Submitted by Edineia Teixeira (edineia.teixeira@unioeste.br) on 2017-09-05T14:43:57Z No. of bitstreams: 2 Bruna_Tavares2017.pdf: 2153442 bytes, checksum: ea6c6cfdeca0f49e80dfdd1246cc0ea3 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-05T14:43:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Bruna_Tavares2017.pdf: 2153442 bytes, checksum: ea6c6cfdeca0f49e80dfdd1246cc0ea3 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Kluyveromyces marxianus yeast has been arousing importance in the Biotechnology area due to its high metabolic diversity and high degree of polymorphism. Its potentialities have been under study for several applications such as enzymes production of great interest in the food industry such as β-galactosidases, β-glucosidase and polygalactosidase, in the production of aromatic compounds and higher alcohols such as phenyl ethanol, also in biorefineries to produce the second generation ethanol. This yeast has great interest due to bioethanol production and its ability on assimilating different carbohydrates from lignocellulosic biomass as well as its broad spectrum of thermotolerance. Cellulosic ethanol has been presented as a possibility for increasing yield in sugarcane mills and as one of the alternatives to decrease the crisis that affects this sector. Sugarcane biomass, just like all lignocellulosic material, is formed by three main fractions: cellulose, hemicellulose and lignin. The lignocellulosic fiber, after going through pretreatments for separation and break this complex, originates fermentable sugars that can be biotransformed into ethanol. Acid hydrolysis pretreatment is a well-established process, in which monomers are released, and xylose is released from hemicellulose in higher rate, in order to obtain the cellulignin. After biomass delignification, cellulose must be submitted to acid hydrolysis or enzymatic processes to solubilize glucose. Enzymatic hydrolysis and fermentation can occur separately (SHF) or simultaneously (SSF), and this last one has an advantage of performing these two steps in the same reactor. Furthermore, this process requires thermotolerant yeasts able to withstand near to 50 °C, an optimized range for cellulase performance. In addition, another obstacle to produce ethanol is its accumulation in the medium, leading to inhibition by the product during the fermentation process and toxicity for the yeast. K. marxianus yeast has interesting metabolic characteristics that are able of overcoming such difficulties during cellulosic ethanol production. So, it requires more studies, since there is no knowledge about the optimal initial concentrations of substrate for ethanol production by this yeast and on its endurance to the product. Thus, this trial aims at evaluating the fermentative behavior of K. marxianus ATCC 36907 yeast in semi-defined medium with variations in substrate and temperature concentrations using phenomenological modeling, as well as evaluating the effect of ethanol removal on its fermentative activity. In the first step of this trial, fermentations were obtained in a shaking incubator using a semi-defined medium supplemented with peptone, malt extract and yeast extract, with variations in glucose concentrations (50, 120 and 190 g L-1) and temperature (30, 35, 40 and 45 °C). The experimental results were put mathematically together to obtain a theoretical model of the process by the phenomenological modeling with Scilab software. The obtained models represented satisfactorily cell development curves, substrate consumption and ethanol production. The optimization ethanol fermentation process indicated 40 °C as temperature and a substrate concentration of 90 g L-1 to maximize the product concentration, resulting in an average of 22.5 g L-1 ethanol and 0.24 g g-1 yield. During its second step, the fermentations were carried out in triplicates under the optimized conditions in a 1.2-L volume fermenter. Control fermentations were carried out in triplicate without ethanol extraction by vacuum and fed after 36 hours, while the other fermentations, also in triplicate, were carried out under the same conditions, but with the product extraction by vacuum. After the first 36-hour cycle, ethanol concentration was 34.13 g L-1 (YP/S 0.38 g g-1 and QP 0.94 g L-1 h-1), reaching 40.90 g L -1 ethanol (YP/S 0.18 g g-1 and QP 0.43 g L-1 h-1) at the end of the second cycle. A different behavior was observed in the control experiment, in which ethanol production occurred in the first cycle (36.37 g L-1, YP/S 0.4 g g-1 and QP 1.01 g L-1 h-1), whereas in the second cycle, the substrate consumption was 8% and ethanol production was not observed. The phenomenological modeling showed that the experimental data were better represented by the model that took into account the occurrence of a latency phase at ix the beginning of the second cycle and strongly indicated a metabolism inhibition by product accumulation. K. marxianus yeast recovered its fermentative metabolism and produced ethanol again, demonstrating the relevant role of product removal in improving such process. / A levedura Kluyveromyces marxianus vem despertando interesse na área da Biotecnologia por sua grande diversidade metabólica e elevado grau de polimorfismo. Suas potencialidades estão sendo investigadas para diversas aplicações, como a produção de enzimas de interesse do setor alimentício como as β-galactosidases, β-glucosidase e poli-galactosidase, na produção de compostos aromáticos e álcoois superiores como o fenil-etanol e, também, no setor das biorrefinarias na produção de etanol de segunda geração. Assim, essa levedura torna-se interessante para a produção de bioetanol devido à capacidade em assimilar diferentes carboidratos da biomassa lignocelulósica, e ao seu amplo espectro de termotolerância. O etanol celulósico desponta como uma possibilidade para o aumento da produtividade nas usinas sucroalcooleiras e como uma das alternativas para aliviar a crise que afeta o setor. A biomassa da cana-de-açúcar, um subproduto da indústria sucroalcooleira, como todo o material lignocelulósico, é formada por três frações principais: celulose, hemicelulose e lignina. As fibras lignocelulósicas após passarem por pré-tratamentos para a separação e quebra desse complexo originam açúcares fermentescíveis que podem ser biotransformados em etanol. O pré-tratamento por hidrólise ácida é um processo bem estabelecido, em que há a liberação de monômeros, em maior proporção a xilose, a partir da hemicelulose, tendo em vista a obtenção de celulignina. Após a deslignificação, a celulose deve ser submetida a processos de hidrólise ácida ou enzimática para a solubilização da glicose. A hidrólise enzimática e a fermentação podem ocorrer separadamente (SHF) ou de forma simultânea (SSF), tendo esta última a vantagem de realizar essas duas etapas no mesmo reator. Por outro lado, a condução desse processo requer leveduras termotolerantes capazes de suportar temperaturas próximas de 50ºC, faixa otimizada para atuação das celulases. Além disso, outro entrave para a produção de etanol é o seu acúmulo no meio, o qual acarreta na inibição pelo produto durante o processo fermentativo e toxicidade para as leveduras utilizadas. A levedura K. marxianus possui características metabólicas interessantes capazes de superar tais dificuldades encontradas na produção de etanol celulósico. Porém, são necessários maiores estudos, uma vez que não se tem conhecimento sobre as concentrações iniciais ótimas de substrato para a produção de etanol pela levedura e sobre sua tolerância ao produto. Por essa razão, este trabalho teve como objetivos avaliar o comportamento fermentativo da levedura K. marxianus ATCC 36907 em meio semi-definido, com variações nas concentrações de substrato (glicose) e temperatura utilizando a modelagem fenomenológica bem como avaliar o efeito da remoção de etanol sobre sua atividade fermentativa. Na primeira etapa do trabalho, as fermentações foram conduzidas em incubadora com agitação pelo emprego do meio semidefinido suplementado com peptona, extrato de malte e extrato de levedura, com variações nas concentrações de glicose (50, 120 e 190 g L-1) e temperatura (30, 35, 40 e 45 ºC). Os resultados experimentais foram agregados matematicamente para obtenção de um modelo teórico do processo por meio de modelagem fenomenológica com auxílio do software Scilab. Os modelos obtidos representaram, de forma satisfatória, as curvas de crescimento celular, consumo de substrato e produção de etanol. O processo de otimização da fermentação etílica indicou a utilização da temperatura de 40 ºC e concentração de substrato de 90 g L-1 para maximização da concentração de produto, com isso, foram obtidos, em média, 22,5 g L-1 de etanol e rendimento de 0,24 g g-1. Na segunda etapa do trabalho, as fermentações foram conduzidas em triplicatas nas condições otimizadas em fermentador com volume de 1,2 L. As fermentações-controle foram realizadas em triplicata sem a extração de etanol por vácuo e alimentadas após 36 horas. Todavia, as outras fermentações, também em triplicata, foram conduzidas nas mesmas condições, porém com extração do produto por vácuo. Nas fermentações com vácuo, após o primeiro ciclo de 36 horas, a concentração de etanol foi de 34,13 g L-1 (YP/S 0,38 g g -1 e QP 0,94 g L-1 h-1), atingindo 40,90 g L -1 de etanol (YP/S 0,18 g g-1 e QP 0,43 g L-1 h-1) no final do segundo ciclo. vii Um comportamento diferente foi observado no experimento controle, no qual a produção de etanol ocorreu apenas no primeiro ciclo (36,37 g L-1, YP/S 0,4 g g-1 e QP 1,01 g L-1 h-1), enquanto no segundo ciclo o consumo do substrato foi de apenas 8% e a produção de etanol não foi observada. A modelagem fenomenológica mostrou que os dados experimentais foram melhor representados pelo modelo, o qual considerou a ocorrência de uma fase de latência no início do segundo ciclo e indicou fortemente a inibição do metabolismo pelo acúmulo do produto. A levedura K. marxianus recuperou seu metabolismo fermentativo e voltou a produzir etanol, demonstrando o papel relevante da remoção do produto na melhoria do processo.