Orientador: Ana Maria Lima de Azeredo-Espin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T11:05:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_NormaMachadoda_D.pdf: 6129934 bytes, checksum: 5d8a07895afd2e470c9fd5caf8ac9fb8 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Cochliomyia hominivorax é considerada uma importante praga por causar perdas econômicas para a pecuária na região Neotropical. Este ectoparasita tem sido controlado principalmente por inseticidas, entretanto, este método normalmente resulta na seleção de indivíduos resistentes. Nesta tese foram investigados mecanismos associados com resistência a inseticidas organofosforados e piretróides. Os resultados apresentados nesta tese estão divididos em dois artigos. No artigo 1 foram investigados dois mecanismos de resistência a piretróides, um conhecido como kdr (knockdown resistance), associado à mutações no canal de sódio, e a mutação W251S no gene da carboxilesterase E3, a qual têm sido associada à hidrólise de piretróides. Foram investigadas populações da atual distribuição geográfica de C. hominivorax através de PCR-RFLP. Para a mutação kdr (L1014F) nenhum indivíduo mutante foi encontrado. Entretanto, a mutação W251S foi encontrada em todas as populações, com as mais altas freqüências nas amostras da Venezuela (100%) e Colômbia (93.75%). Em algumas populações amostradas, apesar da freqüência do alelo mutante ter sido relativamente baixa, o número de indivíduos portadores de pelo menos um alelo mutante foi alto. No bioensaio com cipermetrina (piretróide tipo II), utilizando amostras de Estiva (MG), os resultados analisados através do teste exato de Fisher indicaram que para a mais baixa concentração (p=0.0003) e para uma concentração intermediária (p= 0.024), a presença da mutação W251S está correlacionada com as chances de sobrevivência. Entretanto, na mais alta concentração (p= 0.221) a presença desta mutação não foi correlacionada com a sobrevivência, o que possivelmente indica dificuldade em hidrolisar este tipo de piretróide em concentrações maiores. No Artigo 2, as mutações G137D no gene da carboxilesterase E3, e as mutações I298V, G401A e F466Y no gene da acetilcolinesterase, associadas com resistência a organofosforados, foram investigadas nas mesmas populações do artigo 1, através de PCR-RFLP e sequenciamento direto de PCR. A região codificante completa da acetilcolinesterase também foi caracterizada e proposto um modelo para a estrutura tridimensional desta proteína com base na estrutura da acetilcolinesterase de Drosophila melanogaster. Possíveis alterações na proteína causadas pelas mutações associadas com resistência a organofosforados foram discutidas. No gene da acetilcolinesterase somente 2 de 135 indivíduos analisados apresentaram uma das mutações investigadas, a F466Y, o que pode estar associado ao alto custo no valor adaptativo do indivíduo, causado por algumas mutações neste gene ou inexistência dos demais alelos mutantes nestas populações. Entretanto, para a mutação G137D no gene da E3 foi encontrado um alto número de indivíduos portadores de pelo menos um alelo mutante na maioria das populações brasileiras e no Uruguai. Em Cuba, Venezuela e Colômbia nenhum indivíduo mutante para G137D foi encontrado, o que pode estar relacionado com os inseticidas usados no controle de C. hominivorax nestas regiões ou com a inexistência do alelo mutante nestas localidades. Os resultados de ambos os trabalhos indicam que mutações no gene da carboxilesterase E3 são um dos principais mecanismos de resistência selecionados nesta espécie, dentre os investigados até o momento. Este estudo representa um importante avanço no entendimento da base molecular da resistência a inseticidas em um importante ectoparasita. / Abstract: Cochliomyia hominivorax is an important ectoparasite, causing considerable economic losses to livestock sector in Neotropical region. This ectoparasite has been controlled mainly by applying insecticides, however, this method usually results in the selection of resistant individuals. In this thesis, mechanisms associated with organophosphate and pyrethroid insecticide resistance were investigated. The results presented in this thesis are divided in two articles. In the Article 1 two mechanisms associated with pyrethroid resistance were investigated, the kdr (knockdown resistance), a generic term for mutations in the sodium channel, and a mutation in the residue 251 of the carboxylesterase E3 gene, which have been associated with pyrethroid hydrolysis. Populations of actual geographical distribution of C. hominivorax were investigated through PCR-RFLP. For the kdr mutation, no mutant individuals were found. However, the W251S mutation was found in all populations investigated, with the highest frequencies in the samples from Colombia (100%) and Venezuela (93.75%). In some populations, despite relatively low mutant allele frequency, the number of individuals having at least one mutant allele was high. A bioassay with cypermethrin (pirethroid type II) was also performed, using samples from Estiva (MG). The results of the Fisher's exact test for the lowest concentration (p=0.0003, a= 0.05) and for an intermediate concentration (p= 0.024, a= 0.05) indicated that the presence of W251S mutation are correlated with the survival. However, at the highest concentration, Fisher's exact test (p= 0.221, a= 0.05) indicated that the presence of this mutation was not correlated with survival. These results indicate that the W251S mutation in C. hominivorax probably presents difficulties in hydrolyzing of this kind of pyrethroid, in high concentrations. In the Article 2, the G137D mutation, in the carboxylesterase E3 gene, and the I298V, G401A and F466Y mutations in the acetylcholinesterase gene, associated with organophosphate resistance, were investigated. The same populations of article 1 were analyzed using PCR-RFLP and PCR direct sequencing. The complete coding region of acetylcholineserase also was characterized and a putative model for the three-dimensional structure of this protein was proposed, based on solved structure of Drosophila melanogaster. Possible alterations in the protein, caused by mutations associated with organophosphate resistance, were discussed. For the acetylcholinesterase gene, only 2 of 135 individuals analyzed presented one of the mutations investigated, the F466Y. This fact may be related with the fitness cost of some mutations in this gene, or the inexistence of mutant alleles in these populations. For the G137D mutation, a high number of individuals having at least one mutant allele were found in most of the Brazilian populations and in Uruguay. In Cuba, Venezuela and Colombia no G137D mutant was found, a finding that may be related to the insecticides used for C. hominivorax control in these regions. The results of these two works indicate that mutations in the carboxylesterase E3 gene are one of the main insecticide resistance mechanisms selected in this species, so far investigated. This study represents a significant advance in the understanding of the molecular basis of insecticide resistance in an important livestock ectoparasite. / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Gilson Pereira de Oliveira / Coorientador: Alvimar José da Costa / Banca: Marcos Rogério André / Banca: Cláudio Alessandro Massamitsu Sakamoto / Resumo: Ao longo das últimas décadas o controle de Rhipicephalus (Boophilus) microplus tem sido dificultado pelo desenvolvimento da resistência à maioria dos grupos químicos utilizados. Algumas moléculas tem se apresentado como alternativas promissoras, mas mesmo assim, apresentam redução de eficácia com o passar do tempo. As lactonas macrocíclicas, moléculas com atividade endectocida, surgiram como uma dessas opções, mas relatos sobre a resistência, especialmente à ivermectina, se tornam cada vez mais frequentes. O presente estudo objetivou determinar a redução de eficácia da ivermectina contra o R. (B.) microplus, e o consequente surgimento da resistência à esse princípio ativo, por meio de resultados encontrados em várias propriedades rurais, frente às diferentes cepas presentes. Foram realizados testes com bovinos naturalmente infestados da região Sudeste do Brasil, utilizando diferentes concentrações de ivermectina (200 μg/kg, 500 μg/kg e 630 μg/kg). Estes experimentos basearam-se na contagem de partenóginas, entre 4,5 e 8 mm de diâmetro, presentes no lado esquerdo dos bovinos. Das doze propriedades avaliadas, três com a utilização de ivermectina 500 μg/kg (0,5% pour-on), três onde foi testada a ivermectina 200 μg/kg (1% injetável) e seis onde avaliou-se a ivermectina 630 μg/kg (3,15% injetável), apenas uma apresentou valores de eficácia média, entre os dias 7 e 14 pós-tratamento, superior à 90%, sendo classificada como sensível. Nenhum dos demais experimentos atingiu este valor, permitindo a classificação de onze dentre as doze cepas (91,67%) avaliadas, como resistentes. Além disso, o presente estudo confirma a eficiência da avaliação in vivo para o diagnóstico da resistência, assim como reforça a necessidade de maior atenção a esse fenòmeno, amplamente disseminado nessa região do Brasil / Abstract: Throughout the last decades, the control of Rhipicephalus (Boophilus) microplus has become more difficult due to the development of resistance to most of the products used for its control. Some molecules have been presented as promising alternatives, but nonetheless, their efficacy has shown reduction as time passes. The macrocyclic lactones, molecules with endectocidal activity, appeared as one of these options, but resistance to them, especially to ivermectin, are commonly reported in literature. The present study aimed to determine the decrease in acaricidal efficacy of ivermectin against Rhipicephalus (Boophilus) microplus, and the consequent development of resistance to this active component, by means of several results found in several rural properties, with different tick strains present. Tests were conducted in naturally infested animals originated from farms on the Southeast region of Brazil, using different concentrations of ivermectin (200 μg/kg, 500 μg/kg and 630 μg/kg) applied in different administration methods (pour on and injectable). From all twelve properties evaluated, being three with the administration of 500 μg/kg ivermectin (0.5% pouron), three were 200 μg/kg ivermectin (1% injectable) was tested and six were 630 μg/kg ivermectin (3.15% injectable) was evaluated, only one presented mean efficacy values, between days 7 and 14 post-treatment, superior to 90%, being classified as sensible. None of the other experiments reached or surpassed this index, allowing the classification of eleven amongst twelve (91.67%) evaluated R. (B.) microplus strains, as resistant. Besides, the present study confirms the efficiency of in vivo evaluation for the diagnosis of resistance, as well as reinforces the need for a greater attention to this problem, widely spread in this region of Brazil / Mestre