Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-09-20T12:53:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO- VERSÃO FINAL -Biblioteca.pdf: 3304564 bytes, checksum: be295edea976cdf452e4a26cacd96e9e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-20T12:53:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO- VERSÃO FINAL -Biblioteca.pdf: 3304564 bytes, checksum: be295edea976cdf452e4a26cacd96e9e (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / FACEPE / Com o avanço da nanotecnologia, o uso de nanopartículas (NPs) metálicas, e semicondutoras, no desenvolvimento de biossensores vem aumentando nos últimos anos. Sua utilização vem proporcionando um aumento da área superficial, promovendo uma imobilização mais efetiva de biomoléculas, e espécies eletroativas, a fim de melhorar a sensibilidade de detecção do biossensor. Dentre essas NPs, estão os pontos quânticos (PQs), nanocristais com propriedades ópticas e semicondutoras únicas, as quais podem ser moduladas por seu tamanho. Os PQs podem ser utilizados em plataformas para biossensores eletroquímicos através de sua imobilização como intermediários entre o bioreceptor e a superfície do eletrodo. Nesse contexto, esse trabalho objetivou empregar e avaliar a utilização de PQs de CdTe carboxilados em uma plataforma biossensora eletroquímica baseada em eletrodo de carbono vítreo modificado com polipirrol aminado. Posteriormente, o anticorpo IgG (Imunoglobulina G Humana) foi imobilizado e a plataforma foi aplicada na detecção do anti-IgG. A imobilização dos PQs e do IgG foi avaliada de forma covalente e por adsorção. No primeiro caso, o eletrodo modificado pelo pirrol aminado foi imerso por 24 horas em uma solução contendo 2 mmol L-1 de EDC e 5 mmol L-1 de Sulfo-NHS para a formação de ligações amidas entre os PQs e a superfície modificada. Antes da imobilização do IgG, foram realizados estudos de conjugação em meio homogêneo a partir do ensaio fluorescente em microplaca (EFM). Esse estudo foi realizado a fim de correlacionar a conjugação nos meios homogêneo/heterogêneo e desenvolver um método com fins de aprimorar com maior rapidez a imobilização de biomoléculas na plataforma biossensora. Dessa forma, após o EFM, a superfície modificada por PQs foi avaliada frente a diferentes quantidades de IgG, EDC e Sulfo-NHS, adquiridas através da melhor e pior condição da EFM. A partir do resultado do EFM, foi adotada como melhor condição a do sistema com a maior quantidade de EDC e Sulfo-NHS e menor concentração de IgG, o qual apresentou um aumento relativo da fluorescência de 960%, enquanto que a pior condição foi obtida a partir da menor quantidade de agentes de acoplamento e de IgG, com aumento relativo da fluorescência de 80%. Todas as etapas de modificações do eletrodo foram monitoradas por voltametria cíclica (VC) e espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE). Para o eletrodo de carbono vítreo modificado com polipirrol aminado, as análises eletroquímicas não apresentaram grandes variações em relação ao eletrodo limpo. Já com a imobilização dos PQs de CdTe carboxilados, os resultados indicaram uma redução no processo de transferência de carga, evidenciado através da diminuição e do deslocamento da corrente de pico na região de oxidação da voltametria cíclica, e do aumento do semicírculo apresentado nos dados da impedância eletroquímica. Posteriormente, a voltametria cíclica na presença do anticorpo IgG apresentou também uma diminuição e um deslocamento gradual das correntes de pico catódicas e anódicas, indicando a imobilização dessa biomolécula na superfície do eletrodo. As análises de EIE foram coerentes com as da VC. Foi observada correlação entre as avaliações no eletrodo e na EFM, indicando que a melhor condição no EFM será uma escolha efetiva para a plataforma. Os resultados também indicaram que os PQs e IgGs foram imobilizados preferencialmente de forma covalente. As avaliações preliminares também indicaram que a interface modificada por pirrol aminado e PQs carboxilados foi capaz de detectar anti-IgGs na faixa de ng mL-1, revelando-se como um potencial para ser utilizada na detecção de biomarcadores de diagnóstico. / The use of metallic, and semiconductor, nanoparticles (NPs) for developing biosensors has been expanding in recent years. NPs can provide an increase of the biosensors’ surface area, by promoting a more effective immobilization of biomolecules, as well as electroactive species, in order to improve the sensitivity of these devices. Among these NPs, there are the quantum dots (QDs), nanocrystals with unique optical and semiconductor properties that can be applied in electrochemical biosensors platforms as intermediaries between bioreceptors and the electrode surface. Thus, in this context, this study aimed to evaluate and employ carboxyl-coated CdTe PQs in an electrochemical platform based on a vitreous carbon electrode modified by amino functionalized polypyrrole. Subsequently, the IgG (human immunoglobulin G) antibody was immobilized on the platform that was tested by detecting anti-IgG biomolecules. The QDs, as well as the IgG, immobilization was evaluated by covalent coupling and by adsorption. In the first case, the electrode modified by polypyrrole was immersed, for 24 hours, in a solution containing 2 mmol L-1 of EDC and 5 mmol L-1 of Sulfo-NHS to promote amide bonds between the modified surface and QDs. Before IgG immobilization, conjugation experiments were also performed in homogeneous medium by using the fluorescent microplate assay (FMA). This study was conducted to correlate the conjugations in homogeneous/heterogeneous media in order to develop a method for improving more quickly the biomolecules’ immobilization on the biosensor platform. Thus, after the EFM, the electrode modified by QDs was evaluated by using different amounts of IgG, EDC and Sulfo-NHS, acquired from the best and the worst condition of FMA. From the result of the FMA, it was adopted as the best system that one composed by the greatest amount of EDC and Sulfo-NHS and by the lower concentration of IgG (which had a relative fluorescence increase of 960%), while the worst condition was obtained by the one that used the lower amounts of coupling agents and IgG (with relative increase in the fluorescence of 80%). All stages of the electrode modifications were monitored by cyclic voltammetry (CV) and electrochemical impedance spectroscopy (EIS). The electrochemical analysis for the vitreous carbon electrode modified with amino functionalized polypyrrole showed no differences compared to the clean electrode. However, after the immobilization of CdTe carboxylate QDs, the results showed a decrease in the charge transfer process. Subsequently, the cyclic voltammetry in the presence of the IgG antibody also presented a decrease and a gradual displacement of the cathodic and anodic peak currents, indicating the immobilization of this biomolecule on the electrode surface. EIS analyses were consistent with those performed by VC. A correlation was observed between the evaluations in the electrode and the FMA, indicating that the best condition in the FMA is an effective choice for the platform. The results also indicated that QDs and IgGs were preferably immobilized by covalent coupling. Preliminary evaluations have also indicated that the platform, modified by amino functionalized pyrroles and carboxyl-coated QDs, was able to detect anti-IgG in the range of ng mL-1, showing to be a potential platform for the detection of diagnostic biomarkers.