With high energy consumption and a low capacity for energy storage, the brain is highly dependent on a continuous supply of oxygen and nutrients from the bloodstream. Ischemic stroke, caused by the occlusion of a cerebral blood vessel, compromises cerebral blood flow (CBF), resulting in detrimental effects on brain homeostasis, vascular function, and neuronal health. Sex differences in ischemic stroke are known, with women having lower rates of stroke due to a protective role of estrogens on vascular health, and more severe strokes following reduced estrogen production after menopause. Rho-associated protein kinase (ROCK), an important regulator of vascular tone, also regulates vascular function in a sex-specific manner, and its deletion is neuroprotective following ischemic stroke. The current study explores the overlapping roles of ROCK and endogenous hormone influence on the acute CBF response to a photothrombotic (PT) model of ischemic stroke in mice. CBF was measured following stroke in the somatosensory cortex in mice with a heterozygous deletion of the ROCK2 isoform (ROCK2+/-) and in wild-type (WT) littermates. To remove endogenous hormones, male mice were gonadectomized (Gdx) and female mice were ovariectomized (Ovx), and control animals received a sham surgery (“intact”) prior to stroke induction. Intact WT males showed a delayed CBF drop compared to intact WT females, where peak drop in CBF wasn’t observed until 48 hours following stroke. Gonadectomy in males did not alter this response, however ovariectomy in females produced a “male-like” response. ROCK2+/- males also showed such phenotypic response, and Gdx did not alter this response, suggesting ROCK2 deletion or endogenous male hormones do not alter CBF response in males in this stroke model. Alternatively, intact ROCK2+/- females showed a striking difference in CBF values compared to intact WT females, where they displayed higher CBF values immediately post-stroke and also showed a peak drop in CBF at 48 hours post-stroke. Ovx did not change the CBF response in ROCK2+/- females. Overall, there is a marked difference between males and females in their acute CBF responses to PT stroke, which appears to be mediated by endogenous female sex hormones and ROCK2. All groups except for intact WT females show a delayed drop in CBF values, reaching a maximal drop in CBF at 48 hours following stroke induction. This may be due to hyperreactivity of female platelets and upregulation of RhoA/ROCK signaling in female platelets. Further research is required to confirm this speculation. This study reveals important sex-differences and the involvement of ROCK2 in acute CBF responses to PT stroke in mice.

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Primary open-angle glaucoma (POAG) is a leading cause of blindness in the world. A primary risk factor for POAG is elevated intraocular pressure (IOP), caused by increased aqueous humor outflow resistance. Currently, lowering the IOP is the only effective way of treating glaucoma; however, the cause of increased outflow resistance remains unclear. This thesis will present a series of studies which investigated structures of the trabecular outflow pathway, including Schlemm’s canal endothelium, juxtacanalicular tissue, and trabecular beams, and their roles in regulating aqueous outflow resistance. The studies were conducted in both human and animal models using ex vivo ocular perfusion as well as in vitro microfluidic systems. In the first study, we investigated the effects of Y27632, a derivative of Rho-kinase inhibitor that is being developed as next generation glaucoma drug with unclear IOP lowering mechanism, on aqueous humor outflow dynamics and associated morphological changes in normal human eyes and laser-induced ocular hypertensive monkey eyes. In the second study, we developed and validated a novel three-dimensional microfluidic system using lymphatic microvascular endothelial cells. The microfluidic system can be used to study Schlemm’s canal endothelial cell dynamics and aqueous humor transport mechanism in the future. In the last study, we characterized the morphological structure, distribution, and thickness of the endothelial glycocalyx in the aqueous humor outflow pathway of human and bovine eyes. Together these studies will help define new directions for therapy that will help control IOP and preserve vision throughout a normal life span.

Toll-Like Rezeptoren (TLR) erkennen Motive von diversen Komponenten (Proteine, Lipoproteine, Lipopolysaccharide, Nukleinsäuren) von Mikroorganismen, Viren und wirtseigenen Zellen, die als Agonisten eine Signalkaskade induzieren. Diese Agonisten werden als PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Patterns), MAMPs (Microbe-Associated Molecular Patterns) oder DAMPs (Damage-Associated Molecular Patterns) bezeichnet. Werden TLRs stimuliert, kommt es zur Aktivierung von Signalkaskaden, die in einer agonistenspezifischen Freisetzung charakteristischer Muster von proinflammatorischen und antiinflammatorischen Zytokinen münden. Infektionserreger haben unterschiedliche Strategien entwickelt, um mittels Pathogenitätsfaktoren die Erkennung durch Immunzellen und damit der Wirtsimmunantwort zu umgehen. Yersinien, Salmonellen und Shigellen injizieren über Typ 3 Sekretionssysteme (T3SS) Effektorproteine in Wirtszellen und modifizieren die Aktivität von Rho GTPasen. Bisher wurden diese T3SS-Effektoren hinsichtlich Phagozytoseaktivierung bzw. -inhibition untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde die Frage untersucht, welche Rolle die Rho GTPasen von primären murinen Makrophagen für die TLR-Signalkaskade und Zytokinantwort haben könnten. Für diesen Zweck wurden erstmalig M-CSF differenzierte Knochenmarkmakrophagen (M-MΦ) sowie GM-CSF differenzierte Knochenmarkmakrophagen (GM MΦ) mit gendeletierten Rho GTPasen Rac1, RhoA, Rac1/RhoA sowie Cdc42 auf ihre Zytokinantwort nach PAMP (LPS, Pam3CSK4 und CpG) -Stimulierung untersucht. Für die konditionale Gendeletion wurden Mäuse mit „gefloxten“ Rho GTPase-Genen mit LysMCre Mäusen zur zellspezifischen Gendeletion gekreuzt. Die Aktivität des LysM-Promotors wurde in M-MΦ und GM-MΦ aus LysM-eGFP knockin Mäusen überprüft. Dabei wurde nachgewiesen, dass eine LysMCre abhängige Gendeletion mit nachfolgender Depletion von Rho GTPasen sowohl in M-MΦ als auch in GM-MΦ mit sehr hoher Effizienz entsteht. Interessanterweise zeigten GM-MΦ, die in der Literatur auch als DCs bezeichnet und damit keinen aktiven LysM Promotor haben sollten (Clarke and Gordon, 1998), ein starkes LysM-eGFP Signal und wiesen auch Rho GTPase-Gendeletionen auf. Bei den GM-MΦ handelt es sich wahrscheinlich um eine Mischpopulation unterschiedlich differenzierter MΦ-Subpopulationen, die keine klare PAMP/TLR-Signalantwort erwarten lassen. Neben der Verwendung von primären Knochenmarkzellen sollte geprüft werden, ob HoxB8 immortalisierte Knochenmarkzellen (Wang et al., 2006) von konditionalen Rho GTPase-knockout Mäusen ebenso für die TLR Fragestellung verwendet werden können. Das Wachstumsverhalten sowie die Oberflächenmarker der immortalisierten GM-iMΦ ähneln dem der primären GM-MΦ (Rosas et al., 2011), jedoch nicht das Zytokinsekretionsmuster nach TLR-Stimulierung. Da auch die immortalisierten GM-iMΦ heterogene Populationen bilden, wurde auf eine weitere Analyse hinsichtlich der PAMP-Zytokinantwort verzichtet und die Analyse auf primäre M-MΦ fokussiert. In M MΦ(Rac1-/-) und M-MΦ(RhoA-/-) konnten eindeutige Unterschiede zu M-MΦ (wt) und damit eine wichtige Rolle der Rho GTPasen bei der TLR-Signalkaskade und Zytokinantwort in M-MΦ nachgewiesen werden. Die 6 h-Stimulierung mit den spezifischen TLR2-, TLR4- bzw. TLR9-Agonisten Pam3CSK4, LPS bzw. CpG führte in M-MΦ(Rac1-/-) zu verstärkter IL-10 Sekretion (exkl. TLR2), in M MΦ(RhoA-/-) dagegen zu verstärkter IL-12 Sekretion. Nach 24 h-Stimulierung mit den verschiedenen TLR-Agonisten sind die Zytokinmuster für die M-MΦ(wt) und Rho GTPase-deletierten M-MΦ ähnlich (exkl. für IL-10 nach TLR2- und TLR9-Stimulierung). Yersinien injizieren mittels T3SS-Injektisome den Rac1-Inhibitor YopE (Rac-GAP) und den Rho GTPasen-Inhibitor YopT (proteolytische Spaltung des C-terminalen prenylierten Cystein-Membranankers, bevorzugt von RhoA), was zur Inhibition der Rho GTPasen der kontaktierten Phagozyten führt. Es wurden deshalb auch die Zytokinmuster nach TLR-Stimulierung von M-MΦ (Rac1-/-/RhoA-/-) bestimmt. Im Vergleich zu M-MΦ(wt) war die IL-12 Antwort praktisch unverändert, während die TNFα und die IL-6 Antwort der M-MΦ (Rac1-/-/RhoA-/-) erhöht waren. Mit diesen Ergebnissen der Rac1- und RhoA-abhängigen Freisetzung von proinflammatorischen und antiinflammatorischen Zytokinen durch M-MΦ können jetzt gezielte infektionsbiologische Untersuchungen z.B. mit Yersinien durchgeführt werden, um die pathogenetische Bedeutung der mikrobiellen Modulation der Rho GTPasen auf die Wirtsabwehr bzw. Zytokinantwort zu analysieren.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第17799号 / 生博第287号 / 新制||生||37(附属図書館) / 30606 / 京都大学大学院生命科学研究科高次生命科学専攻 / (主査)教授 松崎 文雄, 教授 上村 匡, 教授 根岸 学 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第18169号 / 医博第3889号 / 新制||医||1003(附属図書館) / 31027 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 渡邉 大, 教授 大森 治紀, 教授 髙橋 良輔 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DGAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20277号 / 医博第4236号 / 新制||医||1021(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 渡邊 直樹, 教授 小池 薫, 教授 福田 和彦 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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Cerebral palsy (CP) as a neurodevelopmental disorder that affects individuals’ movement, posture, and balance and occurs in every 2-3 out of 1,000 live births. Symptoms of CP can include seizures, hydrocephalus, impairment of the limbs, and learning disabilities. External contributors to CP are well known, but there are 80% of CP cases are idiopathic and in which no brain injury is reported. Recently, several genetic studies have shown that deleterious de novo mutations in CP patients may be implicated in CP pathogenesis. One such potentially deleterious de novo mutation of RhoB was identified in two CP patients. RhoB encodes for RHOB protein, a Rho GTPase that regulates the actin cytoskeleton. Biochemical and structural analyses of RhoB (S73F) protein suggested that the RhoB mutation generates a hyperactive form of RhoB. However, how the RhoB (S73F) protein may interfere with brain development and can contribute to CP is unknown. To determine whether RhoB (S73F) expression affects cortical development, we used in utero electroporations in mice to study the effect of RhoB (S73F) expression on cellular morphology, polarity, migration, and Golgi localization in the embryonic mouse model at E15.5 and P0, comparing it to a RhoB overexpression model as well as control. To address changes in cell morphology, we examined the cell size, shape, and volume of RhoB expressing cells using Imaris software. We show that RhoB overexpression and RhoB (S73F) expression cause detrimental changes in cell shape, polarity, and neuritogenesis. Furthermore, RhoB (S73F) expressing cells migrate less compared to RhoB overexpressing cells and control. Interestingly, we found that RhoB (S73F) expressing cells that did not migrate away from the ventricular surface still became neurons. To determine the effect of RhoB (S73F) expression on the subcellular environment, we examined the localization of the Golgi apparatus, and found the Golgi to be mislocalized and fragmented when RhoB (S73F) was expressed. Overall, this study shows that overexpression of RhoB is sufficient to cause changes in cell morphology, polarity, migration, and subcellular localization of the Golgi. Importantly, expression of RhoB (S73F) is distinct and unique from RhoB overexpression, causing more severe changes in cell size, shape, polarity, cell process number, and Golgi localization that result in failed neuronal migration. This data suggests the potential for genetic mutations to enact changes within the structure and function of cortical cells, which may contribute to the pathogenesis of CP. / Cell Biology