Wirkung des viral-codierten Relaxins auf die extrazelluläre Matrix und die virale Ausbreitung im Tumorgewebe analysiert. In Zellkultur-Experimenten wurde ermittelt, dass die Insertion des Relaxin-Gens in das GLV-1h169-Genom das Replikationsverhalten in DU145-Zellen gegenüber dem des parentalen Virus GLV-1h68 nicht negativ beeinflusst. In DU145-, PC3- und C33A-Tumorschnitten konnte eine Expression von Relaxin in GLV-1h169-infizierten Bereichen nachgewiesen werden. Die Expression von Relaxin soll durch die Aktivierung des Relaxin-Signalweges zur Translation von MMP-9 führen. Das Enzym wird von infizierten Zellen sezerniert und spaltet Proteine der extrazellulären Matrix. Der Gehalt der MMP-9 Substrate Collagen IV und Laminin in GLV-1h169 behandelten DU145- und C33A-Tumoren wurde analysiert und mit jenem in GLV-1h68- und PBS- behandelten Tumoren verglichen. In Virus-behandelten DU145-Tumoren zeigte sich im Vergleich mit PBS-behandelten Tumoren ein signifikant verringerter Collagen IV- und Laminingehalt. Weiterhin war der Collagen IV-Gehalt in GLV-1h169 infizierten Tumoren signifikant niedriger als in GLV-1h68 infizierten. Dies führte jedoch nicht zu einer Erhöhung des Virustiters und nicht zu einer verbesserten Virusausbreitung. GLV-1h68- und GLV-1h169-infizierte Tumore zeigten gegenüber PBS-behandelten Tumoren eine starke Regression. Die GLV-1h169-vermittelte Relaxin-Expression führte jedoch nicht zu einer weiteren Verstärkung der Tumorregression. In Virus-behandelten C33A-Tumoren wurde eine signifikante Erhöhung des Collagen IV- und Laminingehalts gegenüber PBS-behandelten Tumoren nachgewiesen. Dies könnte durch eine Virus-induzierte Inflammationsreaktion hervorgerufen werden, die eine Fibroblasten-vermittelte Collagenablagerung nach sich zieht. Das MMP-9 Expressionsle-vel war in Virus-behandelten Tumoren gegenüber PBS-behandelten signifikant erhöht, jedoch bewirkte die GLV-1h169-vermittelte Expression von Relaxin keine zusätzliche MMP-9 Expression. In Tumorrandbereichen erfolgte eine Expression von Relaxin und MMP-9, im Tumorinneren jedoch nur eine Expression von Relaxin. Hingegen wurde eine Korrelation zwischen der MMP-9-Expression und der Präsenz MHC II-positiver Zellen beobachtet. Diese Zellen migrieren von außen in das Tumorgewebe und exprimieren dort MMP-9. Bei der Analyse der Virustiter und –ausbreitung im Tumorgewebe zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen GLV-1h68- und GLV-1h169-injizierten Tieren. Die Injektion von beiden onkolytischen Viren in C33A-Tumor-tragende Mäuse führte zu einer starken Tumorregression. Diese wurde jedoch nicht durch die GLV-1h169-vermittelte Relaxin-Expression beeinflusst. Da die Aktivierung des Relaxin-Signalweges zu einer Expression des vascular endothelial growth factors (VEGF) führen kann, welcher die Angiogenese stimuliert, wurde die Blutgefäßdichte in C33A-Tumoren ermittelt. Die Expression von Relaxin führte nicht zu einer erhöhten Blutgefäßdichte. Die Basalmembran von Blutgefäßen enthält Collagen IV, deshalb wurde untersucht, ob die Relaxin-Expression eine erhöhte Permeabilität der Gefäße bewirkt. In den Virus-behandelten Tumoren zeigte sich eine gegenüber PBS-behandelten Tumoren signifikant erhöhte Gefäß-Permeabilität, jedoch bewirkte die Expression von Relaxin keine weitere Erhöhung der Gefäß-Permeabilität... / The currently dominating conventional cancer therapy methods are facing limitations regarding their efficacy and often cause severe side effects. An alternative for the treatment of tumors is the use of oncolytic viruses. To ensure a successful clinical application of oncolytic viruses, an enhanced efficacy by the insertion of therapeutic genes is desirable. In the scope of this thesis, a degradation of extracellular matrix proteins should be achieved by the insertion of the relaxin or matrix metalloproteinase 9 gene into the vaccinia virus genome, facilitating increased viral spreading in the tumor tissue. To this end, the recombinant vaccinia viruses GLV-1h169, encoding the hormone relaxin and GLV-1h255, encoding the enzyme MMP-9 were used. It was analyzed whether the expression of these proteins causes a degradation of matrix proteins and leads to an increased viral spreading and an enhanced lysis of infected tumor cells, when compared to the parental virus GLV-1h68. DU145, PC3 and C33A tumor-bearing mice, respectively, were injected with GLV-1h169 and the effect of virus-encoded relaxin on the extracellular matrix and viral spreading inside the tumor mass was analyzed. Tissue culture experiments confirmed that the inser-tion of the relaxin gene into the GLV-1h169 genome does not negatively influence the virus replication in DU145 cells when compared to that of the parental virus GLV-1h68. An expression of relaxin in GLV-1h169-infected tumor areas in DU145, PC3 and C33A tumor sections was shown. The expression of relaxin should activate the relaxin pathway, inducing the translation of MMP-9. The enzyme is secreted by infected cells and cleaves proteins of the extracellular matrix. The content of the MMP-9 substrates collagen IV and laminin in GLV-1h169-treated DU145 and C33A tumors was analyzed and compared to that of GLV-1h68- and PBS-treated tumors. Virus-treated tumors showed a significantly lower collagen IV and laminin content than those treated with PBS. Furthermore, the collagen IV content in GLV-1h169-treated tumors was significantly lower than in those treated with GLV-1h68. This did not lead to higher virus titers or to an enhanced virus spreading. Compared to PBS-treated tumors, those infected with GLV-1h68 or GLV-1h169 regressed significantly. The GLV-1h169-mediated relaxin expression did not further enhance tumor regression. Virus-treated C33A tumors showed a significantly increased collagen IV and laminin con-tent compared to those treated with PBS. This could be due to a virus-induced inflamma-tion, leading to a fibroblast-mediated collagen deposition. The MMP-9 expression level in virus-treated tumors was significantly higher than in those treated with PBS. However, the GLV-1h169-mediated expression of relaxin did not further increase MMP-9 expression. In outer tumor areas relaxin and MMP-9 were expressed, in inner tumor areas only relaxin was expressed. In contrast, a correlation between the expression of MMP-9 and the presence of MHC II-positive cells was observed. These cells migrate from the outside into the tumor tissue where they express MMP-9. The analysis of virus titers and spreading inside the tumor mass revealed no significant differences between GLV-1h68- and GLV-1h169-injected mice. The injection of both oncolytic viruses led to a pronounced tumor regression, which was not further enhanced by the GLV-1h169-mediated expression of relaxin...

The hormone relaxin regulates the release of the magnocellular hormones, oxytocin and vasopressin, from the central nervous system. Studies have yet to determine whether relaxin regulates magnocellular hormone release through the circumventricular organs alone, or whether relaxin can act on the brain regions containing the magnocellular neurons as well. The paraventricular nucleus of the hypothalamus was isolated from other brain regions and maintained in vitro, in order evaluate the effects of the relaxin and relaxin-3 on the somatodendritic release of oxytocin and vasopressin. At 50 nM concentrations, relaxin induced oxytocin release, while relaxin-3 inhibited oxytocin release. Neither relaxin nor relaxin-3 had an effect on the vasopressin release, however the RXFP3 specific agonist, R3/I5, induced vasopressin release. The effect of the relaxin peptides on the electrical activity of neurons in the paraventricular nucleus was also evaluated. Relaxin depolarized magnocellular neurons while relaxin-3 hyperpolarized the neurons. Relaxin and relaxin-3 appear to have differential effects on the magnocellular neurons of the paraventricular nucleus.

Thesis (Ph.D.)--University of Melbourne, Howard Florey Institute, Dept. of Biochemistry and Molecular Biology, 2007. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 179-185).

Universiẗat, Diss., 2004--Leipzig.

Connective tissue remodeling is an important area of study in biomedical engineering with respect to cancer and wound healing. Tissue remodeling components may be involved in the pathogenesis of open-angle glaucoma. Risk factors for open angle glaucoma include increased intraocular pressure (IOP), male gender, and advanced age. In a 1963 study, the hormone relaxin decreased IOP in the human eye through a mechanism that may involve the up-regulation of tissue remodeling matrix metalloproteinases (MMPs). The effects of age and gender on MMP and protein activity in porcine aqueous humor were determined in this study to identify correlations existing between MMP activity and glaucoma risk factors. Gelatin zymography identified MMPs at 66 kD and approximately 105 kD. The concentration of the 66 kD band compared to human MMP-2 standard was 0.22 ± 0.06 ng/ml for the adult female (AF) samples and 0.28 ± 0.04 ng/ml for the juvenile samples. This difference in concentration was statistically significant (p < 0.05). The concentration of the protease migrating to 66 kD was statistically independent of gender. Casein zymograms identified two non-MMP proteinases at 51 kD and 80 kD. The average total protein concentration for all aqueous humor samples was 2.54 ± 0.89 mg/ml. The mean IgG, transferrin, and albumin concentrations for all aqueous humor samples was 11.4 ± 4.2 mg/ml, 17.11 ± 6.8 mg/ml, and 78.0 ± 26.3 mg/ml respectively. Results from these experiments establish baseline levels of MMP and protein activity, allowing for identification of potential changes caused by relaxin in tissue culture studies. / Master of Science

Abstract not available

INTRODUCTION: Arthrofibrosis, which occurs in a substantial portion of the population, is a pathologic accumulation of scar tissue that presents in patients as a painful decrease in joint range of motion. Since an individual’s quality of life can be significantly impacted by arthrofibrosis and because there are limitations in current treatments, this thesis focuses on examining the use of the hormone relaxin to alleviate shoulder arthrofibrosis. METHODS: A set of 20 Sprague Dawley rats were given secondary shoulder contractures and separated into groups to examine the efficacy of relaxin using intravenous delivery, intra-articular delivery, and different treatment frequencies. The differences across groups were examined through mechanical range of motion testing as well as histologic sampling. RESULTS: Multiple doses of intra-articular injections of relaxin showed a complete return to the normal range of motion (P < 0.01) when compared with the surgical control, whereas other delivery methods and frequencies failed to show meaningful improvements. This was further confirmed in histologic analysis through the lack of fibrotic adhesions within the capsular space after multiple intra-articular relaxin treatments when compared with the surgical control. DISCUSSION: Although significant improvements to range of motion were seen after multiple doses of intra-articular relaxin, potential tissue degradation was also observed within the joint space after histologic examination. Further research is necessary to fully understand the proper dosing needed to avoid potential negative side effects caused by excess use of relaxin.