Doctor en Bioquímica / La riboquinasa humana (RK) (E.C. 2.7.15) pertenece a la superfamilia riboquinasa y cataliza la fosforilación de la D-ribosa usando MgATP como cosustrato, produciendo D-ribosa-5-P y ADP. Aunque la D-ribosa participa en importantes etapas metabólicas, los estudios cinéticos en la RK humana son escasos y preliminares. Alineamientos de secuencia por superposición estructural entre varios miembros de la superfamilia, han mostrado que existen dos motivos de secuencia muy conservados, el motivo NXXE y el motivo GXGD, que se encuentran en el sitio activo de las estructuras de los miembros de la superfamilia. Los residuos Asn y Glu del motivo NXXE estarían relacionados con la unión y uso apropiado de los iones Mg+2 y PO4-3, mientras que el residuo Asp del motivo GXGD actuaría como la base catalítica, que desprotonaría el hidroxilo del sustrato que va a ser fosforilado. En este trabajo determinamos el efecto del K2HPO4 sobre la actividad enzimática, y caracterizamos cinéticamente a la RK humana. A través de mutagénesis sitio dirigida evaluamos el papel de los residuos Asn199, Glu202 y Asp269, en la catálisis y en la unión y regulación por PO4-3 y Mg+2. Los resultados muestran que la RK humana posee una regulación compleja, en la que tanto el PO4-3 como el Mg+2 actúan como activadores, mientras que ambos sustratos y el Mn+2 libre actúan como inhibidores. La caracterización cinética de las mutantes de los motivos NXXE y GXGD muestran que las mutantes N199L y E202L muestran un descenso dramático en la kcat y un aumento de entre 50-70 veces el valor de la KM para MgATP, mientras que la mutante D269N tiene una kcat cerca de 55 veces menor que la enzima silvestre, sin cambios en los valores de KM para ambos sustratos. Sorpresivamente, ninguna de las mutantes es activada por K2HPO4 y todas requieren de una concentración de Mg+2 libre mucho mayor que la requerida por la enzima silvestre, para obtener la actividad máxima. En base al análisis de la estructuras cristalográficas de RK de E. coli (PDBID: 1RKD) y RK de H. sapiens (PDBID: 2FV7) se ha visto que la RK humana uniría al PO4-3 y al Mg+2 dentro del sitio activo, y que esta unión estaría mediada por moléculas de aguas estructurales conservadas que permitirían la formación de puentes de hidrógeno entre el PO4-3 y el Mg+2 y los residuos conservados Asn 199 y Glu202 que se ubican dentro del sitio activo de la enzima, y que forman parte del motivo NXXE. Además, estos residuos participarían en la unión de ATP al sitio activo. Por último, usando el método de acoplamiento molecular del PO4-3 fue posible inferir que el PO4-3 regulador se uniría dentro del sitio activo de la RK humana. Estos resultados demuestran que los residuos Asn199 y Glu202 juegan un rol importante en la catálisis y en la regulación por PO4-3 and Mg+2 y que aunque se ha señalado que el residuo Asp sería la base catalítica para mucho miembros de la familia riboquinasa, su rol en la RK humana no es concluyente / Ribokinase (RK) (E.C. 2.7.15) belongs to the ribokinase superfamily and catalyzes the phosphorylation of the D-ribose using MgATP as cosubstrate, producing D-ribose-5-P and ADP. Even though D-ribose acts in important metabolic steps, kinetic studies of human RK are scarce and preliminary. Structural based sequence alignments of several members of this superfamily have shown two conserved sequence motifs, the NXXE and GXGD motifs, localized at the active site of its members. It has been suggested that the Asn and Glu residues from the NXXE motif are related with Mg2+ and PO43- proper use and binding, while the Asp residue from the GXGD is proposed to act like the catalytic base withdrawing a proton in the substrate to be phophorylated. In this work we have studied the effect exerted by K2HPO4 on human RK activity, and we performed a kinetic characterization of this enzyme. Also, using site-directed mutagenesis we evaluate the role of residues Asn199, Glu202 and Asp269, in catalysis, phosphate and magnesium regulation and binding, The results shown a complex interplay of regulators of RK activity where phosphate and K+ act as activators while both substrates and free Mn2+ acts as inhibitors. Kinetic characterization of mutants of the conserved NXXE and GXGD motifs shows that N199L and E202L enzymes display a dramatic decrease in the kcat value and an increase between 50-70 times in the KM for MgATP, whereas the D269N mutant display a kcat value around 55 times lower than the wild type with almost none changes in the KM values for both substrates. Interestingly, all the mutants lack the activating effect of phosphate and require higher free Mg2+ concentrations than the wild type enzyme to obtain maximal activity. Additionally, molecular docking assays have shown that probably the regulatory PO43- binds inside the active site in human RK. Analysis of the crystallographic structures of E. coli RK (PDBid: 1RKD) and H. sapiens RK (PDBid: 2FV7) shows that PO43- and Mg2+ bind at the active site of human RK, and that several conserved water molecules facilitate interactions between PO43- and Mg2+ and the conserved residues Asn199 and Glu202 trough H bonding. In addition, these residues participate in the ATP binding in human RK active site. These results demonstrated that residues Asn199 and Glu202 play an important role in catalysis and PO43- and Mg2+ regulation and although the conserved Asp residue has been pointed out as the catalytic base in many members of the ribokinase family its role in human ribokinase is not fully understood / FONDECYT