The histologic distinction of follicular patterned lesions of thyroid, that is follicular adenoma, follicular carcinoma, and the follicular variant of papillary thyroid carcinoma can be extremely difficult. The differential diagnostic criteria regarding nuclear features of papillary thyroid carcinoma are subjective, resulting in high interobserver variability. Although papillary thyroid carcinoma metastasizes mainly via lymphatic vessels, whereas follicular carcinoma spreads mostly hematogenously, there are no data regarding utility of objective quantitative criteria such as lymphatic and general blood vessel density for the differential diagnosis of these lesions. In this study, 35 follicular patterned lesions of thyroid (14 follicular adenomas, 10 follicular carcinomas, and 11 of the follicular variant of papillary thyroid carcinomas) were evaluated immunohistochemically. An assessment of intra- and peritumoral lymphatic vessel density was performed using novel lymphatic endothelium-specific marker D2-40, and the intra- and peritumoral general vessel density was determined by the panendothelial marker CD31. There were no significant differences in the intra- and/or peritumoral general vessel densities, and peritumoral lymphatic vessel densities among follicular adenoma, follicular carcinoma and the follicular variant of papillary thyroid carcinoma. In contrast, the intratumoral lymphatic vessel density was significantly higher in the follicular variant of papillary thyroid carcinoma than in either follicular adenoma or follicular carcinoma (34.63, 15.04, and 0.11 respectively; P<0.0001). The results of the study show that intratumoral lymphatic vessel density may serve as a useful tool in the differential diagnosis of follicular patterned lesions of thyroid. © 2005 USCAP, Inc All rights reserved.

Submitted by Livia Mello (liviacmello@yahoo.com.br) on 2016-09-28T20:16:49Z No. of bitstreams: 1 DissIJ.pdf: 2276989 bytes, checksum: 70bd31f2d0212ca687248df11b43678b (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-20T16:15:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissIJ.pdf: 2276989 bytes, checksum: 70bd31f2d0212ca687248df11b43678b (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-20T16:16:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissIJ.pdf: 2276989 bytes, checksum: 70bd31f2d0212ca687248df11b43678b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-20T16:16:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissIJ.pdf: 2276989 bytes, checksum: 70bd31f2d0212ca687248df11b43678b (MD5) Previous issue date: 2016-03-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Dexamethasone (DEX) is widely used in clinic due to its effectiveness as anti- inflammatory. Nevertheless, its chronic use may cause unwanted metabolic and hemodynamic alterations, which contribute for the development of hypertension. Arterial hypertension may be determined by increases in cardiac output or peripheral resistance and rarefaction may be associated with this response. Microcirculation maintenance is dependent on the balance between anti-apoptotic and apoptotic proteins and vascular endothelial growth factor (VEGF), known to be a key-regulator protein of the physiological angiogenesis, helps to maintain this balance. We recently demonstrated that high doses with DEX-treatment reduce VEGF protein levels, but the mechanisms involved in this response were not evaluated. In the other hand, it has been shown that aerobic training (T) is a good strategy in preventing rarefaction and/or stimulating angiogenesis, however almost nothing is known about the effects of T on microcirculation and hypertension induced by DEX. Therefore, the aim of this study was to investigate the mechanisms induced by T that can contribute to attenuate DEX-induced rarefaction. Wistar rats were subjected to an aerobic exercise protocol on the treadmill or kept sedentary for 8 weeks. Additionally, animals were treated with DEX or saline (50μg/kg, s.c. for 14 days). Groups were: sedentary control (SC), DEX sedentary (SD), trained control (TC) and trained DEX (TD). Body weight (BW) and arterial pressure (AP) were analyzed. After euthanasia, adrenal gland, myocardium, SOL and TA muscles were weighted and normalized by tibia. The cross-sectional area (CSA), capillary:fiber ratio (C:F ratio), capillary density (CD) and protein levels were evaluated in SOL and TA. Treatment with DEX caused reduction in BW and in muscle weight (MW) in TA. DEX treatment also determinated decrease in CSA (TA). Further, C/F and CD were also reduced (-41 and -43%, SOL) and (-30 and 68.6%, TA). Training was able to prevent C:F ratio and CD reduction (72.7 and 81.0%) and (32.9 and 54.2%) induced by DEX- treatment. Furthermore, DEX significantly reduced protein levels in SOL and TA muscles VEGFR-2 (-14.6% and -20.1%), VEGF (-15.6 and -19%), Bcl-2 (-18.4 and20.5%), Bcl-2/Bax ratio (-29.0 and -13.7%) and p-Bax/Bax (-25.4 and -20%), beyond COX-2 in TA (-22.8%). DEX also promoted increase in caspase-3 cleaved (25 and 24.1%, SOL and TA). Moreover, training was able to prevent reduction in proteins levels in DEX-treated groups in SOL and TA: VEGFR-2 (14.7 and 25.2%), VEGF (15.3 and 25.3%), Bcl-2 (21.6 and 35.5%), Bcl-2/Bax ratio (26.1 and 19.9%), p-Bax/Bax (23.7 and 32.1%) and COX-2 (31.5%) and the increase in caspase-3 cleaved (16.0 and 17.8%). In conclusion, these results showed that DEX-induced rarefaction promoted imbalance between apoptotic and angiogenic factors, become one possible causes of hypertension. However, also showed that aerobic training is a good strategy to attenuate DEX-induced rarefaction and this response may involve a better balance between apoptotic and angiogenic factors, which contribute for the attenuation of hypertension. / A dexametasona (DEX) é amplamente utilizada em vários casos clínicos devido a sua eficácia como fármaco anti-inflamatório. Por outro lado, a utilização crônica deste medicamento pode causar alterações metabólicas e hemodinâmicas que contribuem para o desenvolvimento da hipertensão. A hipertensão arterial pode ser determinada pelo aumento no débito cardíaco ou da resistência periférica e a rarefação pode estar associada a esta resposta. A manutenção da microcirculação é dependente do equilíbrio entre proteínas anti e apoptóticas e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) contribui para a manutenção deste equilíbrio. Demonstramos recentemente que altas doses de DEX reduz a produção do VEGF, no entanto, os mecanismos envolvidos nesta resposta não foram avaliados. Por outro lado, tem sido mostrado que o treinamento físico (TF) aeróbio é uma ferramenta importante na prevenção da rarefação e/ou promoção angiogênese, no tratamento da hipertensão, no entanto, quase nada se sabe sobre os efeitos do TF na microcirculação e hipertensão induzida pela DEX. Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar se o tratamento crônico com DEX compromete a densidade de vasos por alterar o balanço angiogênico/apoptótico na musculatura esquelética e se o pré-condicionamento físico aeróbio atenua esta resposta. Para isso, 60 ratos wistar foram submetidos a um protocolo de TF aeróbio na esteira ou mantidos sedentários por 8 semanas. Além disso, os animais foram tratados com DEX ou salina (50μg/kg, s.c. por 14 dias). Os grupos foram separados em: sedentário controle (SC), sedentário e tratado com DEX (SD), treinado controle (TC) e treinado tratado com DEX (TD). O peso corporal (PC) e a pressão arterial (PA) foram analisados. Após a eutanásia, a glândula adrenal, miocárdio e os músculos SOL e TA foram pesados e normalizados pela tíbia. Foram avaliados também, área de secção transversa (AST), razão capilar/fibra (C/F), densidade capilar (DC) e análise da produção proteica dos músculos SOL e TA. O tratamento com DEX causou redução tanto no PC quanto no peso muscular do TA, assim como da AST. Além disso, a DEX reduziu significativamente C/F e DC nos músculos (-41 e -43%, SOL) e (- 30 e 68,6%, TA). Por outro lado, o TF aeróbio preveniu a redução da C/F e DC causado pela DEX (72,7 e 81,0%, SOL) e (32,9 e 54,2%, TA). Já, os níveis proteicos no SOL e TA foram reduzidos significativamente pela DEX: VEGFR-2 (-14,6% e -20,1%), VEGF (-15,6 e -19%), Bcl-2 (-18,4 e -20,5%), razão Bcl-2/Bax (-29,0 e -13,7%) e p-Bax/Bax (- 25,4 e -20%), além da COX-2 no TA (-22,8%). A caspase-3 clivada estava aumentada (16,0 e 17,8%, SOL e TA respectivamente). Em contrapartida, o TF aeróbio foi capaz de prevenir a redução dos níveis proteicos causado pela DEX nos músculos SOL e TA, além de prevenir o aumento da caspase-3 clivada. Em conclusão, os resultados deste presente estudo mostrou que a rarefação induzida DEX ocorreu por promover o desbalanço entre fatores angiogênicos e apoptóticos,sendo esse um dos possíveis mecanismos da hipertensão, no entanto, demonstrou que o TF aeróbio é uma boa estratégia para manter o balanço entre fatores angiogênicos e apoptóticos, o qual contribui para a manutenção da microcirculação na musculatura esquelética e, portanto, pode contribuir para a atenuação da hipertensão induzida pela DEX.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23793号 / 医博第4839号 / 新制||医||1057(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 大森 孝一, 教授 花川 隆, 教授 渡邊 直樹 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Los fotorreceptores de los mamíferos, las células externas de la retina que detectan la luz, carecen de capacidad de autorregeneración tras una lesión. En los estadios avanzados de las IRD, los fotorreceptores se pierden pero la estructura interna de la retina se conserva durante largos periodos de tiempo, aunque con una importante remodelación sináptica y gliosis. Para estas condiciones, las terapias regenerativas dirigidas a reemplazar los fotorreceptores y establecer sinapsis funcionales con las neuronas internas de la retina viables restantes podrían permitir la recuperación de la visión en pacientes que de otro modo serían ciegos. En otras palabras, la terapia con células madre está dirigida al tratamiento de las degeneraciones de la retina en aquellas situaciones en las que se han perdido los fotorreceptores y, por lo tanto, no es posible restaurar la funcionalidad a través de enfoques más comunes como la terapia de reemplazo de genes. Se han desarrollado y caracterizado células madre embrionarias humanas (hESC) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de células precursoras de fotorreceptores (PRPC) contenidas en organoides de retina (RO) para terapias experimentales regenerativas. Aunque la terapia con células madre es un campo que ha mostrado resultados prometedores en animales de laboratorio, no hay informes que evalúen la seguridad y eficacia de su uso en perros. Con un inyector subretiniano que fue modificado para acomodar el gran tamaño de los agregados celulares, inyectamos con éxito las células en el espacio subretiniano (SRS) canino utilizando un procedimiento quirúrgico sencillo (inyección manual en bolo sin vitrectomía previa). Pudimos monitorizar la supervivencia y las características de las células injertadas a lo largo del tiempo utilizando un enfoque de imagen multimodal que incluía la detección mediante fotografía del fondo de ojo y/o cSLO de los genes reporteros fluorescentes (tdTomato o GFP) expresados por las PRPC. Esto nos permitió superar un reto importante encontrado en otros estudios, donde las células donantes no fluorescentes fueron seguidas sólo por OCT o detectadas por histología después de la terminación. La visualización de las PRPC fluorescentes en el animal vivo nos permitió diferenciarlas de las células del huésped. En consonancia con lo descrito anteriormente, observamos dos patrones temporales de pérdida de células del donante: una reducción temprana del número de células injertadas en la primera semana del trasplante que no dependía del estado de la inmunosupresión (IS), y un rechazo retardado del injerto, observado en aquellos perros que no estaban inmunosuprimidos. De hecho, hasta donde sabemos, no hay estudios que evalúen el tiempo de pérdida de fotorreceptores tras el trasplante, con y sin IS, controlando simultáneamente la transferencia de material citoplasmático entre las células del donante y del huésped. Aquí observamos signos compatibles con el rechazo del trasplante en animales que no recibieron IS sistémico, así como en un único perro cuyo tratamiento con IS se interrumpió. El grado de inflamación clínica variaba entre los animales, pero la vasculitis retiniana, el vítreo turbio y la inflamación de la retina eran comunes en todos los perros con rechazo de las células del donante. Estos signos se detectaron por primera vez entre 1-2 y 12 semanas después del trasplante, lo que respalda la necesidad de un seguimiento frecuente de las retinas tratadas en los meses siguientes al trasplante para detectar posibles signos tempranos de rechazo y ofrecer la oportunidad de ajustar el régimen inmunosupresor. Dado que el rechazo del trasplante en el SRS también puede producirse sin inflamación clínica manifiesta, se justifica la identificación de nuevos biomarcadores que puedan detectar la inflamación subclínica temprana para modular la respuesta inmunitaria y prolongar la supervivencia del injerto. Aunque se desconocen todos los factores que promueven la supervivencia de las células del donante, descubrimos que el IS sistémico desempeñaba un papel fundamental en la supervivencia de las hESC-PRPCs administradas por vía subretiniana, como se había informado anteriormente. En el presente estudio, algunas PRPC desarrollaron estructuras similares a pedículos, expresaron la proteína presináptica sinaptofisina y establecieron contactos con las células bipolares del anfitrión. Estos resultados alentadores preparan ahora el terreno para la evaluación funcional de estas xenosinapsis. La retinosis pigmentaria es un grupo de enfermedades genéticas que provocan una pérdida progresiva de la visión, siendo una de las principales causas de ceguera en los países desarrollados. Está bien documentado que en pacientes con retinosis pigmentaria, existe una disfunción vascular asociada que conduce al adelgazamiento de los vasos; sin embargo, las implicaciones de esta disfunción vascular en la degeneración de los fotorreceptores no se comprenden completamente. Los modelos caninos de degeneraciones retinianas hereditarias han sido de gran relevancia en el desarrollo traslacional de terapias de reemplazo génico para múltiples formas de retinosis pigmentaria, Amaurosis congénita de Leber, y enfermedad de Best. De manera similar a lo que ocurre en pacientes con retinosis pigmentaria, los perros afectados con las mismas mutaciones también experimentan remodelación vascular, sin embargo, la cinética de esta remodelación vascular en enfermedades retinianas hereditarias caninas no se ha estudiado y no se han establecido los parámetros normales en el perro. La angiografía por tomografía de coherencia óptica (OCTA) es un método novedoso de obtención de imágenes sin necesidad del uso de contraste intravenoso que permite la visualización detallada de la circulación retiniana, lo que permite el estudio de los distintos plexos vasculares por separado. Esta importante extracción de imágenes de los diferentes plexos, junto con la alta resolución de estos angiogramas, permite una cuantificación más precisa de la densidad vascular y otros parámetros, teniendo muchas aplicaciones en sujetos sanos y en pacientes con diferentes enfermedades oculares y sistémicas. Con el uso de modernas técnicas de imagen, este trabajo ha confirmado la presencia de cuatro plexos retinianos distintos. Aunque muchos estudios han informado de los datos cuantitativos de las imágenes OCTA en retinas humanas, no se han descrito parámetros vasculares caninos. Este estudio proporciona datos normativos para el SVP+ICP, DCP y WR, estableciendo con éxito un rango de referencia que puede ser consultado y comparado en futuros estudios. En los ojos humanos, el número de plexos retinianos y sus densidades disminuyen hacia la periferia, y esto es similar a lo que Engerman et al. describieron previamente en perros. Nuestro trabajo no sólo confirma este hallazgo, sino que ahora proporciona datos cuantitativos para cuatro parámetros que se utilizan frecuentemente para caracterizar las redes vasculares. En nuestra evaluación, los angiogramas de OCTA tenían una mayor resolución en comparación con las imágenes de AF en la misma localización. Al igual que en el caso de los seres humanos, la angiografía por OCT en perros permitió identificar lechos capilares (ICP y DCP) que no se identificaban con la AF. Sin embargo, la AF proporcionó un mayor campo de visión y los artefactos que se encontraron en algunas de las exploraciones de OCTA (artefactos de movimiento y anormalidades de descorrelación debido al artefacto de proyección) no se observaron en las imágenes de AF. Cuando se compara con las imágenes obtenidas por IHC en montajes completos de retina, nuestro estudio confirma que la OCTA proporciona una buena visualización de la SVP y la DCP. También encontramos que había una subrepresentación de los vasos de pequeño calibre en la OCTA, especialmente los situados en capas altamente reflectantes (ICP). Cuando se compara con las imágenes adquiridas en las mismas localizaciones por microscopía confocal/IHC, nuestros resultados sugieren que la OCTA es una técnica valiosa para visualizar y cuantificar la vasculatura retiniana en perros, especialmente para el análisis de la VD en el DCP. Además, por IHC encontramos que el ICP se fusiona con el SVP pero no con el DCP como ocurre en las retinas humanas. Nuestro estudio ha confirmado la viabilidad del uso de OCTA en perros, proporcionando imágenes resueltas en profundidad de diferentes capas retinianas segmentadas que permiten la evaluación de plexos individuales. Esto allana el camino para otros análisis in vivo de la vasculatura de la retina canina en un amplio número de patologías de la retina con un fenotipo vascular. Además, evaluamos los cambios vasculares en el area centralis de perros afectados por varias formas de IRD que fueron visualizados por OCTA en diferentes etapas de la enfermedad. Identificamos que la DCP está más afectada que las redes vasculares más superficiales en una etapa temprana de la enfermedad. Además, confirmamos que existe una fuerte asociación entre el VD en el DCP y el grosor de la ONL, lo que sugiere que la evaluación de la vascularización en este plexo puede utilizarse como un marcador indirecto para la evaluación de los requisitos metabólicos de la retina externa. Por último, hemos validado mediante el análisis de los vasos en los montajes planos de la retina los hallazgos de la OCTA, y hemos descubierto que en los modelos caninos de IRD la migración de las células del RPE también desempeña un papel en las alteraciones vasculares de la fase posterior que se producen en los pacientes con RP. Encontramos que los cambios microscópicos observados en los vasos con degeneración eran diferentes en las distintas redes retinianas. En la DCP, se confirmó un estrechamiento y una pérdida progresiva de vasos, que acabó con la desaparición completa de esta red. En el SVP de los tres modelos, los vasos presentaban un mayor grosor de la pared debido a la deposición de material que rodea la pared vascular que, en las fases finales, conduce al estrechamiento y la oclusión vascular. En la fase final de la enfermedad, se observó que múltiples vasos de la SVP estaban rodeados de estructuras pigmentadas. El marcaje específico de RPE65 reveló que se trataba de células del PRE que habían migrado para rodear estos vasos internos de la retina. Aquí caracterizamos dos tipos diferentes de degeneración vascular que se producen en los plexos retinianos SVP y DCP, lo que podría aportar información para futuros estudios que evalúen específicamente la fisiopatología de esta degeneración vascular. Un animal del modelo crd2/NPHP5 fue tratado con terapia de reemplazo génica unilateralmente con una inyección subretiniana que cubría el area centralis. En este perro, la pérdida de ONL en el momento de la intervención de terapia génica era inferior al 50%. Al comparar las fotografías del fondo de ojo del ojo no tratado y el tratado, se identificó fácilmente una marcada preservación de la vascularización en el área que fue cubierta por la terapia génica. Las imágenes OCTA se procesaron con el programa AngioTool, y la evaluación cualitativa de las imágenes esqueletizadas mostró una regresión vascular en el ojo no tratado y una notable preservación de la integridad vascular en el ojo tratado. También demostramos que en estas enfermedades naturales, así como en un modelo de degeneración aguda de fotorreceptores inducido por la luz, el DCP se ve afectado antes que los otros plexos vasculares de la retina. La posterior disminución de la VD en el SVP+ICP que se produce en las últimas fases de la degeneración, es probablemente una respuesta al marcado adelgazamiento de la retina externa y a la capacidad de que el oxígeno transportado por los vasos coroideos llegue a las localizaciones internas de la retina, como se ha confirmado previamente en modelos animales felinos utilizando perfiles espaciales de oxigenación de la retina.