Doctor en Bioquímica / La riboquinasa humana (RK) (E.C. 2.7.15) pertenece a la superfamilia riboquinasa y cataliza la fosforilación de la D-ribosa usando MgATP como cosustrato, produciendo D-ribosa-5-P y ADP. Aunque la D-ribosa participa en importantes etapas metabólicas, los estudios cinéticos en la RK humana son escasos y preliminares. Alineamientos de secuencia por superposición estructural entre varios miembros de la superfamilia, han mostrado que existen dos motivos de secuencia muy conservados, el motivo NXXE y el motivo GXGD, que se encuentran en el sitio activo de las estructuras de los miembros de la superfamilia. Los residuos Asn y Glu del motivo NXXE estarían relacionados con la unión y uso apropiado de los iones Mg+2 y PO4-3, mientras que el residuo Asp del motivo GXGD actuaría como la base catalítica, que desprotonaría el hidroxilo del sustrato que va a ser fosforilado. En este trabajo determinamos el efecto del K2HPO4 sobre la actividad enzimática, y caracterizamos cinéticamente a la RK humana. A través de mutagénesis sitio dirigida evaluamos el papel de los residuos Asn199, Glu202 y Asp269, en la catálisis y en la unión y regulación por PO4-3 y Mg+2. Los resultados muestran que la RK humana posee una regulación compleja, en la que tanto el PO4-3 como el Mg+2 actúan como activadores, mientras que ambos sustratos y el Mn+2 libre actúan como inhibidores. La caracterización cinética de las mutantes de los motivos NXXE y GXGD muestran que las mutantes N199L y E202L muestran un descenso dramático en la kcat y un aumento de entre 50-70 veces el valor de la KM para MgATP, mientras que la mutante D269N tiene una kcat cerca de 55 veces menor que la enzima silvestre, sin cambios en los valores de KM para ambos sustratos. Sorpresivamente, ninguna de las mutantes es activada por K2HPO4 y todas requieren de una concentración de Mg+2 libre mucho mayor que la requerida por la enzima silvestre, para obtener la actividad máxima. En base al análisis de la estructuras cristalográficas de RK de E. coli (PDBID: 1RKD) y RK de H. sapiens (PDBID: 2FV7) se ha visto que la RK humana uniría al PO4-3 y al Mg+2 dentro del sitio activo, y que esta unión estaría mediada por moléculas de aguas estructurales conservadas que permitirían la formación de puentes de hidrógeno entre el PO4-3 y el Mg+2 y los residuos conservados Asn 199 y Glu202 que se ubican dentro del sitio activo de la enzima, y que forman parte del motivo NXXE. Además, estos residuos participarían en la unión de ATP al sitio activo. Por último, usando el método de acoplamiento molecular del PO4-3 fue posible inferir que el PO4-3 regulador se uniría dentro del sitio activo de la RK humana. Estos resultados demuestran que los residuos Asn199 y Glu202 juegan un rol importante en la catálisis y en la regulación por PO4-3 and Mg+2 y que aunque se ha señalado que el residuo Asp sería la base catalítica para mucho miembros de la familia riboquinasa, su rol en la RK humana no es concluyente / Ribokinase (RK) (E.C. 2.7.15) belongs to the ribokinase superfamily and catalyzes the phosphorylation of the D-ribose using MgATP as cosubstrate, producing D-ribose-5-P and ADP. Even though D-ribose acts in important metabolic steps, kinetic studies of human RK are scarce and preliminary. Structural based sequence alignments of several members of this superfamily have shown two conserved sequence motifs, the NXXE and GXGD motifs, localized at the active site of its members. It has been suggested that the Asn and Glu residues from the NXXE motif are related with Mg2+ and PO43- proper use and binding, while the Asp residue from the GXGD is proposed to act like the catalytic base withdrawing a proton in the substrate to be phophorylated. In this work we have studied the effect exerted by K2HPO4 on human RK activity, and we performed a kinetic characterization of this enzyme. Also, using site-directed mutagenesis we evaluate the role of residues Asn199, Glu202 and Asp269, in catalysis, phosphate and magnesium regulation and binding, The results shown a complex interplay of regulators of RK activity where phosphate and K+ act as activators while both substrates and free Mn2+ acts as inhibitors. Kinetic characterization of mutants of the conserved NXXE and GXGD motifs shows that N199L and E202L enzymes display a dramatic decrease in the kcat value and an increase between 50-70 times in the KM for MgATP, whereas the D269N mutant display a kcat value around 55 times lower than the wild type with almost none changes in the KM values for both substrates. Interestingly, all the mutants lack the activating effect of phosphate and require higher free Mg2+ concentrations than the wild type enzyme to obtain maximal activity. Additionally, molecular docking assays have shown that probably the regulatory PO43- binds inside the active site in human RK. Analysis of the crystallographic structures of E. coli RK (PDBid: 1RKD) and H. sapiens RK (PDBid: 2FV7) shows that PO43- and Mg2+ bind at the active site of human RK, and that several conserved water molecules facilitate interactions between PO43- and Mg2+ and the conserved residues Asn199 and Glu202 trough H bonding. In addition, these residues participate in the ATP binding in human RK active site. These results demonstrated that residues Asn199 and Glu202 play an important role in catalysis and PO43- and Mg2+ regulation and although the conserved Asp residue has been pointed out as the catalytic base in many members of the ribokinase family its role in human ribokinase is not fully understood / FONDECYT

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Bioquímica / La Enzima Convertidora de Endotelina - 1c (ECE-1c) es una metaloproteasa de membrana que participa en la síntesis de Endotelina-1 y se ha demostrado que tiene un rol en invasión en cáncer de mama, ovario y próstata. La región N-terminal de ECE-1c posee tres sitios putativos de fosforilación por la proteína kinasa CK2. En esta tesis se estudió la fosforilación de ECE-1c por CK2 y cómo esto afecta la migración e invasión celular en un modelo de cáncer de colon. La hipótesis de esta tesis fue “La proteína kinasa CK2 fosforila y estabiliza a ECE-1c, promoviendo la invasividad de células de cáncer colorrectal”. El objetivo general fue determinar si la proteína kinasa CK2 fosforila a ECE-1c en su extremo N-terminal afectando su estabilidad y si esto tiene un efecto en el potencial invasivo de células de cáncer colorrectal. Para responder a esto se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1. Determinar si CK2 fosforila a ECE-1c en su región N-terminal in vitro y en líneas celulares de cáncer colorrectal; 2. Estudiar si CK2 regula mediante fosforilación la estabilidad ECE-1c en células no tumorales y de cáncer colorrectal; y 3. Evaluar si CK2 regula vía ECE-1c la migración e invasividad in vitro de células de cáncer colorrectal. Un análisis in silico mostró que la región N-terminal de ECE-1c contiene tres sitios putativos de fosforilación por CK2: Thr9, Ser18 y Ser20. En base a este antecedente se realizaron ensayos in vitro utilizando ATP radiactivo y la región N-terminal de ECE-1c fusionada a GST como sustrato, mostrando que CK2 es capaz de fosforilar dicha región. Estos resultados fueron confirmados al analizar los sustratos fosforilados con espectrometría de masas, mostrando que los residuos fosforilados in vitro fueron Ser18 y Ser20. Para demostrar si la fosforilación ocurre en un contexto celular, se inmunoprecipitó ECE-1 en tratamiento con el inhibidor de CK2, TBB, desde células de cáncer de colon DLD-1. La marca de fosforilación se detectó con un anticuerpo antifosfo-S/T/Y, mostrando que la inhibición de CK2 disminuye la marca de fosforilación de ECE-1 total. Posteriormente se evaluó si los niveles de ECE-1 eran afectados por la inhibición de CK2 en células embrionarias HEK-293T y de cáncer de colon DLD- 1. Tal como se esperaba, la inhibición de CK2 utilizando TBB o CX-4945 disminuyó los niveles proteicos de la ECE-1 endógena y de la región N-terminal de ECE-1c fusionada a GFP en ambas líneas celulares. Adicionalmente, se realizaron ensayos de estabilidad proteica utilizando cicloheximida y se mostró que la inhibición de CK2 con TBB disminuyó la estabilidad de la región N-terminal de ECE-1c fusionada a GFP en células embrionarias HEK-293T y de cáncer de colon DLD-1. Por otro lado, las mutantes de ECE-1c fosfomimética (DDD) y no fosforilable (AAA) por CK2 expresadas en células CHO-K1, demostraron tener mayor y menor estabilidad proteica, respectivamente. Finalmente, ensayos funcionales de migración-3D e invasión celular utilizando cámaras de transwell/matrigel, mostraron que ECE-1c es capaz de aumentar el potencial migratorio/invasivo de células de cáncer de colon DLD-1. Además, la sobreexpresión de la mutante no fosforilable por CK2 (AAA) no fue capaz de modificar la capacidad migratoria ni invasiva de esta línea celular. En conclusión, estos resultados sugieren que CK2, por fosforilación en el extremo N-terminal, aumenta la estabilidad de ECE-1c, lo que conduce a un aumento en la invasión de células de cáncer de colon. Estos hallazgos dan luces de un nuevo mecanismo por el cual CK2 promueve la progresión maligna de esta devastadora enfermedad / Endothelin Converting Enzyme - 1c (ECE-1c) is a membrane metalloprotease involved in endothelin-1 synthesis and has been shown to have a role in invasion promotion in breast, ovarian and prostate cancer. N-terminal region of ECE-1c has three putative phosphorylation sites for CK2. In this thesis, we studied whether ECE-1c phosphorylation by CK2 affects cell migration and invasion in a colon cancer model. The hypothesis of this thesis was "CK2 protein kinase phosphorylates and stabilizes ECE-1c, thereby promoting invasiveness of colorectal cancer cells." The overall objective was to determine whether CK2 protein kinase phosphorylates ECE-1c at its N-terminal affecting its stability and whether this has an effect on the invasive potential of colorectal cancer cells. In order to answer this, the following specific objectives were considered; 1. To determine whether CK2 phosphorylates ECE-1c at its Nterminal region in vitro and in colon cancer cell lines; 2. To study whether CK2 phosphorylation regulates ECE-1c stability in non-tumor and colorectal cancer cells; and 3. To evaluate whether CK2 regulates migration and invasion of colorectal cancer cells via ECE-1c phosphorylation. An in silico analysis showed that the N-terminal region of ECE-1c has three putative phosphorylation sites for CK2: Thr9, Ser18 and Ser20. Based on this background, we performed an in vitro phosphorylation assay using radioactive ATP and the N-terminal region of ECE-1c fused to GST as substrate, showing that CK2 phosphorylates this region. These results were confirmed by analyzing phosphorylated substrates with mass spectrometry, showing that the phosphorylated residues were Ser18 and Ser20. To show whether phosphorylation occurs in a cellular context, we performed and immunoprecipitation assay inhibiting CK2 with TBB in DLD-1 colon cancer cells, detecting ECE-1 phosphorylation mark. Phosphorylation was detected with an antifosfo-S/T/Y antibody showing that CK2 inhibition decreases ECE-1 phosphorylation mark. Subsequently we assessed whether ECE-1 levels were affected by CK2 inhibition in HEK-293T cells and DLD-1 colon cancer cells. As expected, CK2 inhibition using TBB or CX-4945 decreased protein levels of endogenous ECE-1 and N-terminal region of ECE-1c fused to GFP in both cell lines. Additionally, assays of protein stability were performed using cycloheximide and showed that inhibition of CK2 with TBB decreased stability of the N-terminal region of ECE-1c fused to GFP in HEK-293T and DLD-1 colon cancer cells. In this context, ECE-1c mutants phosphomimetic and not phosphorylatable by CK2 expressed in CHO-K1 cells were shown to have more or less protein stability, respectively. Finally, functional assays and 3D-cell migration and invasion using Transwell chambers, showed that ECE-1c is capable of increasing the migration/invasiveness potential in DLD-1 cells. In addition, the nonphosphorylatable by CK2 mutant was not able to increase migration or invasive capacity. In conclusion, these results suggest that colon cancer cell invasion is promoted by protein kinase CK2 through the increase of endothelinconverting enzyme-1c protein stability by phosphorylation of its N-terminal end. These findings shed lights on a novel mechanism by which CK2 promotes malignant progression of this devasting disease / Conicyt; Fondecyt