Submitted by ROBERTO PAULO CORREIA DE ARAÚJO (ppgorgsistem@ufba.br) on 2016-08-30T16:51:30Z No. of bitstreams: 1 Versão Corrigida Final_DISSERTAÇÃO Ângela Gifoni .pdf: 4626522 bytes, checksum: 6b8992db750697b6f94a734aa7b4361d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-30T16:51:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Versão Corrigida Final_DISSERTAÇÃO Ângela Gifoni .pdf: 4626522 bytes, checksum: 6b8992db750697b6f94a734aa7b4361d (MD5) / As epilepsias idiopáticas com crises precipitadas por febre são consideradas atualmente como parte de um espectro clínico que varia de fenótipos mais brandos como as crises febris clássicas a fenótipos graves como a Síndrome de Dravet. Mutações no gene SCN1A foram identificadas em muitos desses pacientes, com uma frequência variável, dependendo da gravidade fenotípica. O estudo, do tipo série de casos, objetiva identificar a frequência de mutações no gene SCN1A em pacientes com diferentes fenótipos dentro do espectro clínico das epilepsias idiopáticas com crises precipitadas por febre, correlacionando a presença da mutação com a deterioração cognitiva e motora e com a gravidade do quadro epiléptico. Os casos selecionados foram submetidos a uma avaliação clínica com exame físico neurológico e aplicação da escala Wechsler para obtenção do QI estimado. A avaliação comportamental ocorreu através do questionário CBCL respondido pelos pais. Dados de história clínica foram obtidos através de anamnese e registros dos prontuários e os traçados de eletroencefalograma quando disponíveis, avaliados. O sangue venoso foi coletado para o teste molecular que pesquisou mutações no gene SCN1A. Mutações provavelmente deletérias foram identificadas em três participantes com fenótipos distintos, um deles com Síndrome de Dravet limítrofe, outro com epilepsia focal genética e o último com fenótipo de crise febril plus. As características clínicas e eletroencefalográficas dos casos selecionados, independentemente da presença de mutação, foram bem variadas. Crise desencadeada por pequenas elevações de temperatura foi a característica mais frequente para as crises febris em nossa amostra, entretanto a frequência, duração e tipos de crises febris em cada participante não foram determinantes para a gravidade da evolução. Não existiu correlação entre a presença da mutação em SCN1A e uma pior evolução clínica, sendo evidente a variabilidade, tanto no comprometimento motor, cognitivo e na frequência de crises atuais.

Orientadores: Maria Alice da Cruz-Hofling, Anibal Eugenio Vercesi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T03:04:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Freitas_ErikaMariaSilva_D.pdf: 24578708 bytes, checksum: bf9367ecdbc315a07f58411feea40089 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A veratrina, uma mistura de alcalóides obtidos da espécie de planta Shoenocaulon officinale, é uma toxina lipossolúvel que possui como sítio de ação primária os canais de sódiodependentes de voltagem. Recentemente, nossos estudos mostraram que a veratrina pode causar mionecrose e as evidências sugerem que as mitocôndrias e o retículo sarcoplasmático (RS) possam ser os alvos intracelulares da ação da veratrina. O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos tóxicos induzidos por diferentes concentrações de veratrina sobre o consumo de oxigênio, a atividade dos complexos da cadeia respiratória e a ultraestrutura das mitocôndrias através de análises bioquímicas, citoquímicas e morfométricas e de microscopia eletrônica de transmissão...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The veratrine, a mixture of alkaloids obtained from plant Schoenocaulon officinale, is a lipid soluble toxin, which target voltage-gated Na+ channels for their primary action site. Recently, our studies showed that the veratrine may cause myonecrosis and evidences suggested mitochondria and sarcoplasmic reticuIum (SR) as intracellular cell targets. The aim of this work was to investigate the effects caused by variabIe concentration of veratrine on mitochondrial oxygen consumption, respiratory chain enzymes activities and ultrastructure, combining electron microscopy with biochemical, cytochemical and morphometrical analysis. Moreover, we investigated whether the interference on physiology of sodium channels by veratrine it alters the ultrastructure of SR on different types of muscles. Ultrastructural changes were observed on skeletal muscle mitochondria after intramuscular injection or incubation with veratrine...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Iscia Lopes Cendes, Fernando Cendes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T01:52:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maurer-Morelli_ClaudiaVianna_D.pdf: 558728 bytes, checksum: dee5aed1e69518c268ddacaa962b5126 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A associação entre epilepsia de lobo temporal e esclerose mesial temporal (EMT) é bem estabelecida, assim como o uso da atrofia hipocampal (AH) e outros sinais indicativos de esclerose hipocampal, visíveis por imagens de ressonância magnética, como marcadores da EMT in vivo. Um dos fatores de risco associados à EMT são as crises epilépticas febris prolongadas na infância. Em 2001, Kobayashi et al. descreveram um tipo distinto de epilepsia de lobo temporal mesial com evidente recorrência familiar associada à AH, mas com baixa freqüência de crises febris, nomeada de epilepsia de lobo temporal mesial familiar (ELTMF). Uma análise prévia dos heredogramas destas famílias sugere que as anormalidades hipocampais podem ser geneticamente determinadas na ELTMF. Para determinar se a ELTMF pode ser explicada por fatores genéticos foi empregada a técnica de análise de segregação complexa baseada no modelo misto de Morton, com o emprego do software POINTER©. Na investigação de genes candidatos, com funções biológicas significantes na fisiologia da epilepsia de lobo temporal ou em modelos animais descritos previamente, foram genotipados marcadores microssatélites que flanqueiam estes genes relevantes e realizada a análise de ligação genética. Finalmente, objetivando identificar a região do genoma responsável por conter o gene principal associado com a AH na ELTMF foi realizada a análise de ligação genética genômica em duas famílias suficientemente informativas, com 57 indivíduos incluindo 27 pacientes. Os resultados obtidos demonstraram que: i) a análise de segregação complexa confirmou a observação prévia de uma predisposição genética para ELTMF, indicando a presença de um gene principal com transmissão Mendeliana e que pode ter um envolvimento na gênese da AH encontrada nestes pacientes; ii) embora a lesão hipocampal encontrada em camundongo transgênico com mutação no gene Scn2a seja similar àquela encontrada na ELTM foi descartada a possibilidade do gene homólogo SCN2A ser um gene candidato na ELTMF; iii) a análise de ligação em genes candidatos codificadores de canais de potássio voltagem-dependente não evidenciou qualquer tipo envolvimento destes genes na determinação das anormalidades hipocampais na ELTMF; iv) foi identificada ligação no cromossomo 18p11.3-11.2 com um LOD score máximo de 3,63 para ?= 0,0 para o marcador D18S976 em uma única família com 11 indivíduos afetados com AH. A análise de multipontos e o haplótipo localizam a região candidata dentro um intervalo de 6 cM flanqueado pelos marcadores D18S976 e D18S452. Além disso, os genes ZFP161 e TGIF que se localizam na região candidata mapeada, não apresentaram mutações em suas regiões codificantes, as quais poderiam estar relacionadas à ELTMF. Estes resultados mostram pela primeira vez, evidências de que a AH pode ser determinada por fatores genéticos, os quais podem ter maiores implicações no estudo dos mecanismos fisiopatológicos que permeiam a EMT e sua relação com a epilepsia de lobo temporal. No entanto, estudos adicionais são necessários para identificar o gene maior responsável pela ELTMF / Abstract: The association between temporal lobe epilepsy and mesial temporal sclerosis (MTS) has been well established; as well as the use of hippocampal atrophy (HA) on magnetic resonance imaging as an in vivo surrogate marker of MTS. One of the risk factors associated to MTS is childhood prolonged febrile seizures. In 2001, Kobayashi et al., described a type of mesial temporal lobe epilepsy with evident familial recurrence associate with HA but low frequency of febrile seizures, named familial mesial temporal lobe epilepsy (FMTLE). Previous pedigree analysis provided evidence that hippocampal abnormalities may be genetically determined in FMTLE. To determine whether FMTLE can be explained by the involvement of genetic factor we employed complex segregation analysis with the POINTER© software. To investigate candidate genes with significant biological functions related to temporal lobe epilepsy, we genotyped microsatellite markers flanking these relevant genes and performed linkage analysis. In addition, we performed a genome wide search in two large families with 57 individuals, including 27 patients. Our results show the following: i) complex analysis segregation strengthened previous evidence for a genetic predisposition in FMTLE, indicating the presence of a major gene with Mendelian transmission, which could be involved in HA development in these patients; ii) we conclusively ruled out the SCN2A gene as candidate in FMTLE, although the hippocampal lesion in the mutant Scn2a transgenic mouse is similar to that found in our FMTLE patients; iii) linkage analysis showed no evidence that voltage-gated potassium channels are involved in the determination of hippocampal abnormalities in FMTLE; iv) we identified linkage to chromosome 18p11.3-11.2, with a maximum LOD score of 3.63 at ?= 0.0 for the D18S976 marker in a single family (F-10) with 11 affected individuals with HA. Multipoint and haplotype analyses localized the locus within a 6 cM interval flanked by markers D18S976 and D18S452. Furthermore, we failed to find putative pathological mutations related to FMTLE in two candidate genes ZFP161 and TGIF, both mapping within the locus on chromosome 18p11.3-11.2. With our results we have demonstrated the first conclusive evidence that HA may be caused by genetic factors which can have major implications in the study of the pathophysiological mechanisms underlying MTS and its relationship with temporal lobe epilepsy / Doutorado / Neurociencias / Doutor em Fisiopatologia Medica

Os efeitos inibitórios do eugenol (EUG) em canais para Na+ ativados por voltagem (NaV) mostrados anteriormente não são totalmente compatíveis com nossos resultados. Nós estudamos os efeitos do EUG em correntes macroscópicas de Na+ e os comparamos aos da lidocaína, um anestésico local, para referência. O EUG bloqueou, rápida e reversivelmente, correntes de Na+ mistas (TTX-S+TTX-R) assim como as correntes de Na+ TTX-R. As IC50 para a inibição das correntes mistas e TTX-R pelo EUG foram de 2,28 e 2,27 mmol/L, respectivamente. O bloqueio depende da freqüência de despolarizações. Nas correntes mistas, o EUG desloca a curva de ativação para a direita, a de inativação para a esquerda, não altera a cinética de inativação e retarda a recuperação da inativação, rápida e lenta, dos canais. Nas correntes TTX-R, o efeito é semelhante, exceto na curva de ativação, que não é deslocada. Nós concluímos que o EUG bloqueia os NaV por se ligar a estados conformacionais de repouso e inativados, rápido e lento. Os efeitos são semelhantes, mas não idênticos aos da lidocaína. / The previously described inhibitory effects of eugenol (EUG) on voltage-activated Na+ channels (Nav) are not compatible with our results. We have studied the effects of EUG on macroscopic Na+ currents and compared them to the effects of lidocaine, a local anesthetic. EUG blocked both mixed (TTX-S and TTX-R) and TTX-R Na+ currents in a fast and reversible manner. The values of IC50 for the inhibition of mixed and TTX-R currents were 2.28 and 2.27 mmol/L respectively. The blockade depends on frequency of depolarizing pulses. In mixed currents EUG displaced the activation curve to the right, the inactivation curve to the left, does not alter the inactivation kinetics and retards the recovery from inactivation, fast and slow, of the Na+ channels. In TTX-R currents, EUG effects were similar, except on the activation curve, which was not shifted. In conclusion, EUG blocks Nav by binding to the resting and inactivated conformational states of channels, fast and slow. EUG effects resembles lidocaine ones, but are not identical.

Os efeitos inibitórios do eugenol (EUG) em canais para Na+ ativados por voltagem (NaV) mostrados anteriormente não são totalmente compatíveis com nossos resultados. Nós estudamos os efeitos do EUG em correntes macroscópicas de Na+ e os comparamos aos da lidocaína, um anestésico local, para referência. O EUG bloqueou, rápida e reversivelmente, correntes de Na+ mistas (TTX-S+TTX-R) assim como as correntes de Na+ TTX-R. As IC50 para a inibição das correntes mistas e TTX-R pelo EUG foram de 2,28 e 2,27 mmol/L, respectivamente. O bloqueio depende da freqüência de despolarizações. Nas correntes mistas, o EUG desloca a curva de ativação para a direita, a de inativação para a esquerda, não altera a cinética de inativação e retarda a recuperação da inativação, rápida e lenta, dos canais. Nas correntes TTX-R, o efeito é semelhante, exceto na curva de ativação, que não é deslocada. Nós concluímos que o EUG bloqueia os NaV por se ligar a estados conformacionais de repouso e inativados, rápido e lento. Os efeitos são semelhantes, mas não idênticos aos da lidocaína. / The previously described inhibitory effects of eugenol (EUG) on voltage-activated Na+ channels (Nav) are not compatible with our results. We have studied the effects of EUG on macroscopic Na+ currents and compared them to the effects of lidocaine, a local anesthetic. EUG blocked both mixed (TTX-S and TTX-R) and TTX-R Na+ currents in a fast and reversible manner. The values of IC50 for the inhibition of mixed and TTX-R currents were 2.28 and 2.27 mmol/L respectively. The blockade depends on frequency of depolarizing pulses. In mixed currents EUG displaced the activation curve to the right, the inactivation curve to the left, does not alter the inactivation kinetics and retards the recovery from inactivation, fast and slow, of the Na+ channels. In TTX-R currents, EUG effects were similar, except on the activation curve, which was not shifted. In conclusion, EUG blocks Nav by binding to the resting and inactivated conformational states of channels, fast and slow. EUG effects resembles lidocaine ones, but are not identical.

Orientador: Ana Maria Lima de Azeredo-Espin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T11:05:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_NormaMachadoda_D.pdf: 6129934 bytes, checksum: 5d8a07895afd2e470c9fd5caf8ac9fb8 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Cochliomyia hominivorax é considerada uma importante praga por causar perdas econômicas para a pecuária na região Neotropical. Este ectoparasita tem sido controlado principalmente por inseticidas, entretanto, este método normalmente resulta na seleção de indivíduos resistentes. Nesta tese foram investigados mecanismos associados com resistência a inseticidas organofosforados e piretróides. Os resultados apresentados nesta tese estão divididos em dois artigos. No artigo 1 foram investigados dois mecanismos de resistência a piretróides, um conhecido como kdr (knockdown resistance), associado à mutações no canal de sódio, e a mutação W251S no gene da carboxilesterase E3, a qual têm sido associada à hidrólise de piretróides. Foram investigadas populações da atual distribuição geográfica de C. hominivorax através de PCR-RFLP. Para a mutação kdr (L1014F) nenhum indivíduo mutante foi encontrado. Entretanto, a mutação W251S foi encontrada em todas as populações, com as mais altas freqüências nas amostras da Venezuela (100%) e Colômbia (93.75%). Em algumas populações amostradas, apesar da freqüência do alelo mutante ter sido relativamente baixa, o número de indivíduos portadores de pelo menos um alelo mutante foi alto. No bioensaio com cipermetrina (piretróide tipo II), utilizando amostras de Estiva (MG), os resultados analisados através do teste exato de Fisher indicaram que para a mais baixa concentração (p=0.0003) e para uma concentração intermediária (p= 0.024), a presença da mutação W251S está correlacionada com as chances de sobrevivência. Entretanto, na mais alta concentração (p= 0.221) a presença desta mutação não foi correlacionada com a sobrevivência, o que possivelmente indica dificuldade em hidrolisar este tipo de piretróide em concentrações maiores. No Artigo 2, as mutações G137D no gene da carboxilesterase E3, e as mutações I298V, G401A e F466Y no gene da acetilcolinesterase, associadas com resistência a organofosforados, foram investigadas nas mesmas populações do artigo 1, através de PCR-RFLP e sequenciamento direto de PCR. A região codificante completa da acetilcolinesterase também foi caracterizada e proposto um modelo para a estrutura tridimensional desta proteína com base na estrutura da acetilcolinesterase de Drosophila melanogaster. Possíveis alterações na proteína causadas pelas mutações associadas com resistência a organofosforados foram discutidas. No gene da acetilcolinesterase somente 2 de 135 indivíduos analisados apresentaram uma das mutações investigadas, a F466Y, o que pode estar associado ao alto custo no valor adaptativo do indivíduo, causado por algumas mutações neste gene ou inexistência dos demais alelos mutantes nestas populações. Entretanto, para a mutação G137D no gene da E3 foi encontrado um alto número de indivíduos portadores de pelo menos um alelo mutante na maioria das populações brasileiras e no Uruguai. Em Cuba, Venezuela e Colômbia nenhum indivíduo mutante para G137D foi encontrado, o que pode estar relacionado com os inseticidas usados no controle de C. hominivorax nestas regiões ou com a inexistência do alelo mutante nestas localidades. Os resultados de ambos os trabalhos indicam que mutações no gene da carboxilesterase E3 são um dos principais mecanismos de resistência selecionados nesta espécie, dentre os investigados até o momento. Este estudo representa um importante avanço no entendimento da base molecular da resistência a inseticidas em um importante ectoparasita. / Abstract: Cochliomyia hominivorax is an important ectoparasite, causing considerable economic losses to livestock sector in Neotropical region. This ectoparasite has been controlled mainly by applying insecticides, however, this method usually results in the selection of resistant individuals. In this thesis, mechanisms associated with organophosphate and pyrethroid insecticide resistance were investigated. The results presented in this thesis are divided in two articles. In the Article 1 two mechanisms associated with pyrethroid resistance were investigated, the kdr (knockdown resistance), a generic term for mutations in the sodium channel, and a mutation in the residue 251 of the carboxylesterase E3 gene, which have been associated with pyrethroid hydrolysis. Populations of actual geographical distribution of C. hominivorax were investigated through PCR-RFLP. For the kdr mutation, no mutant individuals were found. However, the W251S mutation was found in all populations investigated, with the highest frequencies in the samples from Colombia (100%) and Venezuela (93.75%). In some populations, despite relatively low mutant allele frequency, the number of individuals having at least one mutant allele was high. A bioassay with cypermethrin (pirethroid type II) was also performed, using samples from Estiva (MG). The results of the Fisher's exact test for the lowest concentration (p=0.0003, a= 0.05) and for an intermediate concentration (p= 0.024, a= 0.05) indicated that the presence of W251S mutation are correlated with the survival. However, at the highest concentration, Fisher's exact test (p= 0.221, a= 0.05) indicated that the presence of this mutation was not correlated with survival. These results indicate that the W251S mutation in C. hominivorax probably presents difficulties in hydrolyzing of this kind of pyrethroid, in high concentrations. In the Article 2, the G137D mutation, in the carboxylesterase E3 gene, and the I298V, G401A and F466Y mutations in the acetylcholinesterase gene, associated with organophosphate resistance, were investigated. The same populations of article 1 were analyzed using PCR-RFLP and PCR direct sequencing. The complete coding region of acetylcholineserase also was characterized and a putative model for the three-dimensional structure of this protein was proposed, based on solved structure of Drosophila melanogaster. Possible alterations in the protein, caused by mutations associated with organophosphate resistance, were discussed. For the acetylcholinesterase gene, only 2 of 135 individuals analyzed presented one of the mutations investigated, the F466Y. This fact may be related with the fitness cost of some mutations in this gene, or the inexistence of mutant alleles in these populations. For the G137D mutation, a high number of individuals having at least one mutant allele were found in most of the Brazilian populations and in Uruguay. In Cuba, Venezuela and Colombia no G137D mutant was found, a finding that may be related to the insecticides used for C. hominivorax control in these regions. The results of these two works indicate that mutations in the carboxylesterase E3 gene are one of the main insecticide resistance mechanisms selected in this species, so far investigated. This study represents a significant advance in the understanding of the molecular basis of insecticide resistance in an important livestock ectoparasite. / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Introdução: Estudos experimentais com animais sugerem que a testosterona atua reduzindo a resposta nociceptiva após estímulos inflamatórios e neuropáticos, porém, o mecanismo pela qual este hormônio atua ainda não foi completamente esclarecido. O objetivo deste estudo é avaliar se o bloqueio androgênico com flutamida promove aumento da nocicepção, e ainda, investigar se esta modulação do comportamento doloroso é decorrente de aumento da expressão de canais de sódio voltagemdependente Nav1.7 e Nav1.8 no gânglio da raiz dorsal de ratos após incisão plantar. Método: Os animais estudados foram divididos em um grupo que recebeu flutamida por via subcutânea, e em um grupo controle que recebeu apenas o veículo como placebo. Após o período de indução, foram submetidos a um modelo de incisão plantar, e posteriormente submetidos à avaliação comportamental nos tempos préoperatório, 2 horas após a incisão, 1º, 2º, 3º e 7º dias de pós-operatório. O teste de von Frey foi utilizado para testar o limiar de retirada da pata, e a dor espontânea foi determinada pelo teste da proteção da pata. A expressão dos canais de sódio foi avaliada através da realização de reação de cadeia de polimerase quantitativa em tempo real para os canais Nav1.7 e Nav1.8 em amostra do gânglio da raiz dorsal correspondente à pata operada. Resultados: Os animais tratados com flutamida desenvolveram maior resposta a dor, tanto no teste de dor evocada quanto no teste da proteção da pata em todos os momentos estudados. Os grupos apresentaram diferença estatisticamente significante no 1º, 2º, 3º e 7º dias de pós-operatório para o limiar de retirada da pata. No teste da proteção da pata, foram significantes nos tempos 2 horas, 3º e 7º dia de pós-operatório. Não houve diferença entre os grupos estudados para a expressão de Nav1.7 e Nav1.8, para cada tempo. A análise de variância mostrou que a expressão de Nav1.7 variou em função do tempo em ambos os grupos, o que não ocorreu na expressão de Nav1.8. Conclusão: Neste estudo foi possível demonstrar que o bloqueio androgênico provocou a redução do limiar para retirada da pata após o 1º dia de pós-operatório, e ainda um escore acumulado no teste de proteção do membro que foi mais elevado no tempo 2 horas, no 3º e 7º dia de pós-operatório. Estes dados sugerem que os androgênios apresentaram um efeito antinociceptivo após a incisão plantar, e ainda que este efeito foi independente dos canais Nav1.7 e Nav1.8 no gânglio da raiz dorsal / Introduction: Evidence accumulated over the years has placed sex hormones as key factors of the differences found between males and females. Experimental studies with animals suggest that testosterone acts to reduce the nociceptive response after inflammatory and neuropathic stimuli, but the mechanism by which this hormone acts has not yet been fully elucidated. The objective of this study was to evaluate if androgenic blockade with flutamide promotes increased nociception in rats and to investigate whether this modulation of the painful behavior is due to an increase in the expression of voltage-dependent sodium channels Nav1.7 and Nav1.8 in the Dorsal root ganglion of rats submitted to a postoperative pain model. Methods: The animals studied were divided into a group that received flutamide subcutaneously, and in a control group receiving only placebo. After the induction period, the animals were submitted to a model of plantar incision, and then submitted to behavioral evaluation in the preoperative times, 2 hours after incision, 1st PO, 2nd PO, 3rd PO and 7th PO. The animals were submitted to Von Frey\'s test to determine the evoked pain, and the spontaneous pain was determined by the paw protection test (Guarding Pain). The expression of the sodium channels was evaluated by performing real time quantitative polymerase chain reaction for Nav channels in the dorsal root ganglion sample corresponding to the incised hindpaw. Results: Animals treated with flutamide developed greater nociception in both the evoked pain test and the paw protection test at all times studied. Statistically significant differences were found in the times 1st PO, 2nd PO, 3rd PO and 7th PO for the paw withdrawal threshold. Guarding pain test showed significant results at 2 hours, 3rd PO and 7th PO. No difference was found between the studied groups for the expression of Nav1.7 or Nav1.8 at each time point. Variance analysis showed that Nav1.7 expression was dependent on time in both groups, but Nav1.8 expression did not change over time Conclusions: In this study it was possible to demonstrate that flutamide caused a reduction in the paw withdrawal threshold after the 1st postoperative day, and also a guarding pain score that was higher 2 hours after incision, on the 3rd and 7 th day of postoperative. Data presented in this study suggest an antinociceptive effect of androgens after plantar incision that was independent of Nav channels

Submitted by Ana Damasceno (ana.damasceno@unipampa.edu.br) on 2016-09-13T20:01:43Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Investigação bioquímica e eletrofisiológica da atividade neurotóxica da urease de Canavalia Ensiformis sobre o sistema nervoso de mamíferos.pdf: 4036702 bytes, checksum: 7c0fc1ca67b3af15c724790f838de2ed (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-13T20:01:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Investigação bioquímica e eletrofisiológica da atividade neurotóxica da urease de Canavalia Ensiformis sobre o sistema nervoso de mamíferos.pdf: 4036702 bytes, checksum: 7c0fc1ca67b3af15c724790f838de2ed (MD5) Previous issue date: 2016 / A urease de Canavalia ensiformis (Jack Bean Urease, JBU) possui uma cadeia polipeptídica de 90.770 kDa, com 840 resíduos de aminoácidos. Do ponto de vista biotecnológico, já foram caracterizadas suas ações fungicida e inseticida. Quando administrada na corrente sanguínea de mamíferos, esta, induz convulsões que culminam em morte dos animais, um efeito cujo mecanismo de ação ainda carece de investigação. O objetivo desse trabalho foi investigar os padrões eletrofisiológicos da JBU no sistema nervoso central e periférico de roedores in vivo e in vitro, e as correlações bioquímicas em termos de viabilidade celular e exocitose do L-glutamato. Nos ensaios bioquímicos, verificou-se aumento na liberação de L-glutamato em sinaptossomas corticais de ratos na concentração de 100 nM. Os ensaios de viabilidade celular por MTT em fatias de hipocampo de camundongos não demonstraram alterações. Nos ensaios eletrofisiológicos, verificou-se redução significativa na amplitude do potencial de ação composto (CAP) de nervo ciático de camundongo, nas doses de 1 e 10 nM. Nos ensaios eletroencefalográficos em ratos a injeção da urease (10nM) no hipocampo induziu um traçado de espícula-onda. A redução na amplitude do CAP provavelmente está relacionada a uma inibição dos canais de sódio voltagem-dependentes, já que a administração posterior de tetrodotoxina, não aumentou o nível de bloqueio da condução. Nossos resultados demonstram um efeito excitatório da JBU do tipo crise de ausência sobre o sistema nervoso central de mamíferos. Este resultado sugere o envolvimento dos canais de Ca2+ do tipo T nos efeitos excitatórios da JBU. O bloqueio da condução do nervo ciático de camundongos sugere o envolvimento de canais de Na+ voltagem dependentes, o qual corroboraria a atividade excitatória da urease sobre o sistema nervoso central de mamíferos. / The Canavalia ensiformis urease (Jack Bean Urease) has a 90,770 kDa, polypeptide containing 840 aminoacid residues. JBU is known to exhibit insecticidal and fungicidal activities. When administered endovenously in mammalians, it induces tonic clonic convulsions culminating in the death of the animals. This mechanisms involved in the excitatory activity of JBU has not been elucidated so far. In this work, we sought to investigate the central and peripheral electrophysiological patterns of Jack Bean Urease in rodents, in vivo and in vitro, as well as the biochemical correlation of cell viability and glutamate release. In the biochemical assays, JBU induced increase in L-Glutamate release in rat cortical sinaptossomes, with no alteration of mice hippocampal cell viability. The electrophysiological assays, showed that JBU induce a significant decrease on mice sciatic nerve compound action potentials (CAP), and spike-wave discharges (SWD) similar to “petit mal” seizures when injected directly in the hippocampus (10 nM). The decrease in CAP amplitude is related to a blockage of voltage-gated sodium channels, since it was not affected by the concomitant application of tetrodotoxin. Our results show that JBU exerts an effect of spike wave discharges-like activity over the mammalian central nervous system. This later result suggests an involvement of T-type voltage gated calcium channels in the excitatory activity of JBU. The blockade of mouse sciatic nerve compound action potential conduction corroborates the excitatory activity of the urease upon the mammalian central nervous system.

A diabetes mellitus (DM) pode levar a distúrbios da motilidade gastrointestinal que podem se tornar clinicamente relevantes em alguns pacientes. Modelos de Dm em roedores indicam anormalidades morfofuncionais do sistema nervoso entérico nessa doença. Neste trabalho, avaliamos se o DM experimental pode levar a alterações na eferência colinérgica excitatória, densidade neuronal e expressão dos canais de sódio voltagemdependente (Nav) no plexo mioentérico do íleo. Hiperglicemia induzida por estreptozotocina em ratas foi desenvolvida durante oito semanas. Experimentos de imunofluorescência de tripla marcação revelaram que a densidade de neurônios por área do íleo no DM foi significativamente reduzida quando comparada ao controle. Foram observadas reduções médias de 52,2% do total de neurônios (p=0,0001); 50,0% dos neurônios colinérgicos (p=0,0068) e 54,8% dos neurônios nitrérgicos (p=0,0042). Também foram observadas reduções significativas de neurônios por área de gânglio (28,2% do total, p=0,0002; 27,7% de colinérgicos, p= 0,0002 e 32,1% de neurônios nitrérgicos, p=0,0016). A densidade de fibras colinérgicas na superfície do músculo longitudinal também foi significativamente reduzida (controle: 41 ± 2, DM: 24 ± 3%; p=0,003), embora a análise western-blot não indicasse redução na expressão de ChAT no DM. grupo. A isoforma Nav1.6 foi detectada em diferentes neurônios mioentéricos e a DM tendeu a mudar o padrão de imunomarcação para neurônios de tamanho maior (297,4 ± 10 vs. 372,5 ± 8,4 µm2), mas esse efeito não foi significativo (p=0,3). Os dados de RT-qPCR não sugeriram uma alteração dos transcritos para ChAT, nNOS, Nav1.3, Nav1.6 ou Nav1.7. Nossos dados confirmam a visão de que o DM crônico leva à redução das fibras colinérgicas excitatórias e da densidade neuronal. No entanto, mudanças no perfil de expressão do canal de sódio, que poderiam levar à disfunção neuronal, não foram detectadas. / Diabetes mellitus (DM) may lead to gastrointestinal motility disorders that may become clinically relevant in some patients. Rodent models of DM indicate morpho-functional abnormalities of the enteric nervous system in this disease. In this work, we have evaluated whether experimental DM can lead to changes in excitatory cholinergic efference, neuronal density and voltage-gate sodium channels (Nav) expression in the myenteric plexus of ileum. Streptozotocin-induced hiperglycemia in female rats was allowed to develop during eight weeks. Triple immunofluorescence labeling experiments revealed that the density of neurons per area of ileum in DM was significantly reduced when compared to the control. It were observed average reductions of 52.2% of total neurons (p=0.0001); 50.0% of cholinergic (p=0.0068) and 54.8% of nitrergic neurons (p=0.0042). Significant reductions of neurons per area of ganglion were also observed (28.2% of total, p=0.0002; 27.7% of cholinergic, p=0,0002 and 32.1% of nitrergic neurons, p=0.0016). The cholinergic fibers density at the surface of longitudinal muscle was also significantly reduced (control: 41 ± 2, DM: 24 ± 3%; p=0.003), although western-blot analysis did not indicate a reduction in the expression of ChAT in DM group. The Nav1.6 isoform was detected in different myenteric neurons and DM tended to shift the immunolabeling pattern towards neurons of bigger size (297.4 ± 10 vs. 372.5 ± 8.4 m2), but this effect was not significant (p=0.3). RT-qPCR data did not suggest an alteration of transcripts for ChAT, nNOS, Nav1.3, Nav1.6 or Nav1.7. Our data support the view that chronic DM leads to reduction in excitatory cholinergic fibers and neuronal density. However, changes in sodium channel expression profiling, which could lead to neuronal dysfunction, were not detected. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais

A síndrome de ardência bucal (SAB) é uma condição caracterizada pelo sintoma de ardência na mucosa oral, na ausência de qualquer sinal clínico. Sua etiologia é desconhecida e, até o momento, não dispõe de tratamento efetivo. Há entretanto características de doença neuropática que justificam investigações nesse sentido. O objetivo desse estudo foi mensurar a expressão gênica dos receptores de canais de sódio, Nav 1.7, Nav 1.8 e Nav 1.9, nos pacientes portadores de SAB. A casuística foi composta por dois grupos sendo o grupo de estudo composto por 12 pacientes portadores de SAB, selecionados através do critério estabelecido pela International Headache Society, em 2013 e o grupo controle composto por 4 pacientes não portadores de SAB. As amostras analisadas foram coletadas do dorso lingual, por meio de biópsia realizada com punch de 3 mm e profundidade de 3 mm, estas foram submetidas ao método de análise RT-PCR em tempo real. A expressividade dos genes de canais de sódio foi avaliada nos indivíduos portadores de SAB em relação aos do grupo controle, sendo esta calculada a partir da normalização dos dados da quantificação destes com os da expressão do gene constitutivo (GAPDH), pelo método de Cicle Threshold comparativo e analisados estatisticamente por meio do teste estatístico Mann-Whitnney. Observou-se o aumento da expressão gênica do Nav 1.7 (fold-change = 38.70) e diminuição da expressão gênica do Nav 1.9 (fold-change = 0.89), porém sem diferenças estatisticamente significativas entre os grupos analisados. O gene Nav 1.8 não foi expresso em nenhuma das amostras analisadas. O Nav 1.7 expressa-se tanto em neurônios nociceptivos quanto no sistema nervoso autônomo e mutações no Nav 1.9 tem sido associada a perda de percepção dolorosa. Os resultados obtidos embora não estatisticamente significativos são compatíveis com as características da doença, justificando a extensão dos estudos na linha expressão de genes codificadores dos canais de sódio em pacientes com SAB. / Burning mouth syndrome (BMS) is a condition characterized by symptoms of burning in the oral mucosa, in the absence of any clinical signs. Its etiology is unknown and so far, it has no effective treatment. It is important to mention that BMS exhibits some traits of a neuropathic disease, what justifies a thorough investigation of this subject.The objective of this study was to measure the gene expression of the sodium channel receptors, Nav 1.7, Nav 1.8 and Nav 1.9, in patients with BMS.The sample was composed of two groups, being the study group formed by 12 patients with SAB, selected according to the criteria established by the International Headache Society in 2013, while the compound control group had 4 patients without SAB. The analyzed samples were collected from the tongue, by the biopsy technique with a 3 mm punch and 3mm depth. These samples were processed in real time, following the guidelines set forth by the RT-PCR method. The expressiveness of the sodium channels was evaluated in the individuals with BMS in relation to control group, which was calculated from the normalization of these data with the quantification of the expression of a constitutive gene (GAPDH) by the Cycle Threshold comparative methods and statistically compared by Man-Whitnney test. We observed an increased gene expression of Nav 1.7 (fold-change = 38.70) and a decreased gene expression of Nav 1.9 (fold-change = 0.89), but no statistically significant differences between the groups. Nav 1.8 gene was not expressed in any of the samples. Nav 1.7 is expressed in both nociceptive neurons as the autonomic nervous system and changes in Nav 1.9 has been associated with loss of pain perception. The results although not statistically significant are consistent with the disease characteristics, justifying the extension line of the studies on the expression of genes encoding the sodium channel in patients with SAB.