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The retinal vasculature analysis plays an important role in the diagnosis of ophthalmological diseases, as well as general human disorders that manifest on the retina. The fundus photograph is a 2-D color image modality of the retina and is widely used in modern ophthalmology clinics due to its relatively low cost and its non-invasive access to the retina. However, due to the complexity of the retinal vasculature presented on the image and the large variation of the image quality, no automated method is able to re-construct the retinal vasculature (i.e. construct arteriovenous trees) satisfactorily, thus preventing its analysis on large-scale clinical datasets. In this thesis, we present a systematic and complete study to automatically construct the retinal vasculature on fundus photographs and apply it to a clinical dataset. First of all, a preliminary study is conducted to detect and classify important landmarks in the retinal vasculature using a machine learning method. The evaluation of this method reveals the difficulty of identifying each landmark as an independent target. Then a novel and more global method is proposed to construct retinal arteriovenous trees (A/V trees). The strategy of the proposed method is to build an over-connected vessel network, and separate it into vascular trees, then classify them into A/V trees. Particularly, by taking advantages of specific properties of the retinal vasculature, global and local information are combined together to recognize landmarks of the vasculature. Instead of recognizing each landmark independently as other methods do, this method considers the relationship between landmarks in a more global manner, thus recognizing them simultaneously and globally. With a special graph design, each landmark is associated with multiple possible configurations and costs, and a near optimal solution is selected by minimizing the costs of landmarks and the global property of the whole vascular network. With each landmark recognized, the A/V trees are easily inferred with a pixel classification method. By doing so, local noise in the images and local errors during pre-processing are corrected to some degree, and small vessels that are difficult to classify locally can also be recognized. The proposed method is compared with another method and the evaluation demonstrates its superiority. To demonstrate its potential applicability, we apply the proposed method on a cohort study data of HIV-infected patients with treatment. New metrics to analyze retinal vessel width is developed based on the A/V trees built using the proposed method, and it is compared with a conventional metric. Statistical analysis reveals the advantages of the new metric and thus indicates the benefit of the proposed method and its potential application on large datasets.

Anandamide (AEA), a well characterized endocannabinoid that has actions at multiple targets in the eye, may have potential as a novel therapeutic in the treatment of retinal disease. However, AEA is rapidly degraded by fatty acid amide hydrolase (FAAH). Therefore this study examined the drug URB597, that inhibits FAAH degradation of AEA, to assess AEA effects in experimental models of retinal damage. The objectives were to: 1) evaluate changes present in the aging retina, 2) determine whether the aging retina is more susceptible to tissue damage, and 3) investigate whether increasing AEA can provide retinal neurovascular protection in young and aged retina following damage. The results from this study showed that URB597 had protective effects on retinal ganglion cells and retinal capillaries and inhibited phagocytotic MG in models of retinal damage in young, but not the aged retina.

Retina is a unique site in the human body where the microcirculation can be imaged directly and non-invasively, allowing us to study in vivo the structure and pathology of the human microcirculation. Retinal images can be quantitatively assessed with computerized imaging techniques, enabling us to measure several different quantitative traits derived from the retinal vasculature. Arterial and venular calibres are the most extensively studied traits of the retinal microvasculature and numerous epidemiological studies demonstrated promising associations with systemic and ocular diseases as well as with disease markers. However, there has been a lack of research into pathophysiological processes leading to retinal vascular signs, and how they link retinal microcirculation with coronary and cerebral microvasculature change. Information about genetic determinants underlying retinal vascular structure is therefore important for understanding the processes leading to microvascular pathophysiology. Two genome wide association studies have been published so far revealing four loci associated with retinal venular calibre and one locus with arteriolar calibre. Here the results from the genome-wide association analysis of 10 different retinal vessel traits in two population based cohorts are presented. Retinal images were measured in non-mydriatic fundus images from 808 subjects in the Orkney Complex Disease Study (ORCADES) and 390 subjects from the Croatian island of Korcula, using the semi-automated retinal vasculature measurement programme SIVA and VAMPIRE. Using pairwise estimates of kinship based on genomic sharing, heritability was calculated for each trait. Estimates of tortuosity measure and fractal dimensions present first published reports of heritability estimates for those traits. In addition correlation analysis with systemic risk factor was also completed, confirming already published results as well as revealing some new associations. A genome wide association analysis of retinal arteriolar width revealed a genome wide significant hit (1.8x10-7) in a region of chromosome 2q32 (within TTN gene). Replication was sought in a further independent Scottish population (LBC) and additional 400 retinal images were graded. The result did not replicate, however the direction of the effect was consistent and a larger sample size is required. Analysis of the remaining traits did not yield genome wide significant result,s and will also require larger sample sizes. Genetic analysis of a binary retinal trait was also explored in a case control study of retinal detachment, which is an important cause of vision loss. A two-stage genetic association discovery phase followed by a replication phase in a combined total of 2,833 RRD cases and 7,871 controls was carried out. None of the SNPs tested in the discovery phase reached the threshold for association. Further testing was carried out in independent case-control series from London (846 cases) and Croatia (120 cases). The combined meta-analysis identified one association reaching genome-wide significance for rs267738 (OR=1.29, p=2.11x10-8), a missense coding SNP and eQTL for CERS2 encoding the protein ceramide synthase 2. Additional genetic risk score, pathway analysis and genetic liability analysis were also carried out.

Los fotorreceptores de los mamíferos, las células externas de la retina que detectan la luz, carecen de capacidad de autorregeneración tras una lesión. En los estadios avanzados de las IRD, los fotorreceptores se pierden pero la estructura interna de la retina se conserva durante largos periodos de tiempo, aunque con una importante remodelación sináptica y gliosis. Para estas condiciones, las terapias regenerativas dirigidas a reemplazar los fotorreceptores y establecer sinapsis funcionales con las neuronas internas de la retina viables restantes podrían permitir la recuperación de la visión en pacientes que de otro modo serían ciegos. En otras palabras, la terapia con células madre está dirigida al tratamiento de las degeneraciones de la retina en aquellas situaciones en las que se han perdido los fotorreceptores y, por lo tanto, no es posible restaurar la funcionalidad a través de enfoques más comunes como la terapia de reemplazo de genes. Se han desarrollado y caracterizado células madre embrionarias humanas (hESC) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de células precursoras de fotorreceptores (PRPC) contenidas en organoides de retina (RO) para terapias experimentales regenerativas. Aunque la terapia con células madre es un campo que ha mostrado resultados prometedores en animales de laboratorio, no hay informes que evalúen la seguridad y eficacia de su uso en perros. Con un inyector subretiniano que fue modificado para acomodar el gran tamaño de los agregados celulares, inyectamos con éxito las células en el espacio subretiniano (SRS) canino utilizando un procedimiento quirúrgico sencillo (inyección manual en bolo sin vitrectomía previa). Pudimos monitorizar la supervivencia y las características de las células injertadas a lo largo del tiempo utilizando un enfoque de imagen multimodal que incluía la detección mediante fotografía del fondo de ojo y/o cSLO de los genes reporteros fluorescentes (tdTomato o GFP) expresados por las PRPC. Esto nos permitió superar un reto importante encontrado en otros estudios, donde las células donantes no fluorescentes fueron seguidas sólo por OCT o detectadas por histología después de la terminación. La visualización de las PRPC fluorescentes en el animal vivo nos permitió diferenciarlas de las células del huésped. En consonancia con lo descrito anteriormente, observamos dos patrones temporales de pérdida de células del donante: una reducción temprana del número de células injertadas en la primera semana del trasplante que no dependía del estado de la inmunosupresión (IS), y un rechazo retardado del injerto, observado en aquellos perros que no estaban inmunosuprimidos. De hecho, hasta donde sabemos, no hay estudios que evalúen el tiempo de pérdida de fotorreceptores tras el trasplante, con y sin IS, controlando simultáneamente la transferencia de material citoplasmático entre las células del donante y del huésped. Aquí observamos signos compatibles con el rechazo del trasplante en animales que no recibieron IS sistémico, así como en un único perro cuyo tratamiento con IS se interrumpió. El grado de inflamación clínica variaba entre los animales, pero la vasculitis retiniana, el vítreo turbio y la inflamación de la retina eran comunes en todos los perros con rechazo de las células del donante. Estos signos se detectaron por primera vez entre 1-2 y 12 semanas después del trasplante, lo que respalda la necesidad de un seguimiento frecuente de las retinas tratadas en los meses siguientes al trasplante para detectar posibles signos tempranos de rechazo y ofrecer la oportunidad de ajustar el régimen inmunosupresor. Dado que el rechazo del trasplante en el SRS también puede producirse sin inflamación clínica manifiesta, se justifica la identificación de nuevos biomarcadores que puedan detectar la inflamación subclínica temprana para modular la respuesta inmunitaria y prolongar la supervivencia del injerto. Aunque se desconocen todos los factores que promueven la supervivencia de las células del donante, descubrimos que el IS sistémico desempeñaba un papel fundamental en la supervivencia de las hESC-PRPCs administradas por vía subretiniana, como se había informado anteriormente. En el presente estudio, algunas PRPC desarrollaron estructuras similares a pedículos, expresaron la proteína presináptica sinaptofisina y establecieron contactos con las células bipolares del anfitrión. Estos resultados alentadores preparan ahora el terreno para la evaluación funcional de estas xenosinapsis. La retinosis pigmentaria es un grupo de enfermedades genéticas que provocan una pérdida progresiva de la visión, siendo una de las principales causas de ceguera en los países desarrollados. Está bien documentado que en pacientes con retinosis pigmentaria, existe una disfunción vascular asociada que conduce al adelgazamiento de los vasos; sin embargo, las implicaciones de esta disfunción vascular en la degeneración de los fotorreceptores no se comprenden completamente. Los modelos caninos de degeneraciones retinianas hereditarias han sido de gran relevancia en el desarrollo traslacional de terapias de reemplazo génico para múltiples formas de retinosis pigmentaria, Amaurosis congénita de Leber, y enfermedad de Best. De manera similar a lo que ocurre en pacientes con retinosis pigmentaria, los perros afectados con las mismas mutaciones también experimentan remodelación vascular, sin embargo, la cinética de esta remodelación vascular en enfermedades retinianas hereditarias caninas no se ha estudiado y no se han establecido los parámetros normales en el perro. La angiografía por tomografía de coherencia óptica (OCTA) es un método novedoso de obtención de imágenes sin necesidad del uso de contraste intravenoso que permite la visualización detallada de la circulación retiniana, lo que permite el estudio de los distintos plexos vasculares por separado. Esta importante extracción de imágenes de los diferentes plexos, junto con la alta resolución de estos angiogramas, permite una cuantificación más precisa de la densidad vascular y otros parámetros, teniendo muchas aplicaciones en sujetos sanos y en pacientes con diferentes enfermedades oculares y sistémicas. Con el uso de modernas técnicas de imagen, este trabajo ha confirmado la presencia de cuatro plexos retinianos distintos. Aunque muchos estudios han informado de los datos cuantitativos de las imágenes OCTA en retinas humanas, no se han descrito parámetros vasculares caninos. Este estudio proporciona datos normativos para el SVP+ICP, DCP y WR, estableciendo con éxito un rango de referencia que puede ser consultado y comparado en futuros estudios. En los ojos humanos, el número de plexos retinianos y sus densidades disminuyen hacia la periferia, y esto es similar a lo que Engerman et al. describieron previamente en perros. Nuestro trabajo no sólo confirma este hallazgo, sino que ahora proporciona datos cuantitativos para cuatro parámetros que se utilizan frecuentemente para caracterizar las redes vasculares. En nuestra evaluación, los angiogramas de OCTA tenían una mayor resolución en comparación con las imágenes de AF en la misma localización. Al igual que en el caso de los seres humanos, la angiografía por OCT en perros permitió identificar lechos capilares (ICP y DCP) que no se identificaban con la AF. Sin embargo, la AF proporcionó un mayor campo de visión y los artefactos que se encontraron en algunas de las exploraciones de OCTA (artefactos de movimiento y anormalidades de descorrelación debido al artefacto de proyección) no se observaron en las imágenes de AF. Cuando se compara con las imágenes obtenidas por IHC en montajes completos de retina, nuestro estudio confirma que la OCTA proporciona una buena visualización de la SVP y la DCP. También encontramos que había una subrepresentación de los vasos de pequeño calibre en la OCTA, especialmente los situados en capas altamente reflectantes (ICP). Cuando se compara con las imágenes adquiridas en las mismas localizaciones por microscopía confocal/IHC, nuestros resultados sugieren que la OCTA es una técnica valiosa para visualizar y cuantificar la vasculatura retiniana en perros, especialmente para el análisis de la VD en el DCP. Además, por IHC encontramos que el ICP se fusiona con el SVP pero no con el DCP como ocurre en las retinas humanas. Nuestro estudio ha confirmado la viabilidad del uso de OCTA en perros, proporcionando imágenes resueltas en profundidad de diferentes capas retinianas segmentadas que permiten la evaluación de plexos individuales. Esto allana el camino para otros análisis in vivo de la vasculatura de la retina canina en un amplio número de patologías de la retina con un fenotipo vascular. Además, evaluamos los cambios vasculares en el area centralis de perros afectados por varias formas de IRD que fueron visualizados por OCTA en diferentes etapas de la enfermedad. Identificamos que la DCP está más afectada que las redes vasculares más superficiales en una etapa temprana de la enfermedad. Además, confirmamos que existe una fuerte asociación entre el VD en el DCP y el grosor de la ONL, lo que sugiere que la evaluación de la vascularización en este plexo puede utilizarse como un marcador indirecto para la evaluación de los requisitos metabólicos de la retina externa. Por último, hemos validado mediante el análisis de los vasos en los montajes planos de la retina los hallazgos de la OCTA, y hemos descubierto que en los modelos caninos de IRD la migración de las células del RPE también desempeña un papel en las alteraciones vasculares de la fase posterior que se producen en los pacientes con RP. Encontramos que los cambios microscópicos observados en los vasos con degeneración eran diferentes en las distintas redes retinianas. En la DCP, se confirmó un estrechamiento y una pérdida progresiva de vasos, que acabó con la desaparición completa de esta red. En el SVP de los tres modelos, los vasos presentaban un mayor grosor de la pared debido a la deposición de material que rodea la pared vascular que, en las fases finales, conduce al estrechamiento y la oclusión vascular. En la fase final de la enfermedad, se observó que múltiples vasos de la SVP estaban rodeados de estructuras pigmentadas. El marcaje específico de RPE65 reveló que se trataba de células del PRE que habían migrado para rodear estos vasos internos de la retina. Aquí caracterizamos dos tipos diferentes de degeneración vascular que se producen en los plexos retinianos SVP y DCP, lo que podría aportar información para futuros estudios que evalúen específicamente la fisiopatología de esta degeneración vascular. Un animal del modelo crd2/NPHP5 fue tratado con terapia de reemplazo génica unilateralmente con una inyección subretiniana que cubría el area centralis. En este perro, la pérdida de ONL en el momento de la intervención de terapia génica era inferior al 50%. Al comparar las fotografías del fondo de ojo del ojo no tratado y el tratado, se identificó fácilmente una marcada preservación de la vascularización en el área que fue cubierta por la terapia génica. Las imágenes OCTA se procesaron con el programa AngioTool, y la evaluación cualitativa de las imágenes esqueletizadas mostró una regresión vascular en el ojo no tratado y una notable preservación de la integridad vascular en el ojo tratado. También demostramos que en estas enfermedades naturales, así como en un modelo de degeneración aguda de fotorreceptores inducido por la luz, el DCP se ve afectado antes que los otros plexos vasculares de la retina. La posterior disminución de la VD en el SVP+ICP que se produce en las últimas fases de la degeneración, es probablemente una respuesta al marcado adelgazamiento de la retina externa y a la capacidad de que el oxígeno transportado por los vasos coroideos llegue a las localizaciones internas de la retina, como se ha confirmado previamente en modelos animales felinos utilizando perfiles espaciales de oxigenación de la retina.

This paper deals with identification of persons using retinal biometry. The retinal vasculature is invariant and unique to everyone, which determines it for biometric purposes. The first part of the work includes information about biometrics, biometric systems and reliability measures. The next part describes the principle of using experimental video ophthalmoscope, which was used for retinal vascular imaging and includes the literature research of use of retinal images for biometrics, feature extraction methods and similarity measures. Finally, two algorithms to use the input data are proposed and realized in programming environment MATLAB®. The methods are tested and evaluated on a data set from experimental video ophthalmoscope and on publicly available STRaDe and DRIVE databases.