The thesis deals with methods for viability evaluation of the phytopathogenic bacterium Xanthomonas euvesicatoria after low-temperature plasma treatment. Low-temperature plasma produced by Gliding Arc experimental device was used for treatment of X. euvesicatoria. The viability of the bacterial cells was assessed using a scanning electron microscope (SEM) and by measuring of the fluorescence in the Smart-DART device using PrestoBlue chemical reagent. Methodology has been optimised for the sample preparation for the treatment by low temperature plasma and used for evaluation of applied methods. Lethal effect of gliding arc plasma to this gram-negative bacteria was verified by SEM which showed. There is significant structural changes on the cell surface. Viability assessment of X. euvesicatoria using Smart-DART device is a fast, time-saving and inexpensive evaluation of cell viability. The great advantage of this device is its ability to measure the fluorescence in real time. The disadvantage of this method is lower reliability in current stage of research.

Background: The method of serum bactericidal assay represents an alternative possibility of optimization of anti-infectious therapy and administration of antibiotics. It mirrors the real activity of one or more administered antibiotics in the complex system of the antibacterial effect of patient's serum. The paper aimed to confirm non-inferiority of bactericidal testing using the broth dilution method according to CLSI M21-A Guidelines (time to results 48, 72 hours) in comparison with modified methods of testing on the basis of turbidimetry (time to result 6, 8, 24 hours) and resazurin color (time to results 8, 24 hours). Methods: Four antibiotics were tested: gentamicin, amikacin, piperacillin/tazobactam and meropenem with 30 Escherichia coli strains isolated from blood cultures of 29 pacients hospitalised in different wards, University Hospital in Hradec Kralove. Human blood sera (n = 76) from ten hematological patients (4th Department of Clinical Medicine, University Hospital, Hradec Kralove) were tested to establish bactericidal titer. Patients' blood was withdrawn prior to and in the course of the first and third day of antibiotic therapy of febrile neutropenia. Testing employed the reference strain Escherichia coli ATCC 25922. Results: A comparison with the standard CSLI showed that the...

Para efetivamente tratar uma infecção, é necessário que o antibiótico possua atividade antimicrobiana adequada e seja capaz de inibir o crescimento do microrganismo patogênico. O doseamento microbiológico é uma metodologia indicada para a análise do antimicrobiano de forma simples, quando comparado com outras metodologias. A Food and Drug Administration (FDA) tem encorajado uma abordagem proativa para introduzir inovações e benefícios associados ao processo de produção farmacêutica. A Qualidade por Design Analítico (AQbD) ajuda no desenvolvimento de métodos analíticos robustos e de baixo custo, que são aplicáveis durante todo ciclo de vida do produto. Os métodos microbiológicos tradicionais, de forma geral, apresentam baixa reprodutibilidade e alta incerteza. Desta forma, justifica-se o desenvolvimento de métodos microbiológicos alternativos para a análise de antimicrobianos empregando-se os conceitos de Qualidade por Design Analítico, com a finalidade de melhorar a reprodutibilidade e reduzir a incerteza final. O objetivo deste trabalho foi aplicar o conceito de Qualidade por Design Analítico (AQbD) no desenvolvimento de método colorimétrico para análise de sulfato de neomicina. O sulfato de neomicina é um antimicrobiano aminoglicosídeo amplamente empregado no tratamento de infecções cutâneas ou mucosas, tais como queimaduras, úlceras, e dermatites infecciosas. Métodos cromatográficos como a cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa, de pareamento iônico ou cromatografia iônica com derivatização (pré ou pós-coluna) são utilizados para a análise de aminoglicosídeos, inclusive sulfato de neomicina. Contudo, de acordo com as farmacopeias, o método microbiológico é o método analítico de escolha para a análise de sulfato de neomicina e outros aminoglicosídeos. A análise colorimétrica é um método amplamente utilizado para a detecção e quantificação de diferentes substâncias, incluindo o crescimento microbiano em estudos de eficácia terapêutica. Neste trabalho, propomos o uso de resazurina como marcador colorimétrico. O indicador sofre uma reação de oxido-redução na qual altera a coloração em resposta à redução química resultante do crescimento celular. O uso de microplacas para a análise colorimétrica é uma alternativa ao método realizado em tubos de ensaio. Uma alternativa ao uso de espectrofotômetros para a análise colorimétrica é o uso de aparelhos smartphones, pois são equipados com CPUs rápidas, câmeras de alta resolução e sensores de imagem. O processamento da imagem captada pela câmera do dispositivo é utilizado como um analisador colorimétrico. Portanto, a aplicação dos conceitos de Qualidade por Design Analítico (AQbD) possibilitou o desenvolvimento racional de método microbiológico colorimétrico para análise de sulfato de neomicina. / To effectively treat an infection, the antibiotic must have adequate antimicrobial activity and be capable of inhibiting the growth of the pathogenic microorganism. The microbiological assay is an indicated methodology for the analysis of the antimicrobial in a simple way, when compared with other methodologies. The Food and Drug Administration (FDA) has encouraged a proactive approach to introducing innovations and benefits associated with the pharmaceutical production process. Analytical Design Quality (AQbD) assists in the development of robust, low cost analytical methods that are applicable throughout the product life cycle. Traditional microbiological methods, in general, have low reproducibility and high uncertainty. Thus, it is justified the development of alternative microbiological methods for the analysis of antimicrobials using the concepts of Quality by Analytical Design, in order to improve reproducibility and reduce final uncertainty. The objective of this work was to apply the concept of Quality by Analytical Design (AQbD) in the development of a colorimetric method for the analysis of neomycin sulfate. Neomycin Sulfate is an aminoglycoside antimicrobial widely used in the treatment of cutaneous or mucosal infections, such as burns, ulcers, and infectious dermatitis. Chromatographic methods such as reverse phase high performance liquid chromatography, ion-pairing or ion chromatography with derivatization (pre or post-column) are used for the analysis of aminoglycosides, including neomycin sulfate. However, according to pharmacopoeias, the microbiological method is the analytical method of choice for the analysis of neomycin sulphate and other aminoglycosides. Colorimetric analysis is a widely used method for the detection and quantification of different substances, including microbial growth in studies of therapeutic efficacy. In this work, we propose the use of resazurin as a colorimetric marker. The indicator undergoes an oxidation-reduction reaction in which it alters the coloration in response to the chemical reduction resulting from cell growth. The use of microplates for colorimetric analysis is an alternative to the method carried out in test tubes. An alternative to the use of spectrophotometers for colorimetric analysis is the use of smartphones because they are equipped with fast CPUs, high resolution cameras and image sensors. The image processing captured by the device\'s camera is used as a colorimetric analyzer. Therefore, the application of the concepts of Quality by Analytical Design (AQbD) allowed the rational development of a microbiological colorimetric method for analysis of neomycin sulfate.

A hidroxiapatita (HA) tem sido amplamente utilizada como material de implante por possuir alta similaridade com a composição dos ossos e ter capacidade de formar ligações químicas fortes com o tecido ósseo. Entretanto, a adsorção fácil de moléculas orgânicas (proteínas, aminoácidos e polissacarídeos) pela HA também favorece a adsorção e replicação de bactérias, aumentando os casos de infecções relacionados a esse biomaterial. Visando contribuir para o avanço de novos biomateriais com propriedades antibacterianas, foram produzidas neste trabalho hidroxiapatitas contendo nanopartículas de prata (AgNPs) com diferentes proporções (0,01; 0,05; 0,10 e 0,25% m/m). A primeira etapa do trabalho consistiu na obtenção do pó de HA por precipitação química e na produção de AgNPs em suspensões coloidais por meio de síntese que utiliza a quitosana como agente redutor e estabilizante. Na segunda etapa, as AgNPs foram adsorvidas na HA pelo método de imersão do pó usando um dos coloides sintetizados, obtendo-se quatro hidroxiapatitas contendo AgNPs (HA-AgNPs) nas formas de pó e disco. Na terceira e última etapa, os materiais produzidos foram caracterizados utilizando diversas técnicas e os pós (HA e HA-AgNPs) foram submetidos a avaliações in vitro. O efeito antibacteriano foi avaliado frente a cepas de S. aureus e E. coli utilizando métodos qualitativos e quantitativos. A adesão bacteriana sobre a superfície dos discos foi observada por microscopias eletrônica de varredura (MEV) e confocal de varredura a laser. A citotoxicidade in vitro foi avaliada utilizando cultura de células contendo linhagem de osteoblastos (MG-63). Nesse ensaio, a viabilidade dos osteoblastos foi estudada usando o teste da resazurina; a atividade enzimática foi investigada através da fosfatase alcalina (ALP); e a adesão dos osteoblastos foi observada por MEV. Os resultados mostraram que a HA produzida é nanométrica e que as AgNPs sintetizadas são estáveis e esféricas, com diâmetros variando entre 5-10 nm. Técnicas de MEV, EDS e ICP-AES confirmaram a presença de prata nas HA-AgNPs. As demais caracterizações não mostraram alterações relevantes na estrutura, morfologia e características de superfície (hidrofobicidade e carga líquida). No entanto, a atividade antibacteriana dos materiais mostrou-se eficiente para ambas as cepas e com uma redução de 99,9% das colônias bacterianas em quase todos os materiais já nas primeiras 4 h. Também foi encontrado que a eliminação foi maior tanto para E. coli quanto utilizando materiais em pó. O estudo da adesão bacteriana confirmou os resultados anteriores mostrando efeito superior para quase todas HA-AgNPs produzidas comparado a HA, exceto para o material com menor proporção de AgNPs (0,01% m/m). Por outro lado, os testes de viabilidade, ALP e adesão demonstraram que a HA-AgNPs com maior quantidade de AgNPs (0,25% m/m) tem um efeito negativo sobre os osteoblastos. Considerando ambos os efeitos de citotoxicidade e antibacteriano, aliado a metodologia simples e de baixo custo envolvido na produção desses materiais, sugere-se que a HA contendo entre 0,05 0,10% m/m das AgNPs sintetizada pode ser a mais favorável para o desenvolvimento proposto visando futuras aplicações biomédicas. / Hydroxyapatite (HA) has been widely used as implant material due to its high similarity with the bone composition and its capacity to form strong chemical bonds with the bone tissue. However, the easy adsorption of organic molecules (proteins, amino acids and polysaccharides) by the HA also favors bacteria adsorption and replication, increasing the cases of infection related to this biomaterial. Aiming to contribute to the advancement of new biomaterials with antibacterial properties, were produced in this work hydroxyapatites containing silver nanoparticles (AgNPs) with different ratios (0.01, 0.05, 0.10 and 0.25% m/m). The first step of this work consisted in obtaining the HA powder by chemical precipitation and production of AgNPs colloidal suspensions by synthesis using chitosan as a reducing agent and stabilizer. In the second step, the AgNPs were adsorbed to the HA matrix by the powder immersion method using onde of the synthesized colloids, resulting in four hydroxyapatites containg AgNPs (HA-AgNPs) in disk and powder forms. In the third and final step, the materials produced were characterized using several techniques, with the powders (HA and HA-AgNPs) evaluated in vitro. The antibacterial effect was evaluated against strains of S. aureus and E. coli using qualitative (ágar diffusion test) and quantitative (bacterial colony counts) methods. The bacterial adhesion over the disks surface were observed by Scanning Electron Microscopy (SEM) and confocal laser scanning microscopy. Cytotoxicity was evaluated in vitro using cell culture containing the osteoblast lineage (MG- 63). In this assay, osteoblasts viability was studied using the resazurin test; the enzyme activity was investigated by alkaline phosphatase (ALP), and osteoblast adhesion was observed by SEM. The results showed that the HA produced is nanometric and the synthesized AgNPs are stable and spherical with diameters ranging from 5-10 nm. SEM, EDS and ICP-AES techniques confirmed the presence of silver in the HA-AgNPs. The others characterizations showed no significant changes in the structure, morphology and surface characteristics (hydrophobicity and net charge). However, the materials antibacterial activity was effective for both strains and with reduction of 99.9% of bacterial colonies in almost all materials within the first 4 h. It was also found that the removal was as great for E. coli as for powder materials. The bacterial adhesion study confirmed previous results showing superior effect for almost all HA-AgNPs produced compared to HA, except for the material with the lowest proportion of AgNPs (0.01% m/m). On the other hand, viability tests, ALP and adhesion demonstrated that HA-AGNPS with higher AGNPS quantities (0.25% m/m) has a negative effect on osteoblasts. Considering both cytotoxicity and antibacterial effects, combined with the simple methodology and low cost involved in the production of these materials, it is suggested that the HA containing synthesized AgNPs ranging from 0.05 to 0.10% m/m can be the most favorable for the development of the proposed material for future biomedical applications.

A hidroxiapatita (HA) tem sido amplamente utilizada como material de implante por possuir alta similaridade com a composição dos ossos e ter capacidade de formar ligações químicas fortes com o tecido ósseo. Entretanto, a adsorção fácil de moléculas orgânicas (proteínas, aminoácidos e polissacarídeos) pela HA também favorece a adsorção e replicação de bactérias, aumentando os casos de infecções relacionados a esse biomaterial. Visando contribuir para o avanço de novos biomateriais com propriedades antibacterianas, foram produzidas neste trabalho hidroxiapatitas contendo nanopartículas de prata (AgNPs) com diferentes proporções (0,01; 0,05; 0,10 e 0,25% m/m). A primeira etapa do trabalho consistiu na obtenção do pó de HA por precipitação química e na produção de AgNPs em suspensões coloidais por meio de síntese que utiliza a quitosana como agente redutor e estabilizante. Na segunda etapa, as AgNPs foram adsorvidas na HA pelo método de imersão do pó usando um dos coloides sintetizados, obtendo-se quatro hidroxiapatitas contendo AgNPs (HA-AgNPs) nas formas de pó e disco. Na terceira e última etapa, os materiais produzidos foram caracterizados utilizando diversas técnicas e os pós (HA e HA-AgNPs) foram submetidos a avaliações in vitro. O efeito antibacteriano foi avaliado frente a cepas de S. aureus e E. coli utilizando métodos qualitativos e quantitativos. A adesão bacteriana sobre a superfície dos discos foi observada por microscopias eletrônica de varredura (MEV) e confocal de varredura a laser. A citotoxicidade in vitro foi avaliada utilizando cultura de células contendo linhagem de osteoblastos (MG-63). Nesse ensaio, a viabilidade dos osteoblastos foi estudada usando o teste da resazurina; a atividade enzimática foi investigada através da fosfatase alcalina (ALP); e a adesão dos osteoblastos foi observada por MEV. Os resultados mostraram que a HA produzida é nanométrica e que as AgNPs sintetizadas são estáveis e esféricas, com diâmetros variando entre 5-10 nm. Técnicas de MEV, EDS e ICP-AES confirmaram a presença de prata nas HA-AgNPs. As demais caracterizações não mostraram alterações relevantes na estrutura, morfologia e características de superfície (hidrofobicidade e carga líquida). No entanto, a atividade antibacteriana dos materiais mostrou-se eficiente para ambas as cepas e com uma redução de 99,9% das colônias bacterianas em quase todos os materiais já nas primeiras 4 h. Também foi encontrado que a eliminação foi maior tanto para E. coli quanto utilizando materiais em pó. O estudo da adesão bacteriana confirmou os resultados anteriores mostrando efeito superior para quase todas HA-AgNPs produzidas comparado a HA, exceto para o material com menor proporção de AgNPs (0,01% m/m). Por outro lado, os testes de viabilidade, ALP e adesão demonstraram que a HA-AgNPs com maior quantidade de AgNPs (0,25% m/m) tem um efeito negativo sobre os osteoblastos. Considerando ambos os efeitos de citotoxicidade e antibacteriano, aliado a metodologia simples e de baixo custo envolvido na produção desses materiais, sugere-se que a HA contendo entre 0,05 0,10% m/m das AgNPs sintetizada pode ser a mais favorável para o desenvolvimento proposto visando futuras aplicações biomédicas. / Hydroxyapatite (HA) has been widely used as implant material due to its high similarity with the bone composition and its capacity to form strong chemical bonds with the bone tissue. However, the easy adsorption of organic molecules (proteins, amino acids and polysaccharides) by the HA also favors bacteria adsorption and replication, increasing the cases of infection related to this biomaterial. Aiming to contribute to the advancement of new biomaterials with antibacterial properties, were produced in this work hydroxyapatites containing silver nanoparticles (AgNPs) with different ratios (0.01, 0.05, 0.10 and 0.25% m/m). The first step of this work consisted in obtaining the HA powder by chemical precipitation and production of AgNPs colloidal suspensions by synthesis using chitosan as a reducing agent and stabilizer. In the second step, the AgNPs were adsorbed to the HA matrix by the powder immersion method using onde of the synthesized colloids, resulting in four hydroxyapatites containg AgNPs (HA-AgNPs) in disk and powder forms. In the third and final step, the materials produced were characterized using several techniques, with the powders (HA and HA-AgNPs) evaluated in vitro. The antibacterial effect was evaluated against strains of S. aureus and E. coli using qualitative (ágar diffusion test) and quantitative (bacterial colony counts) methods. The bacterial adhesion over the disks surface were observed by Scanning Electron Microscopy (SEM) and confocal laser scanning microscopy. Cytotoxicity was evaluated in vitro using cell culture containing the osteoblast lineage (MG- 63). In this assay, osteoblasts viability was studied using the resazurin test; the enzyme activity was investigated by alkaline phosphatase (ALP), and osteoblast adhesion was observed by SEM. The results showed that the HA produced is nanometric and the synthesized AgNPs are stable and spherical with diameters ranging from 5-10 nm. SEM, EDS and ICP-AES techniques confirmed the presence of silver in the HA-AgNPs. The others characterizations showed no significant changes in the structure, morphology and surface characteristics (hydrophobicity and net charge). However, the materials antibacterial activity was effective for both strains and with reduction of 99.9% of bacterial colonies in almost all materials within the first 4 h. It was also found that the removal was as great for E. coli as for powder materials. The bacterial adhesion study confirmed previous results showing superior effect for almost all HA-AgNPs produced compared to HA, except for the material with the lowest proportion of AgNPs (0.01% m/m). On the other hand, viability tests, ALP and adhesion demonstrated that HA-AGNPS with higher AGNPS quantities (0.25% m/m) has a negative effect on osteoblasts. Considering both cytotoxicity and antibacterial effects, combined with the simple methodology and low cost involved in the production of these materials, it is suggested that the HA containing synthesized AgNPs ranging from 0.05 to 0.10% m/m can be the most favorable for the development of the proposed material for future biomedical applications.