Introdução: As Mucolipidoses II e III (MLII e MLIII) são doenças lisossômicas raras causadas pela deficiência da GlcNac-1-fosfotransferase (fosfotransferase), enzima envolvida na síntese do marcador M6P responsável pelo direcionamento de várias enzimas lisossomais para o lisossomo. A fosfotransferase é codificada pelos genes GNPTAB e GNPTG. O gene GNPTAB codifica as subunidades e da enzima; mutações neste gene provocam tanto a MLII, forma mais grave, quanto a MLIII, forma mais atenuada da doença. O gene GNPTG codifica a subunidade ; mutações neste gene provocam a MLIII. Objetivos: Identificar as mutações no gene GNPTAB presentes em pacientes brasileiros com MLII e MLIII. Metodologia: Os pacientes com diagnóstico bioquímico de ML II/III foram identificados pelo Laboratório de Referência para EIM do HCPA (LREIM-HCPA), Brasil, de 1983 até 2009. Treze pacientes não relacionados (MLII:6, MLIII:5, ML tipo não definido: 2), filhos de casais não-consanguíneos, e oriundos de várias regiões do Brasil, foram incluídos no estudo. Informações clínicas foram obtidas a partir do banco de dados do LREIMHCPA, sendo que o tipo de ML e a altura foram fornecidos pelo médico assistente. Amostras de sangue periférico foram coletadas para extração de DNA genômico. Os 21 exons que compreendem o gene GNPTAB, e respectivas regiões flanqueadoras, foram amplificados a partir de sequências específicas de oligonucleotídeos projetadas para este trabalho. A sequência do gene GNPTAB utilizada como referência para o sequenciamento foi a GenBank NM_024312.3. Resultados: Com a estratégia utilizada, foi possível a identificação de ambas as mutações patogênicas em 6/13 pacientes, e de apenas uma mutação patogênica em cinco pacientes. Em dois pacientes, ambos com MLIII, não foram identificadas mutações patogênicas. Em todos os pacientes foi encontrada pelo menos uma variante não-patogênica, sendo a mais frequente a c.-41-39delGGC (16/26 alelos). A mutação c.3503_3504delTC (p.L1168QfsX5) foi a mais frequente na amostra estudada (n= 7/26 alelos). Considerando regiões codificantes e não-codificantes, quatro novas mutações estão sendo descritas: c.2269_2273delGAAAC (exon 13), c.2808A>G (exon 14), c.323+20delT (intron 3) e c.365+96_97delGT (intron 4). Mutações sem sentido e deleções com alteração na fase de leitura parecem estar relacionadas ao fenótipo grave enquanto, mutações de sentido trocado, estão relacionadas ao fenótipo atenuado. Discussão/Conclusões: Este é o primeiro estudo do gênero realizado em pacientes brasileiros com MLII/III. Assim como é descrito em pacientes de outras populações, o gene GNPTAB apresentou grande heterogeneidade alélica e a mutação patogênica mais frequente encontrada foi a c.3503_3504delTC. Desta forma, sugere-se que a análise de DNA dos pacientes brasileiros com MLII/III seja iniciada pela pesquisa dessa mutação. Como a estratégia empregada detectou 17/26 dos alelos patogênicos, novas análises deverão ser realizadas para os pacientes que apresentam o genótipo parcialmente ou não estabelecido, incluindo a análise do GNPTG. Palavras-chaves: GNPTAB. Mucolipidose. Doenças Lisossômicas. M6P. Doença da Célula de Inclusão. Polidistrofia Pseudo-Hurler. / Introduction: Mucolipidosis II and III (MLII and MLIII) are rare lysosomal diseases caused by a deficiency of GlcNac-1-phosphotransferase (phosphotransferase), the enzyme responsible for the synthesis of marker M6P, which directs several lysosomal enzymes to the lysosome. Phosphotransferase is codified by the GNPTAB and the GNPTG genes. The GNPTAB gene codifies subunits and of the enzyme; mutations in this gene cause both MLII, the most severe form, and MLIII, the most attenuated form of the disease. The GNPTG gene codifies subunit ; mutations in this gene cause MLIII. Objectives: To identify mutations in the GNPTAB gene that are present in Brazilian patients with MLII and MLIII. Methodology: Patients with a biochemical diagnosis of ML II/III were identified at the Reference Laboratory of Inborn Errors of Metabolism of HCPA, Brazil, from 1983 to 2009. Thirteen unrelated patients (MLII: 6, MLIII: 5, undefined ML: 2), born to nonconsanguineous couples and from several regions of Brazil were included in the study. Clinical information was obtained from the database of the LREIM-HCPA, and the type of ML and height of patients were obtained with the assistant physician. Peripheral blood samples were collected for extraction of genomic DNA. The 21 exons that comprise the GNPTAB gene and their respective flanking regions were amplified from the specific sequences of primers designed for this study. The sequence of the GNPTAB gene used as reference for sequencing was GenBank NM_024312.3. Results: As a result of the strategy used, it was possible to identify both pathogenic mutations in 6/13 patients and only one pathogenic mutation in five patients. In two patients, both with MLIII, no pathogenic mutations were identified. At least one non-pathogenic variant was found in all patients, and the most frequently found was c.-41-39delGGC (16/26 alleles). Mutation c.3503_3504delTC (p.L1168QfsX5) was the most frequently found pathogenic mutation in the sample studied (n= 7/26 alleles). As to codifying and noncodifying regions, four novel mutations are being described herein: c.2269_2273delGAAAC (exon 13), c.2808A>G (exon 14), c.323+20delT (intron 3), and c.365+96_97delGT (intron 4). Nonsense mutations and frameshift mutations seem to be related to the severe phenotype, while inverse mutations are related to the attenuated phenotype. Discussion/Conclusions: This is the first study of its kind conducted in Brazilian patients with ML II/III. As it is described in patients of other populations, the GNPTAB gene presented great allelic heterogeneity, and the most frequently found pathogenic mutation was c.3503_3504delTC. Thus, we suggest the DNA analysis of Brazilian patients with MLII/III to be initiated by testing this mutation. As the strategy applied herein detected 17/26 of the pathogenic alleles, new analyses should be conducted for the patients who present a partial or unestablished genotype, including the analysis of the GNPTG gene. Key words: GNPTAB. Mucolipidosis. Lysosomal Disease. M6P. I-cell Disease. Pseudo-Hurler Polydystrophy.

Introdução: As Mucolipidoses II e III (MLII e MLIII) são doenças lisossômicas raras causadas pela deficiência da GlcNac-1-fosfotransferase (fosfotransferase), enzima envolvida na síntese do marcador M6P responsável pelo direcionamento de várias enzimas lisossomais para o lisossomo. A fosfotransferase é codificada pelos genes GNPTAB e GNPTG. O gene GNPTAB codifica as subunidades e da enzima; mutações neste gene provocam tanto a MLII, forma mais grave, quanto a MLIII, forma mais atenuada da doença. O gene GNPTG codifica a subunidade ; mutações neste gene provocam a MLIII. Objetivos: Identificar as mutações no gene GNPTAB presentes em pacientes brasileiros com MLII e MLIII. Metodologia: Os pacientes com diagnóstico bioquímico de ML II/III foram identificados pelo Laboratório de Referência para EIM do HCPA (LREIM-HCPA), Brasil, de 1983 até 2009. Treze pacientes não relacionados (MLII:6, MLIII:5, ML tipo não definido: 2), filhos de casais não-consanguíneos, e oriundos de várias regiões do Brasil, foram incluídos no estudo. Informações clínicas foram obtidas a partir do banco de dados do LREIMHCPA, sendo que o tipo de ML e a altura foram fornecidos pelo médico assistente. Amostras de sangue periférico foram coletadas para extração de DNA genômico. Os 21 exons que compreendem o gene GNPTAB, e respectivas regiões flanqueadoras, foram amplificados a partir de sequências específicas de oligonucleotídeos projetadas para este trabalho. A sequência do gene GNPTAB utilizada como referência para o sequenciamento foi a GenBank NM_024312.3. Resultados: Com a estratégia utilizada, foi possível a identificação de ambas as mutações patogênicas em 6/13 pacientes, e de apenas uma mutação patogênica em cinco pacientes. Em dois pacientes, ambos com MLIII, não foram identificadas mutações patogênicas. Em todos os pacientes foi encontrada pelo menos uma variante não-patogênica, sendo a mais frequente a c.-41-39delGGC (16/26 alelos). A mutação c.3503_3504delTC (p.L1168QfsX5) foi a mais frequente na amostra estudada (n= 7/26 alelos). Considerando regiões codificantes e não-codificantes, quatro novas mutações estão sendo descritas: c.2269_2273delGAAAC (exon 13), c.2808A>G (exon 14), c.323+20delT (intron 3) e c.365+96_97delGT (intron 4). Mutações sem sentido e deleções com alteração na fase de leitura parecem estar relacionadas ao fenótipo grave enquanto, mutações de sentido trocado, estão relacionadas ao fenótipo atenuado. Discussão/Conclusões: Este é o primeiro estudo do gênero realizado em pacientes brasileiros com MLII/III. Assim como é descrito em pacientes de outras populações, o gene GNPTAB apresentou grande heterogeneidade alélica e a mutação patogênica mais frequente encontrada foi a c.3503_3504delTC. Desta forma, sugere-se que a análise de DNA dos pacientes brasileiros com MLII/III seja iniciada pela pesquisa dessa mutação. Como a estratégia empregada detectou 17/26 dos alelos patogênicos, novas análises deverão ser realizadas para os pacientes que apresentam o genótipo parcialmente ou não estabelecido, incluindo a análise do GNPTG. Palavras-chaves: GNPTAB. Mucolipidose. Doenças Lisossômicas. M6P. Doença da Célula de Inclusão. Polidistrofia Pseudo-Hurler. / Introduction: Mucolipidosis II and III (MLII and MLIII) are rare lysosomal diseases caused by a deficiency of GlcNac-1-phosphotransferase (phosphotransferase), the enzyme responsible for the synthesis of marker M6P, which directs several lysosomal enzymes to the lysosome. Phosphotransferase is codified by the GNPTAB and the GNPTG genes. The GNPTAB gene codifies subunits and of the enzyme; mutations in this gene cause both MLII, the most severe form, and MLIII, the most attenuated form of the disease. The GNPTG gene codifies subunit ; mutations in this gene cause MLIII. Objectives: To identify mutations in the GNPTAB gene that are present in Brazilian patients with MLII and MLIII. Methodology: Patients with a biochemical diagnosis of ML II/III were identified at the Reference Laboratory of Inborn Errors of Metabolism of HCPA, Brazil, from 1983 to 2009. Thirteen unrelated patients (MLII: 6, MLIII: 5, undefined ML: 2), born to nonconsanguineous couples and from several regions of Brazil were included in the study. Clinical information was obtained from the database of the LREIM-HCPA, and the type of ML and height of patients were obtained with the assistant physician. Peripheral blood samples were collected for extraction of genomic DNA. The 21 exons that comprise the GNPTAB gene and their respective flanking regions were amplified from the specific sequences of primers designed for this study. The sequence of the GNPTAB gene used as reference for sequencing was GenBank NM_024312.3. Results: As a result of the strategy used, it was possible to identify both pathogenic mutations in 6/13 patients and only one pathogenic mutation in five patients. In two patients, both with MLIII, no pathogenic mutations were identified. At least one non-pathogenic variant was found in all patients, and the most frequently found was c.-41-39delGGC (16/26 alleles). Mutation c.3503_3504delTC (p.L1168QfsX5) was the most frequently found pathogenic mutation in the sample studied (n= 7/26 alleles). As to codifying and noncodifying regions, four novel mutations are being described herein: c.2269_2273delGAAAC (exon 13), c.2808A>G (exon 14), c.323+20delT (intron 3), and c.365+96_97delGT (intron 4). Nonsense mutations and frameshift mutations seem to be related to the severe phenotype, while inverse mutations are related to the attenuated phenotype. Discussion/Conclusions: This is the first study of its kind conducted in Brazilian patients with ML II/III. As it is described in patients of other populations, the GNPTAB gene presented great allelic heterogeneity, and the most frequently found pathogenic mutation was c.3503_3504delTC. Thus, we suggest the DNA analysis of Brazilian patients with MLII/III to be initiated by testing this mutation. As the strategy applied herein detected 17/26 of the pathogenic alleles, new analyses should be conducted for the patients who present a partial or unestablished genotype, including the analysis of the GNPTG gene. Key words: GNPTAB. Mucolipidosis. Lysosomal Disease. M6P. I-cell Disease. Pseudo-Hurler Polydystrophy.

Introdução: As Mucolipidoses II e III (MLII e MLIII) são doenças lisossômicas raras causadas pela deficiência da GlcNac-1-fosfotransferase (fosfotransferase), enzima envolvida na síntese do marcador M6P responsável pelo direcionamento de várias enzimas lisossomais para o lisossomo. A fosfotransferase é codificada pelos genes GNPTAB e GNPTG. O gene GNPTAB codifica as subunidades e da enzima; mutações neste gene provocam tanto a MLII, forma mais grave, quanto a MLIII, forma mais atenuada da doença. O gene GNPTG codifica a subunidade ; mutações neste gene provocam a MLIII. Objetivos: Identificar as mutações no gene GNPTAB presentes em pacientes brasileiros com MLII e MLIII. Metodologia: Os pacientes com diagnóstico bioquímico de ML II/III foram identificados pelo Laboratório de Referência para EIM do HCPA (LREIM-HCPA), Brasil, de 1983 até 2009. Treze pacientes não relacionados (MLII:6, MLIII:5, ML tipo não definido: 2), filhos de casais não-consanguíneos, e oriundos de várias regiões do Brasil, foram incluídos no estudo. Informações clínicas foram obtidas a partir do banco de dados do LREIMHCPA, sendo que o tipo de ML e a altura foram fornecidos pelo médico assistente. Amostras de sangue periférico foram coletadas para extração de DNA genômico. Os 21 exons que compreendem o gene GNPTAB, e respectivas regiões flanqueadoras, foram amplificados a partir de sequências específicas de oligonucleotídeos projetadas para este trabalho. A sequência do gene GNPTAB utilizada como referência para o sequenciamento foi a GenBank NM_024312.3. Resultados: Com a estratégia utilizada, foi possível a identificação de ambas as mutações patogênicas em 6/13 pacientes, e de apenas uma mutação patogênica em cinco pacientes. Em dois pacientes, ambos com MLIII, não foram identificadas mutações patogênicas. Em todos os pacientes foi encontrada pelo menos uma variante não-patogênica, sendo a mais frequente a c.-41-39delGGC (16/26 alelos). A mutação c.3503_3504delTC (p.L1168QfsX5) foi a mais frequente na amostra estudada (n= 7/26 alelos). Considerando regiões codificantes e não-codificantes, quatro novas mutações estão sendo descritas: c.2269_2273delGAAAC (exon 13), c.2808A>G (exon 14), c.323+20delT (intron 3) e c.365+96_97delGT (intron 4). Mutações sem sentido e deleções com alteração na fase de leitura parecem estar relacionadas ao fenótipo grave enquanto, mutações de sentido trocado, estão relacionadas ao fenótipo atenuado. Discussão/Conclusões: Este é o primeiro estudo do gênero realizado em pacientes brasileiros com MLII/III. Assim como é descrito em pacientes de outras populações, o gene GNPTAB apresentou grande heterogeneidade alélica e a mutação patogênica mais frequente encontrada foi a c.3503_3504delTC. Desta forma, sugere-se que a análise de DNA dos pacientes brasileiros com MLII/III seja iniciada pela pesquisa dessa mutação. Como a estratégia empregada detectou 17/26 dos alelos patogênicos, novas análises deverão ser realizadas para os pacientes que apresentam o genótipo parcialmente ou não estabelecido, incluindo a análise do GNPTG. Palavras-chaves: GNPTAB. Mucolipidose. Doenças Lisossômicas. M6P. Doença da Célula de Inclusão. Polidistrofia Pseudo-Hurler. / Introduction: Mucolipidosis II and III (MLII and MLIII) are rare lysosomal diseases caused by a deficiency of GlcNac-1-phosphotransferase (phosphotransferase), the enzyme responsible for the synthesis of marker M6P, which directs several lysosomal enzymes to the lysosome. Phosphotransferase is codified by the GNPTAB and the GNPTG genes. The GNPTAB gene codifies subunits and of the enzyme; mutations in this gene cause both MLII, the most severe form, and MLIII, the most attenuated form of the disease. The GNPTG gene codifies subunit ; mutations in this gene cause MLIII. Objectives: To identify mutations in the GNPTAB gene that are present in Brazilian patients with MLII and MLIII. Methodology: Patients with a biochemical diagnosis of ML II/III were identified at the Reference Laboratory of Inborn Errors of Metabolism of HCPA, Brazil, from 1983 to 2009. Thirteen unrelated patients (MLII: 6, MLIII: 5, undefined ML: 2), born to nonconsanguineous couples and from several regions of Brazil were included in the study. Clinical information was obtained from the database of the LREIM-HCPA, and the type of ML and height of patients were obtained with the assistant physician. Peripheral blood samples were collected for extraction of genomic DNA. The 21 exons that comprise the GNPTAB gene and their respective flanking regions were amplified from the specific sequences of primers designed for this study. The sequence of the GNPTAB gene used as reference for sequencing was GenBank NM_024312.3. Results: As a result of the strategy used, it was possible to identify both pathogenic mutations in 6/13 patients and only one pathogenic mutation in five patients. In two patients, both with MLIII, no pathogenic mutations were identified. At least one non-pathogenic variant was found in all patients, and the most frequently found was c.-41-39delGGC (16/26 alleles). Mutation c.3503_3504delTC (p.L1168QfsX5) was the most frequently found pathogenic mutation in the sample studied (n= 7/26 alleles). As to codifying and noncodifying regions, four novel mutations are being described herein: c.2269_2273delGAAAC (exon 13), c.2808A>G (exon 14), c.323+20delT (intron 3), and c.365+96_97delGT (intron 4). Nonsense mutations and frameshift mutations seem to be related to the severe phenotype, while inverse mutations are related to the attenuated phenotype. Discussion/Conclusions: This is the first study of its kind conducted in Brazilian patients with ML II/III. As it is described in patients of other populations, the GNPTAB gene presented great allelic heterogeneity, and the most frequently found pathogenic mutation was c.3503_3504delTC. Thus, we suggest the DNA analysis of Brazilian patients with MLII/III to be initiated by testing this mutation. As the strategy applied herein detected 17/26 of the pathogenic alleles, new analyses should be conducted for the patients who present a partial or unestablished genotype, including the analysis of the GNPTG gene. Key words: GNPTAB. Mucolipidosis. Lysosomal Disease. M6P. I-cell Disease. Pseudo-Hurler Polydystrophy.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O controle traducional mediado pela fosforilacao da subunidade alfa do fator de inicio de traducao 2 (eIF2a) e um ponto central para programas de expressao genica induzidos por estresse. Tripanossomatideos, importantes patogenos humanos, apresentam processos de diferenciacao desencadeados pelo contato com os distintos ambientes encontrados em seus insetos vetores e hospedeiros mamiferos, provavelmente representando situacoes de estresse. Trypanosoma brucei, o agente causador da tripanossomiase africana, codifica tres potenciais quinases de eIF2α (TbeIF2Kl-K3). Neste trabalho, nos mostramos que TbeIF2K2 e uma glicoproteina associada a membrana, expressa tanto na forma prociclica quanta na sanguinea. 0 dominio catalitico de TbeIF2K2 fosforila eIF2α de levedura e de mamiferos na Ser51. A quinase tambem fosforila a incomum forma de eIF2α encontrada em tripanossomatideos, especificamente no residuo Thr169, que corresponde a Ser51 em outros eucariotos. 0 eIF2α de T brucei, no entanto, nao e um substrato para GCN2 ou PKR in vitro. 0 dominio regulatorio putativo de TbeIF2K2 nao apresenta nenhuma similaridade de sequencia com as quinases de eIF2α conhecidas. Tanto na forma sanguinea quanto na prociclica, TbeIF2K2 esta localizada principalmente na bolsa flagelar, organela que e o local exclusivo de exo e endocitose nesses parasitas. Ela tambem pode ser detectada em compartimentos endociticos, mas nao em lisossomos, sugerindo que a quinase e reciclada entre os endossomos e a bolsa flagelar. A localizacao de TbeIF2K2 sugere que ela possa funcionar como um sensor do transporte de nutrientes ou proteinas em T brucei, um organismo que depende de mecanismos regulatorios pos-transcricionais para controlar a expressao genica em diferentes situacoes. Essa e a primeira quinase de eIF2α associada a membrana descrita em eucariotos unicelulares / Translational control mediated by phosphorylation of the alpha subunit of the eukaryotic initiation factor 2 (eIF2α) is central to stress-induced programs of gene expression. Trypanosomatids, important human pathogens, display differentiation processes elicited by contact with the distinct physiological milieu found in their insect vectors and mammalian hosts, likely representing stress situations. Trypanosoma brucei, the agent of African trypanosomiasis, encodes three potential eIF2α kinases (TbeIF2K1-K3). We show here that TbeIF2K2 is a transmembrane glycoprotein expressed both in procyclic and bloodstream forms. The catalytic domain of TbeIF2K2 phosphorylates yeast and mammalian eIF2α at Ser51. It also phosphorylates the highly unusual form of eIF2α found in trypanosomatids specifically at residue Thr169, that corresponds to Ser51 in other eukaryotes. T. brucei eIF2α, however, is not a substrate for GCN2 or PKR in vitro. The putative regulatory domain of TbeIF2K2 does not share any sequence similarity with known eIF2α kinases. In both procyclic and bloodstream forms TbeIF2K2 is mainly localized in the membrane of the flagellar pocket, an organelle that is the exclusive site of exo- and endocytosis in these parasites. It can also be detected in endocytic compartments but not in lysosomes, suggesting it is recycled between endosomes and the flagellar pocket. TbeIF2K2 location suggests a relevance in sensing protein or nutrient transport in T. brucei, an organism that relies heavily on posttranscriptional regulatory mechanisms to control gene expression in different environmental conditions. This is the first membrane-associated eIF2α kinase described in unicellular eukaryotes. / FAPESP: 02/13783-9 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientador: Jörg Kobarg / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T00:18:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_EduardoCruz_M.pdf: 2623796 bytes, checksum: 858f8566bae7879895e451ce06ad3bfb (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Cinases desempenham um papel importante na ativação de vias bioquímicas em células eucarióticas. Neks (NIMA related kinases) são uma família conservada de proteínas cinases relacionadas à progressão do ciclo celular e divisão celular, contendo em torno de 40% de identidade no domínio catalítico N-terminal com a proteína NIMA (Never in Mitosis, gene A) de Aspergillus nidulans. As cinases Neks são também descritas como relacionadas a patologias, particularmente câncer. Por estas características, as Neks são alvos potenciais para o tratamento de cânceres e desenvolvimento de drogas anti-câncer. Neste trabalho foram selecionados compostos em uma biblioteca de 87 compostos para os domínios de cinase mutados de hNek1, hNek2, hNek6, hNek8 e hNek9 e o domínio de cinase selvagem de hNek7, através de um ensaio de deslocamento térmico. Neste ensaio, foi identificado pelo menos um composto com um deslocamento da Tm significativo para a hNek1 ('delta'262-1258)-(T162A), E08 ('delta'Tm = 4.0ºC); outro, E04 ('delta'Tm = 6.5ºC) para a hNek6(S206A), e vários compostos para a hNek7wt e hNek2(_272-445)-(T175A). Destes compostos, B03 e F04 foram validados por docking no sítio de ligação de ATP da hNek7wt, enquanto B08 e E03 foram validados por reduzir a atividade da hNek7wt até 26,4% e 43,3%, respectivamente, na concentração de 312,5 nM. Além disso, o composto E04 foi capaz de reduzir a atividade da hNek6(S206A) pela metade com um IC50 próximo de 1,25 ?M. São necessários experimentos funcionais adicionais para validação desses dados, e estudos estruturais com resolução atômica serão importantes para caracterizar a associação de hNek1('delta'262-1258)-(T162A), hNek6(S206A) e hNek7 selvagem com esses e outros compostos / Abstract: Kinases play an important role in the activation of biochemical pathways in eukaryotic cells. Neks (NIMA related kinases) are a conserved kinase protein family related to cell cycle progression and cell division, containing about 40% identity in the N-terminal catalytic domain with the protein NIMA (Never in Mitosis, gene A) of Aspergillus nidulans. Nek kinases are also described as related to pathologies, particularly cancer. For these characteristics, Neks are potential targets for treatment of cancers and development of anti-cancer drugs. Here we screened the recombinant activation loop mutant kinase domains of hNek1, hNek2, hNek6, hNek8 and hNek9 and wild-type hNek7 against 87 compounds using thermal shift denaturation and identified at least one compound with significant Tm shift for hNek1('delta'262-1258)-(T162A), E08 ('delta'Tm = 4.0ºC), another one, E04 ('delta'Tm = 6.5ºC) for hNek6(S206A), but not for the other hNek6 variants, and several hit compounds for hNek7wt and hNek2('delta'272-445)-(T175A). From these, compounds B03 and F04 were validated by docking into the ATP-binding site of hNek7wt, while B08 and E03 were validated by reducing hNek7wt activity up to 26.4% and 43.3%, respectively, at a 312.5 nM concentration. We also found that mutant hNek6, without the activation loop conserved phosphorylation, is a better target for inhibitor stabilization than an activated more phosphorylated hNek6 kinase. Moreover, compound E04 was later confirmed to reduce hNek6(S206A) activity by half with IC50 near to 1.25 ?M. Further functional experiments in living cells are required to validate this findings, and structural studies with atomic resolution will be important to characterize the association of hNek1('delta'262-1258)-(T162A), hNek6(S206A) and wild-type hNek7 with these and other compounds / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-03-31 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Pesquisas (CNPq e INV) / National Institute of Health (NIH) / Protozoários do gênero Trypanosoma possuem um complexo ciclo de vida, alternando entre hospedeiros vertebrados e invertebrados. A adaptação a essas diversas condições ambientais necessita de rápidas mudanças na expressão gênica para preencher os requerimentos metabólicos ou morfológicos para sobrevivência. Muito pouco se sabe sobre os mecanismos que controlam estas transformações e sobre as vias de sinalização celular implicadas. Como nestes organismos o controle da expressão gênica ocorre ao nível pós transcricional, decidimos neste trabalho estudar a função de proteínas quinases envolvidas no controle da síntese protéica e no crescimento destes parasitas. Em diversos eucariotos a proteína quinase TOR (Target Of Rapamycin) está envolvida no controle da síntese protéica e crescimento celular frente à disponibilidade de nutrientes ou fatores de crescimento. Por análise de seqüências de T. brucei disponíveis nos bancos de dados do genoma desses parasitas encontramos quatro candidatos para TOR (TbTOR1, TbTOR2, TbTOR-like1 and TbTOR-like 2). Dois complexos TOR em T. brucei (TbTORC1 e TbTORC2) foram descritos previamente. No primeiro capítulo desta tese estudamos: TbTOR-like 1 e a comparamos com TbTOR2. TbTOR-like 1 não se encontra em nenhum dos complexos TORC e possui um domínio PDZ não encontrado nas outras TORs de T. brucei ou de outros eucariotos. Ela se localiza em grânulos no citosol que após estresse hiperosmótico migram para a periferia celular. Depleção de TbTOR-like 1 causa uma inibição progressiva do crescimento celular, gerando células de tamanho maior que se acumulam na fase S/G2 do ciclo celular. Estas células também apresentam um aumento no número de acidocalcissomos assim como aumentos nos níveis de polifosfato e pirofosfato. Estes dados indicam que TbTOR-like1 parece estar envolvida no controle do crescimento celular e na biogênese de acidocalcissomos respondendo a variações osmóticas do meio. No segundo capítulo da tese estudamos proteínas quinases envolvidas no controle da síntese protéica através da fosforilação da subunidade  do fator de iniciação eucariótico 2 da tradução (eIF2α. Estas quinases são ativadas por distintos tipos de estresse. T. brucei codifica para três potenciais proteínas quinases de eIF2α (TbeIF2K1, K2 e K3). Estudamos mais especificamente a K2. Mostramos que ela é uma glicoproteína transmembrânica localizada na região da bolsa flagelar em ambas as formas de T. brucei e nos compartimentos endossomais de Trypanosoma cruzi. Estes compartimentos endossomais são denominados de reservossomos e se formam apenas no estágio do parasita que vive no lúmen do tubo digestivo do inseto vetor. Este fato sugere que em ambos os parasitas esta proteína quinase possa estar funcionando como um sensor no transporte de nutrientes e proteínas. De maneira geral revelamos a existência de pelo menos dois mecanismos pelos quais os tripanossomas percebem e resistem às modificações ambientais durante seu ciclo de vida. / Protozoa of the genus Trypanosoma have a complex life cycle alternating between vertebrate and invertebrate hosts. The adaptation to different environmental conditions requires rapid changes in gene expression to fill up the morphological and metabolic requirements for survival. Very little is known about the mechanisms that control these changes and the signaling pathways involved. As in these organisms the control of gene expression occurs at post-transcriptional level, in this work we decided to investigate the function of protein kinases involved in the control of protein synthesis and growth of these parasites. In several eukaryotes TOR (target of rapamycin) protein kinases are involved in protein synthesis control and cell growth in response of the availability of nutrients or growth factors. By searching T. brucei genomic database we found four candidates for TOR (TbTOR1, TbTOR2, TbTOR-like1 and TbTOR-like 2). Two TOR complexes were previously described in T. brucei (TbTORC1 and TbTORC2). In the first chapter of this thesis we study: TbTOR-like 1 and compared it with TbTOR2. TbTOR-like 1 is not present in any of the TORC complexes and has a PDZ domain not found in any of other TORs of T brucei, or other eukaryotes. It is located cytosolic granules that migrate to the cell periphery after hyperosmotic stress. Depletion TbTOR-like 1 causes a progressive inhibition of cell growth, generating enlarged cells that accumulate in S/G2 phase of the cell cycle. These cells also show increased number of acidocalcisomes and augmented levels of polyphosphate and pyrophosphate. These data indicate that TbTOR-like seems to be involved in controlling cell growth and biogenesis of acidocalcisomes responding to osmotic changes in the medium. In the second chapter of the thesis we studied protein kinases involved in protein synthesis control through the phosphorylation of the  subunit of the eukaryotic translation initiation factor 2 (eIF2α).These kinases are activated by different types of stress. T. brucei encodes three potential eIF2α protein kinases (TbeIF2K1, K2 and K3). We studied more specifically the K2. We showed that it is a transmembrane glycoprotein located in the region of the flagellar pocket in both forms of T. brucei, and in the endosomal compartments of Trypanosoma cruzi. These endosomal compartments are known as reservosomes and they are formed only in the parasite’s stage that li ves in the digestive tract lumen of the insect vector. This fact suggests that in both parasites this protein kinase may be acting as a sensor in the transport of nutrients and proteins. In conclusion we revealed the existence of at least two mechanisms by which trypanosomes perceive and resist to environmental changes during their life cycle. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações