El cáncer colorrectal (CCR) es la tercera causa de muerte por cáncer en la Argentina. Las mucinas y sus antígenos carbohidratos asociados han sido relacionados con la proliferación, invasión, metástasis y mal pronóstico. Objetivo: Estudiar la utilidad de MUC1, MUC2, MUC5AC y los antígenos carbohidratos asociados como marcadores tumorales pronósticos y predictivos de respuesta al tratamiento en pacientes con CCR. Materiales: Se incluyeron 248 muestras histológicas: 90 CCR, 64 ganglios linfáticos, 68 muestras de mucosa colorrectal normal, 26 adenomas y 120 muestras sanguíneas. Métodos: Se empleó la técnica de inmunohistoquímica en los tejidos tumorales y radioinmunoanálisis en las sanguíneas. Se utilizó un índice de expresión antigénica (intensidad por el porcentaje de la reacción). Los pacientes fueron estadificados según el TNM (AJCC, edición 2002). Resultados: Independientemente del estadío y del tratamiento instaurado, los pacientes tuvieron una menor sobrevida global (SG) y tiempo libre de progresión (TLP) cuando sus tumores primarios (TP) o ganglios linfáticos metastáticos (GLM) expresaron MUC1, Tn, Lewis x/y, sialil Lewis x y cuando en el núcleo de las células tumorales se halló presente β-catenina. Los pT avanzados se asociaron con mayor expresión de MUC1 y MUC5AC. Estos tumores presentaron mayor expresión de sialil Lewis a/x y Lewis y en sus GLM. El estadío pN2 se asoció con mayor expresión de sialil Lewis a/x. Se observó una mayor expresión de MUC1 y sialil Lewis a/x en los TP de los pacientes con M1. Los TP indiferenciados presentaron una elevada expresión de MUC1 y MUC5AC y una disminución de MUC2, los antígenos del grupo Lewis sialil y CEA. Los TP grado nuclear 3 tuvieron mayor expresión de MUC5AC, Tn, Lewis x y CEA. Un elevado índice mitótico en los TP se correlacionó con una alta expresión de MUC1 y CEA y una baja expresión de MUC2 y MUC5AC. Los GLM con alto índice mitótico expresaron en su mayoría Lewis x/y y sialil Lewis x. MUC1 se halló asociada a la invasión linfática y perineural tumoral. En esta última también se encontró elevada MUC5AC, sialil Lewis a y CEA. Los tumores mayores de 5 cm presentaron una elevada expresión de sialil Lewis x y CEA. El aumento de la expresión de MUC1 se relacionó con cáncer familiar, diabetes mellitus, hábito alcohólico y tabáquico, hipertensión arterial, colecistectomía previa y una pérdida de peso mayor a 10 kg en los dos meses previos al diagnóstico. Se demostró una variación en la expresión de las mucinas y antígenos carbohidratos estudiados siguiendo la secuencia: mucosa normal, mucosa normal adyacente al TP y TP, pudiendo comprobarse que la mucosa normal adyacente al tumor es una zona de transición entre mucosa normal y TP. Conclusión: Las mucinas y los antígenos carbohidratos asociados constituyen parte de los cambios ocurridos tanto durante la carcinogénesis como en los procesos de invasión del CCR. Asimismo, constituirían un elemento a considerar para comprender las recaídas locales.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Bioquímica / La Enzima Convertidora de Endotelina - 1c (ECE-1c) es una metaloproteasa de membrana que participa en la síntesis de Endotelina-1 y se ha demostrado que tiene un rol en invasión en cáncer de mama, ovario y próstata. La región N-terminal de ECE-1c posee tres sitios putativos de fosforilación por la proteína kinasa CK2. En esta tesis se estudió la fosforilación de ECE-1c por CK2 y cómo esto afecta la migración e invasión celular en un modelo de cáncer de colon. La hipótesis de esta tesis fue “La proteína kinasa CK2 fosforila y estabiliza a ECE-1c, promoviendo la invasividad de células de cáncer colorrectal”. El objetivo general fue determinar si la proteína kinasa CK2 fosforila a ECE-1c en su extremo N-terminal afectando su estabilidad y si esto tiene un efecto en el potencial invasivo de células de cáncer colorrectal. Para responder a esto se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1. Determinar si CK2 fosforila a ECE-1c en su región N-terminal in vitro y en líneas celulares de cáncer colorrectal; 2. Estudiar si CK2 regula mediante fosforilación la estabilidad ECE-1c en células no tumorales y de cáncer colorrectal; y 3. Evaluar si CK2 regula vía ECE-1c la migración e invasividad in vitro de células de cáncer colorrectal. Un análisis in silico mostró que la región N-terminal de ECE-1c contiene tres sitios putativos de fosforilación por CK2: Thr9, Ser18 y Ser20. En base a este antecedente se realizaron ensayos in vitro utilizando ATP radiactivo y la región N-terminal de ECE-1c fusionada a GST como sustrato, mostrando que CK2 es capaz de fosforilar dicha región. Estos resultados fueron confirmados al analizar los sustratos fosforilados con espectrometría de masas, mostrando que los residuos fosforilados in vitro fueron Ser18 y Ser20. Para demostrar si la fosforilación ocurre en un contexto celular, se inmunoprecipitó ECE-1 en tratamiento con el inhibidor de CK2, TBB, desde células de cáncer de colon DLD-1. La marca de fosforilación se detectó con un anticuerpo antifosfo-S/T/Y, mostrando que la inhibición de CK2 disminuye la marca de fosforilación de ECE-1 total. Posteriormente se evaluó si los niveles de ECE-1 eran afectados por la inhibición de CK2 en células embrionarias HEK-293T y de cáncer de colon DLD- 1. Tal como se esperaba, la inhibición de CK2 utilizando TBB o CX-4945 disminuyó los niveles proteicos de la ECE-1 endógena y de la región N-terminal de ECE-1c fusionada a GFP en ambas líneas celulares. Adicionalmente, se realizaron ensayos de estabilidad proteica utilizando cicloheximida y se mostró que la inhibición de CK2 con TBB disminuyó la estabilidad de la región N-terminal de ECE-1c fusionada a GFP en células embrionarias HEK-293T y de cáncer de colon DLD-1. Por otro lado, las mutantes de ECE-1c fosfomimética (DDD) y no fosforilable (AAA) por CK2 expresadas en células CHO-K1, demostraron tener mayor y menor estabilidad proteica, respectivamente. Finalmente, ensayos funcionales de migración-3D e invasión celular utilizando cámaras de transwell/matrigel, mostraron que ECE-1c es capaz de aumentar el potencial migratorio/invasivo de células de cáncer de colon DLD-1. Además, la sobreexpresión de la mutante no fosforilable por CK2 (AAA) no fue capaz de modificar la capacidad migratoria ni invasiva de esta línea celular. En conclusión, estos resultados sugieren que CK2, por fosforilación en el extremo N-terminal, aumenta la estabilidad de ECE-1c, lo que conduce a un aumento en la invasión de células de cáncer de colon. Estos hallazgos dan luces de un nuevo mecanismo por el cual CK2 promueve la progresión maligna de esta devastadora enfermedad / Endothelin Converting Enzyme - 1c (ECE-1c) is a membrane metalloprotease involved in endothelin-1 synthesis and has been shown to have a role in invasion promotion in breast, ovarian and prostate cancer. N-terminal region of ECE-1c has three putative phosphorylation sites for CK2. In this thesis, we studied whether ECE-1c phosphorylation by CK2 affects cell migration and invasion in a colon cancer model. The hypothesis of this thesis was "CK2 protein kinase phosphorylates and stabilizes ECE-1c, thereby promoting invasiveness of colorectal cancer cells." The overall objective was to determine whether CK2 protein kinase phosphorylates ECE-1c at its N-terminal affecting its stability and whether this has an effect on the invasive potential of colorectal cancer cells. In order to answer this, the following specific objectives were considered; 1. To determine whether CK2 phosphorylates ECE-1c at its Nterminal region in vitro and in colon cancer cell lines; 2. To study whether CK2 phosphorylation regulates ECE-1c stability in non-tumor and colorectal cancer cells; and 3. To evaluate whether CK2 regulates migration and invasion of colorectal cancer cells via ECE-1c phosphorylation. An in silico analysis showed that the N-terminal region of ECE-1c has three putative phosphorylation sites for CK2: Thr9, Ser18 and Ser20. Based on this background, we performed an in vitro phosphorylation assay using radioactive ATP and the N-terminal region of ECE-1c fused to GST as substrate, showing that CK2 phosphorylates this region. These results were confirmed by analyzing phosphorylated substrates with mass spectrometry, showing that the phosphorylated residues were Ser18 and Ser20. To show whether phosphorylation occurs in a cellular context, we performed and immunoprecipitation assay inhibiting CK2 with TBB in DLD-1 colon cancer cells, detecting ECE-1 phosphorylation mark. Phosphorylation was detected with an antifosfo-S/T/Y antibody showing that CK2 inhibition decreases ECE-1 phosphorylation mark. Subsequently we assessed whether ECE-1 levels were affected by CK2 inhibition in HEK-293T cells and DLD-1 colon cancer cells. As expected, CK2 inhibition using TBB or CX-4945 decreased protein levels of endogenous ECE-1 and N-terminal region of ECE-1c fused to GFP in both cell lines. Additionally, assays of protein stability were performed using cycloheximide and showed that inhibition of CK2 with TBB decreased stability of the N-terminal region of ECE-1c fused to GFP in HEK-293T and DLD-1 colon cancer cells. In this context, ECE-1c mutants phosphomimetic and not phosphorylatable by CK2 expressed in CHO-K1 cells were shown to have more or less protein stability, respectively. Finally, functional assays and 3D-cell migration and invasion using Transwell chambers, showed that ECE-1c is capable of increasing the migration/invasiveness potential in DLD-1 cells. In addition, the nonphosphorylatable by CK2 mutant was not able to increase migration or invasive capacity. In conclusion, these results suggest that colon cancer cell invasion is promoted by protein kinase CK2 through the increase of endothelinconverting enzyme-1c protein stability by phosphorylation of its N-terminal end. These findings shed lights on a novel mechanism by which CK2 promotes malignant progression of this devasting disease / Conicyt; Fondecyt

El presente trabajo es un estudio correlacional de tipo retrospectivo, de casos y controles, siendo 39 pacientes con cáncer colorrectal del tipo histológico mucinoso los que conforman el grupo de los casos y dos grupos de 117 pacientes cado uno, el primero de pacientes con cáncer colorrectal de otro tipo histológico y el segundo de pacientes con patología digestiva benigna, que conforman los controles; coleccionados entre los años 2002 y 2008 en el Hospital Nacional Edgardo Rebagliati Martins. Se determinó la asociación de los factores de riesgo como: la edad, el género, de riesgo el consumo de tabaco, el consumo de alcohol, la irradiación pélvica, la colecistectomía, el tipo de dieta, la obesidad, otros tipos de cáncer previos, la raza, algunas características clínicopatológicas tales como: la localización del tumor, el grado de diferenciación, el estadio de la enfermedad al momento del diagnóstico y la respuesta al tratamiento recibido; y el cáncer colorrrectal de tipo histológico mucinoso. Al analizar las varaibles mencionadoas se determino que la edad cada vez mayor es una factor de riesgo asociado con mayor probabilidad de cáncer no mucinoso, en tanto la variable obesidad es un factor asociado con mayor probabilidad al cáncer mucinoso. En cuanto a la localización del tumor existe asociación entre el cáncer colorrectal de tipo histológico mucinoso y la localización proximal del colon. El grado de diferenciación moderado y el estadio IIA se encontraron con más frecuencia en este estudio. La sobrevida para los tumores de tipo mucinoso es menor que para los otros tipos histológicos a pesar que la diferencia no llegue a ser significativa.

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Características clínicas e histopatológicas asociadas a displasia de alto grado y adenocarcinoma colorrectal. Objetivo: El objetivo del estudio es evaluar los factores asociados a adenomas de alto grado y/o adenocarcinomas colorrectales. Materiales y Métodos. Estudio retrospectivo transversal analítico que incluye todos los pólipos y adenocarcinomas encontrados en las colonoscopias realizadas entre los años 2014 y 2015 en el INEN. La variable dependiente fue la presencia de displasia de alto grado y/o adenocarcinoma colorrectal. Se trabajó con análisis por clusters para maximizar el número de pólipos, mediante el modelo de ecuación estimada generalizada (EEG), a fin de evaluar la asociación entre las variables propuestas y el resultado. Los resultados fueron reportados como razón de prevalencia (RP) con intervalos de confianza al 95%. Resultados: Se realizaron colonoscopias a 2439 pacientes. Se seleccionaron a 416 pacientes (41,3% hombres) obteniéndose 621 pólipos. La prevalencia de adenomas de alto grado y adenocarcinomas fue 47,6%. De las 621 lesiones, 52,5% estuvieron en el colon distal y 47,5% en el proximal. En el análisis multivariado se encontró asociación entre los adenomas de alto grado y los adenocarcinomas colorrectales con longitud mayor a un cm (RP=5,57, IC 95%: 4,16-7,47) y ubicarse en el colon distal (RP=1,20, IC 95%: 1,01-1,41). Conclusión: Existe relación entre el tamaño mayor de un cm y la localización distal con la presencia de adenocarcinoma colorrectal y/o adenoma de alto grado de displasia. / Clinical and histopathological features associated with high grade dysplasia and colorectal adenocarcinoma. Aim: The aim of this study is to determine the associated factors to develop high-grade dysplasia and colorectal adenocarcinoma. Methods: This is a retrospective analytical cross-sectional study, which included all the polyps found in patient’s colonoscopies between 2014 and 2015 at Instituto Nacional de Enfermedades Neoplásicas (INEN). The primary outcome was the presence of high-grade dysplasia or colorectal adenocarcinoma. Multivariate analysis was done using the Generalized Estimating Equation (GEE) to analyze variables such as size, location, age, gender, number of polyps, personal history with the primary outcome. Results were reported in prevalence ratios (PR) and 95% confidence intervals. Results: From the 2439 patients who underwent a colonoscopy between 2014 and 2015, a total of 621 polyps from 416 patients (41.3% males and 58.7% females) were included in this study. The prevalence of high-grade dysplasia and colorectal adenocarcinoma found was 47,6%. The location of the polyps was 52,5% in the left-side and 47,5% in the right-side. Multivariate analysis showed that polyp size ≥1cm (RP=5,57, IC 95%: 4,16-7,47) and left-sided polyps (RP=1,20, IC 95%: 1,01-1,41) had higher probability to develop high-grade dysplasia or colorectal adenocarcinoma. Conclusions: An increase in polyp size and left-sided lesions are associated with high-grade dysplasia or colorectal cancer.

Objetivo: Determinar la frecuencia de polimorfismo rs67085638 de la región no codificante del ARN CCAT1 en pacientes con cáncer colorrectal en el Hospital Regional Lambayeque. Materiales y métodos: Estudio no experimental, descriptivo transversal prospectivo, con una muestra censal de 15 pacientes con diagnóstico de cáncer de colon y recto. Para el genotipado se empleó ADN de la mucosa labial, para la amplificación de la región de interés se emplearon cebadores CCAT1 F: TGAGAGTACCTACCACACAGAA y CCAT1 R: TCTCATAAGGAGCGCACAAC. Para la detección del polimorfismo rs67085638 de la variación de una citosina por timina (C >T) en la región no codificante CCAT1 se secuenció mediante el equipo HiSeq 2500 de ilumina. Para el análisis estadístico se empleó el software estadístico SPSS® versión 25.0 que determinó frecuencias absolutas y relativas. Es importante identificar este polimorfismo del gen CCAT 1 porque la sobreexpresión de este gen está relacionada con la sobrevida general y las posibles recurrencias. Resultados: La frecuencia de polimorfismo rs67085638 fue de 6 casos. De los cuales, 5 fueron heterocigotos (mutación en un solo alelo) y 1 homocigoto (mutación en los dos alelos). Conclusiones: Se concluyó que la frecuencia del polimorfismo rs67085638 (C >T) del CCAT1 se encuentra en el 40% de pacientes con diagnóstico de cáncer colorrectal, siendo predominante en el sexo femenino, estadio clínico III/IV y personas con Índice de Masa Corporal ≥ 25.