GOMES, K. N. Avaliação do efeito da Doxiciclina associada ou não à decametasone no modelo de reparo ósseo alveolar em ratos. 2015. 94 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-09-28T15:45:53Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_kngomes.pdf: 1745792 bytes, checksum: 93bc1957b422226ecef0a412b0c9758b (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-09-28T15:46:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_kngomes.pdf: 1745792 bytes, checksum: 93bc1957b422226ecef0a412b0c9758b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-28T15:46:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_kngomes.pdf: 1745792 bytes, checksum: 93bc1957b422226ecef0a412b0c9758b (MD5) Previous issue date: 2015-11-27 / The alveolar bone repair model, through dental excision in rats, allows the longitudinal study of local and systemic parameters. This allows learning the pathophysiology in inflammatory bone remodeling process. The objective of the research was to investigate the effect of doxycycline associated or not with dexamethasone on the events that follow the bone reabsorption process in alveolar bone repair in rats. The animals (190-200 g) were treated daily (per os) with saline solution Control (SSC), doxycycline (DOX 10 and 25 mg/kg), Dexamethasone (DEXA 1 mg/kg) (IP), and sacrificed according to experimental group (7, 14 and 21 days) to remove their jaws, which were used in the qualitative analysis of microstructural parameters, histomorphometry, and immunohistochemistry for Wnt10b and Dkk-1. It was observed that DOX (10 and 25 mg / kg ) improve some parameters such as the number of osteoblasts increase, reduction in the number of osteoblasts and % increase in bone tissue compared to the CTL group. The results also showed an increase in the expression of Wnt 10b, and Dkk-1 reduction, during the process of bone repair in animals that received DOX (10 and 25 mg/kg), compared to groups CTL. These findings suggest that DOX offers osteoinductive and osteoprotector effects on bone tissue during the alveolar bone remodeling process. It is possible that, in addition to anti-inflammatory effects recognized in DOX, this Tetracycline can influence the expression of Wnt 10b, favoring bone neoformation, and modulate the expression of Dkk-1, inhibiting tissue resorption in the alveolus of the animals. / O modelo de reparo ósseo alveolar através de exérese dentária em ratos permite que parâmetros locais e sistêmicos possam ser estudados longitudinalmente possibilitando o conhecimento da fisiopatogênese no processo de reabsorção óssea inflamatória. O objetivo da pesquisa foi investigar o efeito de doxiciclina associada ou não à dexametasona sobre os eventos que sucedem o processo de remodelamento ósseo em modelo de reparo ósseo alveolar em ratos. Os animais (190-200 g) foram tratados diariamente (v.o.) com solução salina Controle (CTL), doxiciclina (DOX 10mg/kg e 25 mg/kg), Dexametasona (DEXA 1 mg/kg)(i.p.) e sacrificados de acordo com grupo experimental (7, 14 e 21 dias) para remoção de suas maxilas utilizadas na análise qualitativa de parâmetros microestruturais, histomorfometria e imunohistoquímica para Wnt 10b e Dkk-1. Foi observado que DOX (10 e 25 mg/kg) melhoram alguns parâmetros como: aumento do número de osteoblastos, redução no número de osteoblastos e % de tecido ósseo comparados ao grupo CTL. Os resultados também mostraram um aumento na expressão de WNT 10b e redução de Dkk-1 durante o processo de reparo ósseo nos animais que receberam DOX (10 e 25 mg/kg) quando comparados aos grupos CTL. Esses achados sugerem que DOX oferece um efeitos osteoindutor e osteoprotetor do tecido ósseo durante o processo de remodelamento ósseo alveolar. É possível que além dos efeitos antiiflamatórios reconhecidos em DOX, essa Tetraciclina pode influenciar a expressão de WNT 10b, favorecendo a neoformação óssea ou modular a expressão de Dkk-1, inibindo a reabsorção tecidual nos alvéolo dos animais.

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Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:42Z : No. of bitstreams: 1 Publico-094.pdf: 903461 bytes, checksum: edf5b6e40862ad70fc99b723417b0669 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Objetivo: Analisar as vias canônica e não-canônicas da família Wnt no ovário normal e na neoplasia benigna e maligna do ovário. Métodos: Obtiveram-se tecidos ovarianos no período entre 1993 e 2004. As pacientes foram divididas em três grupos: Grupo A, neoplasia ovariana epitelial maligna (N = 38); Grupo B, neoplasia ovariana epitelial benigna (N = 28) e Grupo C, ovários normais (N = 26). A imunoexpressão para Wnt1, Frizzled-1 (FZD1), Wnt5a, Frizzled-5 (FZD5) e Betacatenina foi avaliada em cada grupo. Resultados: A proporção de pacientes Wnt1-positivas no grupo A (29,4%) foi significantemente maior do que nos grupos B (4,3%) e C (9,1%) (p = 0,020). A proporção de mulheres FZD1-positivas no grupo C (54,5%) foi significantemente menor do que nos grupos A (97,1%) e B (90,0%) (p < 0,001). A proporção de pacientes wnt5apositivas foi significantemente maior no grupo A (80,0%) comparado aos grupos B (25,0%) e C (27,3%) (p<0,001). A proporção de pacientes Beta-catenina-positivas no grupo C (95,8%) foi significantemente maior do que no grupo B (52,4%) (p = 0,004). A comparação nas curvas de sobrevida no grupo A relacionada à expressão de Wnt5a mostrou diferença significante entre as pacientes positivas e negativas, sendo que as pacientes Wnt5a-positivas apresentaram resultados piores (p=0,050). Conclusão: Os achados demonstram que as vias relacionadas ao Wnt5a têm papel relevante na neoplasia ovariana maligna. Outrossim, a imunoexpressão do Wnt5a revelou ser marcador de mau prognóstico para câncer de ovário. / Objectives: To analize the canonical and noncanonical Wnt pathway in normal ovary, benign ovarian tumor and ovarian cancer. Methods: Ovarian specimens were obtained from surgeries performed between 1993 and 2004. The patients were divided in three groups: Group A, epithelial ovarian cancer (N = 38); Group B, benign epithelial neoplasia (N = 27) and Group C, normal ovaries (N = 26). Immunoreactivity for Wnt1, FZD1, Wnt5a, FZD5 and -catenin was scored for each group. Results: The proportion of Wnt1 positive women at the group A (29.4%) was significantly higher than the group B (4.3%) and C (9.1%) (p = 0.020). The proportion of FZD1 positive patients in group C (54.5%) was significantly lower than the group A (97.1%) and B (90.0%) (p < 0.001). The proportion of Wnt5a positive women was significantly higher for group A (80.0%) compared to the group B (25.0%) and C (27.3%) (p<0.001). The proportion of ß-catenin positive patients in the group C (95.8%) was significantly higher than the group B (52.4%) (p = 0.004). Comparison of the survival curves in group A according to Wnt5a expression showed a significant difference between positive and negative patients, whereas the Wnt5a positive women showed worse results (p=0.050). Conclusion: Our findings suggest that the pathways related to Wnt5a have an important role in ovarian malignant neoplasia. Furthermore, Wnt5a was found to be a predictor of poor prognosis for ovarian cancer. / FAPESP: 06/51401-1 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000432086-Texto+Completo-0.pdf: 1674235 bytes, checksum: 2ed5ea531f6750c937a1c83b125d4be9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Lithium has been the mainstream treatment for bipolar disorder since 1950s, offering unequivocal prophylactic and acute efficacy against maniac and depressive episodes despite challenges in managing bipolar disorder during pregnancy and the perinatal period. The mechanisms underlying lithium effects are still elusive but exacerbation of wnt-β-catenin signaling system due to GSK-3 inhibition is believed to be its main target. In this study we evaluated effects of lithium exposure during zebrafish early development including behavioral and molecular characterization of the wnt-β-catenin system. Embryos were individually treated for 72hpf with LiCl at 0. 05, 0. 5 and 5mM. No significant malformation and embryotoxic effects were observed. At 10dpf 0. 5 and 5mM lithium-treated larvae showed decreased locomotory behavior resembling lithium-induced Floppy baby syndrome neurobehavioral symptoms. Western blot analysis of selected wnt-β-catenin system components showed an increased β-catenin and decreased N-cadherin protein levels at the end of treatment unaccompanied by wnt3a changes, reinforcing current view of GSK-3 inhibition as the main mechanism of lithium effects. At 10 dpf protein levels were reestablished on control levels for all previously treated groups. qPCR analysis of β-catenin and N-cadherin showed no effects of lithium on these genes expression suggesting protein changes were due to post-transcriptional events. While c-myc gene expression remained unaltered during evaluated periods, cyclin d1 was decreased at 3dpf, and CamkIV oscillated. / Lítio tem sido o principal tratamento para desordens bipolares desde 1950, oferecendo um efeito profilático e agudo contra os episódios maníacos e depressivos, apesar dos desafios encontrados na sua administração durante a gravidez e o período perinatal. Os mecanismo por trás dos efeitos do lítio ainda não foram descritos completamente mas existem evidencias de um efeito sobre a via Wnt-ß-catenina devido a sua capacidade de inibição sobre a GSK-3ß. Neste estudo nós avaliamos os efeitos da exposição ao lítio durante o desenvolvimento inicial de Zebrafish incluindo caracterizações comportamentais e moleculares do sistema Wnt-ß-catenina-Caderina. Embriões foram tratados individualmente por 72hpf com LiCl 0. 05, 0. 5 e 5 mM. Não foram observadas malformações significativas nem efeitos embriotóxicos. Em 10 dpf animais tratados com 0. 5 e 5 mM de lítio demonstraram habilidades locomotoras similares a síndrome induzida por lítio em humanos Floppy baby syndrom. Análises através da técnica de Western blot demonstraram uma expressão aumentada nos níveis de ß-catenina e diminuída para N-caderina. Animais com 10dpf reestabeleceram seus níveis de expressão proteica de acordo com o controle. Análises através da técnica de qPCR não demonstraram nenhum efeito sobre os níveis de ß-catenina ou N-caderina, sugerindo a ocorrência de mudanças pós-transcricionais. Enquanto os níveis de c-myc não foram alterados, houve uma diminuição nos níveis de Cyclin D1 em larvas de 3dpf, enquanto os níveis de CamkIV ocilaram.

Meduloblastoma é um tumor embrionário maligno e invasivo do cerebelo, com manifestação preferencial em crianças, sendo predominantemente de diferenciação neuronal e tendência natural a metastatização por via liquórica. O gene da b-catenina (CTNNB1) está localizado no cromossomo 3p22-p21-3, sendo seu produto uma proteína citoplasmática de 92 kDa, envolvida na adesão celular e na transdução de sinal durante a embriogênese e morfogênese tecidual. A fosforilação da b-catenina é necessária para sua degradação, evitando a associação com o fator de transcrição Tcf (fator de célula T), responsável pela ativação de genes, cujos produtos promovem a proliferação celular. Estudos têm demonstrado a presença da b-catenina no núcleo das células de tumorais, um achado inesperado, pois, tratando-se de uma proteína envolvida na adesão celular, sua expressão seria esperada na membrana celular. Subseqüentemente foram descritas mutações no exon 3 do gene da b-catenina, envolvendo sítios de fosforilação. Este estudo teve como objetivo analisar em meduloblastomas: mutações no gene CTNNB1, o acúmulo da proteína b-catenina, bem como correlacionar ambos os achados entre si e com o tipo histológico e analisar os níveis de expressão relativa de genes envolvidos na via WNT (CTNNB1, AXIN1, WNT1 e APC) e correlaciona-los com o tipo histológico, idade e dados de mutação de CTNNB1 e acúmulo de b-catenina. As amostras de DNA foram extraídas de 67 casos de meduloblastomas. A análise de alterações no exon 3 de CTNNB1 foi realizada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e seqüenciamento direto. A expressão da b-catenina foi analisada pela técnica de imunohistoquímica (IHQ). As análises de expressão relativa de CTNNB1, AXIN1, WNT1 e APC foram realizadas pelo método de PCR quantitativo em tempo real (RQ-PCR) em 31 amostras de meduloblastomas. A freqüência de mutações do exon 3 de CTNBB1 foi de 15%. Foram identificadas 6 mutações missense e em heterozigose em 10 casos: troca de G por A (Asp32Asn) em um caso, troca de C por A (Ser34Tir) em quatro casos, troca de C por G (Ser33Cis) em dois casos, troca G por A (Gli34Arg) em um caso, troca de G por T (Gli34Glu) em um caso e troca de C por A (Ser37Tir) em um caso. Foi observada uma imunorreatividade de ß-catenina no núcleo em 36,4% dos casos analisados. No citoplasma, a ß-catenina estava presente em todos os casos. Não houve correlação entre o tipo histológico e os dados qualitativos e semi-quantitativos de IHQ. Também não houve correlação entre o tipo histológico com os achados de mutações. Não foi observada diferença nos níveis de expressão dos genes CTNNB1, AXIN1 e APC nos meduloblastomas em relação ao tecidos cerebelares não tumorais. Na análise de expressão relativa e a classificação histológica, apenas APC apresentou diferença entre o tipo clássico com o desmoplásico. Não houve diferença dos níveis de expressão relativa em nenhum dos genes com relação à idade do paciente. A presença de mutações de CTNNB1 não afetou a expressão relativa de CTNNB1 e APC. Por outro lado, AXIN1 apresentou uma maior expressão relativa nos casos com mutação. APC apresentou uma menor expressão quanto maior o acúmulo de b-catenina no núcleo. Os dados indicam que outras proteínas da via WNT podem estar envolvidas no acúmulo de b-catenina nas células de meduloblastomas, além do envolvimento de outras diferentes vias. / Medulloblastoma is a malignant invasive embryonal tumor of the cerebellum with a preferential manifestation in children, being predominantly with neuronal differentiation, and a natural tendency to metastasize through spinal fluid pathways. b-catenin gene (CTNNB1) is localized at chromosome 3p22-p21.3 and codifies a cytoplasmatic protein of 92 kDa, involved in cellular adhesion and signal transduction during embriogenesis and tissue morphogenesis. b-catenin phosphorylation is necessary for its degradation, avoiding association with Tcf (T cell factor), responsible for activation of some genes, whose products promote cellular proliferation. Studies have demonstrated the presence of b-catenin in the nucleus of tumoral cells, an unexpected finding because it is a protein involved in cellular adhesion and its normal localization is at the cellular membrane. Subsequentially, mutations in the phosphorylation sites, localized at the exon 3 of b-catenin gene, have been described. The aims of this study were to analyze in medulloblastomas: CTNNB1 gene mutations, the protein b-catenin accumulation, as well as to correlate both findings between them and with the histological type and to analyze the relative expression levels of genes involved in the WNT pathway (CTNNB1, AXIN1, WNT1 and APC). DNA samples were extracted from 67 cases of medulloblastoma. Alterations of CTNNB1 exon 3 were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) and direct sequencing. The expression of the protein b-catenin was assessed by immunohistochemistry (IHC). The relative expression analyses of CTNNB1, AXIN1, WNT1 and APC were determined by quantitative real time PCR (RQ-PCR) in 31 medulloblastoma samples. The frequency of CTNBB1 exon 3 mutations in the CTNNB1 was 15%. We identified six missense heterozygous mutations in ten cases: a G to A change (Asp32Asn) in one case, a C to A change (Ser34Tyr) in four cases, a C to G change (Ser33Cys) in two cases, a G to A change (Gly34Arg) in one case and a G to T change (Gly34Glu) in one case and a C to A change (Ser37Tyr) in one case. It was observed b-catenin immunoreactivity in the nucleus in 36.4% of all cases analyzed. In the cytoplasm, the ß-catenin was present in all the cases. No correlation between histological type and IHQ qualitative and semi-quantitative. Also, there was no correlation between histological type and mutations. No difference in the expression levels of the genes CTNNB1, AXIN1 and APC were observed in medulloblastomas in relation to normal cerebellum samples by QT-PCR analysis. In the analysis of relative expression and the histological classification, only APC presented significant difference between classic and desmoplastic type. There was no difference of the relative expression levels of any gene with the patient?s age. The presence of CTNNB1 mutations did not affect the relative expression of CTNNB1 and APC. On the other hand, AXIN1 presented a higher relative expression in the cases with mutation. APC expression level was lower when b-catenin nuclear accumulation was higher. Our data indicate that other proteins of WNT pathway can be involved in b-catenin accumulation in medulloblastoma cells, as well as the involvement of other different pathways.

Meduloblastoma é um tumor embrionário maligno e invasivo do cerebelo, com manifestação preferencial em crianças, sendo predominantemente de diferenciação neuronal e tendência natural a metastatização por via liquórica. O gene da b-catenina (CTNNB1) está localizado no cromossomo 3p22-p21-3, sendo seu produto uma proteína citoplasmática de 92 kDa, envolvida na adesão celular e na transdução de sinal durante a embriogênese e morfogênese tecidual. A fosforilação da b-catenina é necessária para sua degradação, evitando a associação com o fator de transcrição Tcf (fator de célula T), responsável pela ativação de genes, cujos produtos promovem a proliferação celular. Estudos têm demonstrado a presença da b-catenina no núcleo das células de tumorais, um achado inesperado, pois, tratando-se de uma proteína envolvida na adesão celular, sua expressão seria esperada na membrana celular. Subseqüentemente foram descritas mutações no exon 3 do gene da b-catenina, envolvendo sítios de fosforilação. Este estudo teve como objetivo analisar em meduloblastomas: mutações no gene CTNNB1, o acúmulo da proteína b-catenina, bem como correlacionar ambos os achados entre si e com o tipo histológico e analisar os níveis de expressão relativa de genes envolvidos na via WNT (CTNNB1, AXIN1, WNT1 e APC) e correlaciona-los com o tipo histológico, idade e dados de mutação de CTNNB1 e acúmulo de b-catenina. As amostras de DNA foram extraídas de 67 casos de meduloblastomas. A análise de alterações no exon 3 de CTNNB1 foi realizada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e seqüenciamento direto. A expressão da b-catenina foi analisada pela técnica de imunohistoquímica (IHQ). As análises de expressão relativa de CTNNB1, AXIN1, WNT1 e APC foram realizadas pelo método de PCR quantitativo em tempo real (RQ-PCR) em 31 amostras de meduloblastomas. A freqüência de mutações do exon 3 de CTNBB1 foi de 15%. Foram identificadas 6 mutações missense e em heterozigose em 10 casos: troca de G por A (Asp32Asn) em um caso, troca de C por A (Ser34Tir) em quatro casos, troca de C por G (Ser33Cis) em dois casos, troca G por A (Gli34Arg) em um caso, troca de G por T (Gli34Glu) em um caso e troca de C por A (Ser37Tir) em um caso. Foi observada uma imunorreatividade de ß-catenina no núcleo em 36,4% dos casos analisados. No citoplasma, a ß-catenina estava presente em todos os casos. Não houve correlação entre o tipo histológico e os dados qualitativos e semi-quantitativos de IHQ. Também não houve correlação entre o tipo histológico com os achados de mutações. Não foi observada diferença nos níveis de expressão dos genes CTNNB1, AXIN1 e APC nos meduloblastomas em relação ao tecidos cerebelares não tumorais. Na análise de expressão relativa e a classificação histológica, apenas APC apresentou diferença entre o tipo clássico com o desmoplásico. Não houve diferença dos níveis de expressão relativa em nenhum dos genes com relação à idade do paciente. A presença de mutações de CTNNB1 não afetou a expressão relativa de CTNNB1 e APC. Por outro lado, AXIN1 apresentou uma maior expressão relativa nos casos com mutação. APC apresentou uma menor expressão quanto maior o acúmulo de b-catenina no núcleo. Os dados indicam que outras proteínas da via WNT podem estar envolvidas no acúmulo de b-catenina nas células de meduloblastomas, além do envolvimento de outras diferentes vias. / Medulloblastoma is a malignant invasive embryonal tumor of the cerebellum with a preferential manifestation in children, being predominantly with neuronal differentiation, and a natural tendency to metastasize through spinal fluid pathways. b-catenin gene (CTNNB1) is localized at chromosome 3p22-p21.3 and codifies a cytoplasmatic protein of 92 kDa, involved in cellular adhesion and signal transduction during embriogenesis and tissue morphogenesis. b-catenin phosphorylation is necessary for its degradation, avoiding association with Tcf (T cell factor), responsible for activation of some genes, whose products promote cellular proliferation. Studies have demonstrated the presence of b-catenin in the nucleus of tumoral cells, an unexpected finding because it is a protein involved in cellular adhesion and its normal localization is at the cellular membrane. Subsequentially, mutations in the phosphorylation sites, localized at the exon 3 of b-catenin gene, have been described. The aims of this study were to analyze in medulloblastomas: CTNNB1 gene mutations, the protein b-catenin accumulation, as well as to correlate both findings between them and with the histological type and to analyze the relative expression levels of genes involved in the WNT pathway (CTNNB1, AXIN1, WNT1 and APC). DNA samples were extracted from 67 cases of medulloblastoma. Alterations of CTNNB1 exon 3 were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) and direct sequencing. The expression of the protein b-catenin was assessed by immunohistochemistry (IHC). The relative expression analyses of CTNNB1, AXIN1, WNT1 and APC were determined by quantitative real time PCR (RQ-PCR) in 31 medulloblastoma samples. The frequency of CTNBB1 exon 3 mutations in the CTNNB1 was 15%. We identified six missense heterozygous mutations in ten cases: a G to A change (Asp32Asn) in one case, a C to A change (Ser34Tyr) in four cases, a C to G change (Ser33Cys) in two cases, a G to A change (Gly34Arg) in one case and a G to T change (Gly34Glu) in one case and a C to A change (Ser37Tyr) in one case. It was observed b-catenin immunoreactivity in the nucleus in 36.4% of all cases analyzed. In the cytoplasm, the ß-catenin was present in all the cases. No correlation between histological type and IHQ qualitative and semi-quantitative. Also, there was no correlation between histological type and mutations. No difference in the expression levels of the genes CTNNB1, AXIN1 and APC were observed in medulloblastomas in relation to normal cerebellum samples by QT-PCR analysis. In the analysis of relative expression and the histological classification, only APC presented significant difference between classic and desmoplastic type. There was no difference of the relative expression levels of any gene with the patient?s age. The presence of CTNNB1 mutations did not affect the relative expression of CTNNB1 and APC. On the other hand, AXIN1 presented a higher relative expression in the cases with mutation. APC expression level was lower when b-catenin nuclear accumulation was higher. Our data indicate that other proteins of WNT pathway can be involved in b-catenin accumulation in medulloblastoma cells, as well as the involvement of other different pathways.

A via canônica Wnt/beta-catenina regula várias funções em vertebrados, incluindo diferenciação de células T, bem como a proliferação, sobrevivência, morfogênese e migração de vários tipos celulares. As células T CD4+ é fundamental para a competência imunológica. Foi observado pelo nosso grupo que células T CD4+ humanas apresentam ativação da via Wnt/beta-catenina após tratamento com sais de lítio ou outros agonistas da via. A ativação desta via induziu a proliferação de células T CD4+ naive e de memória central. Em conjunto, estes dados sugerem um importante papel da via Wnt/beta-catenina na homeostase de células T CD4+ humanas. Seria importante avaliar o papel da via Wnt/beta-catenina nas células do sistema imune no modelo murino, já que pouco se sabe sobre seu efeito na homeostase de células T CD4+ murinas. A ativação da via Wnt/beta-catenina pode ser induzida com inibidores da proteína Glicogênio sintase quinase 3beta (GSK3beta), por exemplo, os sais de lítio (LiCl e Li2CO3) e inibidores específicos (SB, CHIR) em vários tipos celulares. Neste trabalho, avaliamos o efeito de inibidores de GSK3? na ativação da via Wnt/beta-catenina canônica em esplenócitos e células T CD4+, através da realização de experimentos in vivo e in vitro, avaliando a expressão de seus genes alvo HIG2, Bcl-xL, Ciclina D1 e c-myc. Verificou-se que o tratamento in vivo agudo (2-12 h após a administração) ou crônico (administração diária por 30 dias) de camundongos não é capaz de ativar a via Wnt/beta-catenina in vivo em células esplênicas e células T CD4+, embora o mesmo tratamento induza a expressão dos genes alvo da via no tecido cerebral (córtex e hipocampo). Além disso, também não foi possível verificar ativação da via em esplenócitos e células T CD4+ após tratamento in vitro das mesmas com LiCl ou os inibidores específicos de GSK3beta testados(CHIR99021, SB-216763), embora essa ativação tenha sido observada na linhagem celular HEK293. Nossos resultados sugerem que a via Wnt/beta-catenina (canônica) não é induzível em células T CD4+ murinas maduras, com os agonistas testados. Isso pode ter implicações fisiológicas, por exemplo sobre a homeostase de células T CD4+, já que a proliferação homeostática de células T, influenciada em humanos pela via Wnt/beta-catenina, é menos importante em camundongos / The Wnt/beta-catenin pathway regulates many functions in vertebrates, including T cell differentiation, as well as proliferation, morphogenesis and migration in different cell types. CD4+ T cells play is fundamental for immunological competence. Our group has observed that human CD4+ T cells present activation of the Wnt/beta-catenin pathway after treatment with lithium salts or other pathway agonists. The activation of this pathway induced proliferation in naive and central memory CD4+ T cells. Together, these results suggest an important role for the Wnt/beta-catenin pathway in the homeostasis of human CD4+ T cells. It would be very important to evaluate the role of the Wnt/beta-catenin pathway in T cells in the mouse model, since little is known about its effect in mice CD4+ T cell homeostasis. The activation of the Wnt/beta-catenin pathway may be induced with Glycogen Synthase Kinase 3B (GSK3beta) inhibitors, i.e., lithium salts as mentioned above, and specific GSK3beta inhibitors (SB, CHIR) in different cell types. In this work, we evaluated the effect of GSK3beta inhibitors in the activation of the canonical Wnt/beta-catenin in splenocytes and CD4+ T cells, by conducting experiments in vivo and in vitro, evaluating the expression of its target genes HIG2, Bcl-xL, Cyclin D1 and c-myc. We verified that acute (2-12 hours after administration) or chronic (daily administration for 30 days) treatment of mice with lithium salts is not able to activate the Wnt/beta-catenin pathway in splenocytes and CD4+ T cells, although we could observe activation in brain tissues (cortex and hypothalamus). Besides, no activation of the Wnt/beta-catenin pathway was observed in these cell types after in vitro treatment with LiCl or the specific inhibitors of GSK3beta (CHIR99021, SB-216763), while the pathway was activated by the same treatments in HEK293 cells. Our results suggest that the Wnt/beta-catenin pathway is not inducible in murine mature CD4+ T cells with the tested agonists. This may have physiological implications, for instance on the homeostasis of CD4+ T cells, where homeostatic proliferation - influenced the Wnt/beta-catenin pathway in human T cells - is less important in the maintenance of the murine peripheral T cell pool

Introdução: Os mecanismos moleculares que levam ao desenvolvimento de tumores do córtex suprarrenal ainda são pouco compreendidos. Uma alta frequência de carcinomas adrenocorticais na infância tem sido relatada nas regiões sul e sudeste do Brasil, com a presença de uma única mutação germinativa do supressor tumoral p53 (p.R337H) sendo evidenciada em 80- 97% dos casos. Outros fatores implicados na tumorigênese adrenocortical incluem a hiperexpressão das vias IGF2 e Wnt. Os microRNAs, fragmentos de RNA que não codificam proteínas, são capazes de controlar a transcrição gênica exercendo um papel importante no crescimento e proliferação celular. O papel dos microRNA na tumorigênese adrenal ainda não está totalmente elucidado. Objetivos: Avaliar diferenças no perfil de expressão de microRNAs entre tumores benignos e malignos do córtex da suprarrenal da população adulta e pediátrica. Comparar esta expressão entre as amostras caracterizadas pela presença da mutação germinativa p.R337H do supressor tumoral p53, hiperexpressão da via Wnt e da via do IGF2. Métodos: Trinta e seis pacientes não relacionados, adultos e crianças, foram estudados. Os pacientes tiveram avaliação do perfil de produção hormonal e das vias moleculares p53, IGF2 e Wnt. O perfil de expressão de microRNAs foi determinado utilizando-se produto comercial específico TaqMan MicroRNA Human Array (AppliedBiosystems, Forster City, CA, USA). Os dados de expressão foram analisados com o programa Expression Suite (AppliedBiosystems, Forster City, CA, USA) e Realtime Statmainer (Integromics, Granada, Espanha). O estudo de alvos e das redes gênicas afetadas foram estudados com o programa Ingenuity - IPA (Ingenuity, EUA). Resultados: A comparação do perfil de expressão entre adenomas e carcinomas revelou alteração de expressão em 89 e 21 miRNAs em adultos e crianças, respectivamente. Após a correção estatística para múltiplos testes, nove miRNAs mantiveram diferenças significantes em adultos e nenhum em crianças. Dentre os microRNAs com expressão alterada em adultos estavam o miR-483-3p (p=0,011), miR-1290 (p=0,011) e miR-106b (p=0,048). Esses microRNAs foram selecionados para avaliação como biomarcadores por meio de curva ROC. O miR-1290 apresentou o melhor resultado (AUC=1,0; IC 95% 1,0; p=0,003), com valores de expressão de miR-1290 de 10,3 sendo capazes de diferenciar adenomas de carcinomas em adultos com 100% de sensibilidade e especificidade. Na população pediátrica, não foi possível diferenciar adenomas de carcinomas com o uso de microRNAs individuais. A comparação direta entre o perfil de expressão de adenomas da população adulta e pediátrica revelou 38 miRNAs com alteração de expressão. O miR-483-3p e miR-483-5p estavam dentre os mais desregulados e foram os únicos a manter diferença estatística significativa (p=0,009 para ambos), estando hiperexpressos em crianças. A comparação direta do perfil de expressão entre carcinomas da população adulta e pediátrica revelou 26 microRNAs com alteração de expressão, porém sem significância estatística após correção para múltiplos testes. A comparação entre as amostras caracterizadas pela mutação p.R337H do supressor tumoral p53 revelou 53 genes alterados. A comparação entre as amostras caracterizadas por alteração do Wnt revelou 46 genes desregulados. Entretanto, essas alterações não mantiveram significância estatística após correção estatística para múltiplos testes. A comparação entre as amostras caracterizadas por alteração do IGF2 revelou 83 genes alterados, com miR-483-3p (p < 0,001), miR-483-5p (p < 0,001), miR-296-5p (p=0,047) e miR-1290 (p=0,011) mantendo significância estatística após correção para múltiplos testes. O estudo dos potenciais alvos e das redes genicas afetadas pelos miRNAs desregulados observados nesse estudo revelou novas e promissoras vias moleculares que podem ajudar a melhor entender a tumorigenese adrenocortical. Conclusões: Diferenças no perfil de expressão de microRNAs foram observadas entre tumores benignos e malignos do córtex da suprarrenal da população adulta e pediátrica. O ganho de expressão foi o evento mais comum. Os genes miR-483-3p, miR-1290 e miR-106b foram reconhecidos em diversas comparações entre os grupos de interesse e parecem apresentar papel importante na tumorigenese adrenocortical. Além disso, o miR-1290 demonstrou atuar como biomarcador capaz de diferenciar adenomas de carcinomas na população adulta. O estudo de redes gênicas potencialmente afetadas pelos microRNAs que apresentaram alteração de expressão nesse estudo poderá ajudar no melhor entendimento da tumorigênese adrenocortical / Introduction: The molecular mechanisms that lead to the development of tumors of the adrenal cortex are still poorly understood. A high frequency of pediatric adrenocortical carcinomas has been reported in South and Southeast of Brazil, and a single germline mutation of the tumor suppressor p53 (p.R337H) has been identified in 80-97% of cases. In addition, the overexpression of IGF2 and Wnt pathways are also involved in adrenal tumorigenesis. MicroRNAs, a class of small nonconding RNA, are able to control gene transcription regulating cellular growth and proliferation. However, the role of microRNA has not been fully elucidated in adrenal tumorigenesis. Objectives: To evaluate differences in the expression profile of microRNA between adult and pediatric adrenocortical tumors. To compare microRNA expression profile among samples with and without TP53, Wnt and IGF2 abnormalities. Methods: Thirty-six unrelated patients, adults and children, were studied. Patients had comprehensive hormonal evaluation and tumor samples were studied for TP53, Wnt and IGF2. The expression profile of microRNAs were determined using specific commercial product TaqMan MicroRNA Human Array (AppliedBiosystems, Forster City, CA, USA). The expression data were analyzed with the program Expression Suite (AppliedBiosystems, Forster City, CA, USA) and Realtime Statmainer (Integromics, Granada, Spain). The study of gene networks and affected targets genes have been studied with the Ingenuity program - IPA (Ingenuity, USA). Results: Comparing expression profile between adenomas and carcinomas revealed 89 and 21 deregulated miRNAs in adults and children, respectively. After false discovery rate correction, nine microRNA have maintained significant diferences in miRNAs between adults and none in children. Among microRNAs deregulated in adults were miR-483-3p (p = 0.011), miR-1290 (p = 0.011) and miR-106b (p = 0.048). These microRNAs were selected for evaluation as biomarkers through ROC curve. The miR- 1290 presented the best result (AUC = 1.0; IC 95% 1.0; p = 0.003), with values of expression of miR-1290 of 10.3 being able to differentiate adenomas from carcinomas with 100% sensitivity and specificity. It was not possible to differentiate adenomas from carcinomas by using microRNAs. The direct comparison between the expression profile of adult and pediatric adenomas revealed 38 degulated miRNAs. The miR-483-3p and miR-483-5p were hiperexpressed in children and were the only ones that keept a statistically significant difference (p = 0.009 for both). The direct comparison of the expression profile between adult and pediatric carcinomas revealed 26 deregulated microRNAs, but without statistical significance after correction for multiple testing. The comparison between samples characterized by the p.R337H mutation of tumor suppressor p53 revealed 53 genes deregulated. The comparison between samples characterized by alteration of Wnt reveled 46 microRNAs deregulated. However, after statistical correction for false discovery rate none of them maintained significance. The comparison between samples characterized by change in the IGF2 gene revealed 83 deregulated microRNAs, miR-483-3 p (p < 0.001), miR-483-5 p (p < 0.001), miR-296-5 p (p = 0.047) and miR-1290 (p = 0.011) maintaining statistical significance after correction for false discovery rate. The study of potential targets and molecular networks affected by the deregulatad microRNAs showed promising new molecular pathways that may help better understand the adrenocortical tumorigenese. Conclusions: There were changes in the microRNAs expression profile between malignant and benign tumors of the adrenal cortex of adult and pediatric population. Hyperexpression were the most common presentation. MiR-483-3p, miR-1290 and miR-106b were recognized in various comparisons among groups of interest and appear to have an important role in adrenocortical tumorigenese. In addition, the miR- 1290 can act as a biomarker differentiating adenomas from carcinomas in the adult population. The study of molecular networks potentially affected by the microRNAs deregulated culd contribute to better understanding of adrenocortical tumorigenesis

Introdução: Os mecanismos moleculares que levam ao desenvolvimento de tumores do córtex suprarrenal ainda são pouco compreendidos. Uma alta frequência de carcinomas adrenocorticais na infância tem sido relatada nas regiões sul e sudeste do Brasil, com a presença de uma única mutação germinativa do supressor tumoral p53 (p.R337H) sendo evidenciada em 80- 97% dos casos. Outros fatores implicados na tumorigênese adrenocortical incluem a hiperexpressão das vias IGF2 e Wnt. Os microRNAs, fragmentos de RNA que não codificam proteínas, são capazes de controlar a transcrição gênica exercendo um papel importante no crescimento e proliferação celular. O papel dos microRNA na tumorigênese adrenal ainda não está totalmente elucidado. Objetivos: Avaliar diferenças no perfil de expressão de microRNAs entre tumores benignos e malignos do córtex da suprarrenal da população adulta e pediátrica. Comparar esta expressão entre as amostras caracterizadas pela presença da mutação germinativa p.R337H do supressor tumoral p53, hiperexpressão da via Wnt e da via do IGF2. Métodos: Trinta e seis pacientes não relacionados, adultos e crianças, foram estudados. Os pacientes tiveram avaliação do perfil de produção hormonal e das vias moleculares p53, IGF2 e Wnt. O perfil de expressão de microRNAs foi determinado utilizando-se produto comercial específico TaqMan MicroRNA Human Array (AppliedBiosystems, Forster City, CA, USA). Os dados de expressão foram analisados com o programa Expression Suite (AppliedBiosystems, Forster City, CA, USA) e Realtime Statmainer (Integromics, Granada, Espanha). O estudo de alvos e das redes gênicas afetadas foram estudados com o programa Ingenuity - IPA (Ingenuity, EUA). Resultados: A comparação do perfil de expressão entre adenomas e carcinomas revelou alteração de expressão em 89 e 21 miRNAs em adultos e crianças, respectivamente. Após a correção estatística para múltiplos testes, nove miRNAs mantiveram diferenças significantes em adultos e nenhum em crianças. Dentre os microRNAs com expressão alterada em adultos estavam o miR-483-3p (p=0,011), miR-1290 (p=0,011) e miR-106b (p=0,048). Esses microRNAs foram selecionados para avaliação como biomarcadores por meio de curva ROC. O miR-1290 apresentou o melhor resultado (AUC=1,0; IC 95% 1,0; p=0,003), com valores de expressão de miR-1290 de 10,3 sendo capazes de diferenciar adenomas de carcinomas em adultos com 100% de sensibilidade e especificidade. Na população pediátrica, não foi possível diferenciar adenomas de carcinomas com o uso de microRNAs individuais. A comparação direta entre o perfil de expressão de adenomas da população adulta e pediátrica revelou 38 miRNAs com alteração de expressão. O miR-483-3p e miR-483-5p estavam dentre os mais desregulados e foram os únicos a manter diferença estatística significativa (p=0,009 para ambos), estando hiperexpressos em crianças. A comparação direta do perfil de expressão entre carcinomas da população adulta e pediátrica revelou 26 microRNAs com alteração de expressão, porém sem significância estatística após correção para múltiplos testes. A comparação entre as amostras caracterizadas pela mutação p.R337H do supressor tumoral p53 revelou 53 genes alterados. A comparação entre as amostras caracterizadas por alteração do Wnt revelou 46 genes desregulados. Entretanto, essas alterações não mantiveram significância estatística após correção estatística para múltiplos testes. A comparação entre as amostras caracterizadas por alteração do IGF2 revelou 83 genes alterados, com miR-483-3p (p < 0,001), miR-483-5p (p < 0,001), miR-296-5p (p=0,047) e miR-1290 (p=0,011) mantendo significância estatística após correção para múltiplos testes. O estudo dos potenciais alvos e das redes genicas afetadas pelos miRNAs desregulados observados nesse estudo revelou novas e promissoras vias moleculares que podem ajudar a melhor entender a tumorigenese adrenocortical. Conclusões: Diferenças no perfil de expressão de microRNAs foram observadas entre tumores benignos e malignos do córtex da suprarrenal da população adulta e pediátrica. O ganho de expressão foi o evento mais comum. Os genes miR-483-3p, miR-1290 e miR-106b foram reconhecidos em diversas comparações entre os grupos de interesse e parecem apresentar papel importante na tumorigenese adrenocortical. Além disso, o miR-1290 demonstrou atuar como biomarcador capaz de diferenciar adenomas de carcinomas na população adulta. O estudo de redes gênicas potencialmente afetadas pelos microRNAs que apresentaram alteração de expressão nesse estudo poderá ajudar no melhor entendimento da tumorigênese adrenocortical / Introduction: The molecular mechanisms that lead to the development of tumors of the adrenal cortex are still poorly understood. A high frequency of pediatric adrenocortical carcinomas has been reported in South and Southeast of Brazil, and a single germline mutation of the tumor suppressor p53 (p.R337H) has been identified in 80-97% of cases. In addition, the overexpression of IGF2 and Wnt pathways are also involved in adrenal tumorigenesis. MicroRNAs, a class of small nonconding RNA, are able to control gene transcription regulating cellular growth and proliferation. However, the role of microRNA has not been fully elucidated in adrenal tumorigenesis. Objectives: To evaluate differences in the expression profile of microRNA between adult and pediatric adrenocortical tumors. To compare microRNA expression profile among samples with and without TP53, Wnt and IGF2 abnormalities. Methods: Thirty-six unrelated patients, adults and children, were studied. Patients had comprehensive hormonal evaluation and tumor samples were studied for TP53, Wnt and IGF2. The expression profile of microRNAs were determined using specific commercial product TaqMan MicroRNA Human Array (AppliedBiosystems, Forster City, CA, USA). The expression data were analyzed with the program Expression Suite (AppliedBiosystems, Forster City, CA, USA) and Realtime Statmainer (Integromics, Granada, Spain). The study of gene networks and affected targets genes have been studied with the Ingenuity program - IPA (Ingenuity, USA). Results: Comparing expression profile between adenomas and carcinomas revealed 89 and 21 deregulated miRNAs in adults and children, respectively. After false discovery rate correction, nine microRNA have maintained significant diferences in miRNAs between adults and none in children. Among microRNAs deregulated in adults were miR-483-3p (p = 0.011), miR-1290 (p = 0.011) and miR-106b (p = 0.048). These microRNAs were selected for evaluation as biomarkers through ROC curve. The miR- 1290 presented the best result (AUC = 1.0; IC 95% 1.0; p = 0.003), with values of expression of miR-1290 of 10.3 being able to differentiate adenomas from carcinomas with 100% sensitivity and specificity. It was not possible to differentiate adenomas from carcinomas by using microRNAs. The direct comparison between the expression profile of adult and pediatric adenomas revealed 38 degulated miRNAs. The miR-483-3p and miR-483-5p were hiperexpressed in children and were the only ones that keept a statistically significant difference (p = 0.009 for both). The direct comparison of the expression profile between adult and pediatric carcinomas revealed 26 deregulated microRNAs, but without statistical significance after correction for multiple testing. The comparison between samples characterized by the p.R337H mutation of tumor suppressor p53 revealed 53 genes deregulated. The comparison between samples characterized by alteration of Wnt reveled 46 microRNAs deregulated. However, after statistical correction for false discovery rate none of them maintained significance. The comparison between samples characterized by change in the IGF2 gene revealed 83 deregulated microRNAs, miR-483-3 p (p < 0.001), miR-483-5 p (p < 0.001), miR-296-5 p (p = 0.047) and miR-1290 (p = 0.011) maintaining statistical significance after correction for false discovery rate. The study of potential targets and molecular networks affected by the deregulatad microRNAs showed promising new molecular pathways that may help better understand the adrenocortical tumorigenese. Conclusions: There were changes in the microRNAs expression profile between malignant and benign tumors of the adrenal cortex of adult and pediatric population. Hyperexpression were the most common presentation. MiR-483-3p, miR-1290 and miR-106b were recognized in various comparisons among groups of interest and appear to have an important role in adrenocortical tumorigenese. In addition, the miR- 1290 can act as a biomarker differentiating adenomas from carcinomas in the adult population. The study of molecular networks potentially affected by the microRNAs deregulated culd contribute to better understanding of adrenocortical tumorigenesis

A via canônica Wnt/beta-catenina regula várias funções em vertebrados, incluindo diferenciação de células T, bem como a proliferação, sobrevivência, morfogênese e migração de vários tipos celulares. As células T CD4+ é fundamental para a competência imunológica. Foi observado pelo nosso grupo que células T CD4+ humanas apresentam ativação da via Wnt/beta-catenina após tratamento com sais de lítio ou outros agonistas da via. A ativação desta via induziu a proliferação de células T CD4+ naive e de memória central. Em conjunto, estes dados sugerem um importante papel da via Wnt/beta-catenina na homeostase de células T CD4+ humanas. Seria importante avaliar o papel da via Wnt/beta-catenina nas células do sistema imune no modelo murino, já que pouco se sabe sobre seu efeito na homeostase de células T CD4+ murinas. A ativação da via Wnt/beta-catenina pode ser induzida com inibidores da proteína Glicogênio sintase quinase 3beta (GSK3beta), por exemplo, os sais de lítio (LiCl e Li2CO3) e inibidores específicos (SB, CHIR) em vários tipos celulares. Neste trabalho, avaliamos o efeito de inibidores de GSK3? na ativação da via Wnt/beta-catenina canônica em esplenócitos e células T CD4+, através da realização de experimentos in vivo e in vitro, avaliando a expressão de seus genes alvo HIG2, Bcl-xL, Ciclina D1 e c-myc. Verificou-se que o tratamento in vivo agudo (2-12 h após a administração) ou crônico (administração diária por 30 dias) de camundongos não é capaz de ativar a via Wnt/beta-catenina in vivo em células esplênicas e células T CD4+, embora o mesmo tratamento induza a expressão dos genes alvo da via no tecido cerebral (córtex e hipocampo). Além disso, também não foi possível verificar ativação da via em esplenócitos e células T CD4+ após tratamento in vitro das mesmas com LiCl ou os inibidores específicos de GSK3beta testados(CHIR99021, SB-216763), embora essa ativação tenha sido observada na linhagem celular HEK293. Nossos resultados sugerem que a via Wnt/beta-catenina (canônica) não é induzível em células T CD4+ murinas maduras, com os agonistas testados. Isso pode ter implicações fisiológicas, por exemplo sobre a homeostase de células T CD4+, já que a proliferação homeostática de células T, influenciada em humanos pela via Wnt/beta-catenina, é menos importante em camundongos / The Wnt/beta-catenin pathway regulates many functions in vertebrates, including T cell differentiation, as well as proliferation, morphogenesis and migration in different cell types. CD4+ T cells play is fundamental for immunological competence. Our group has observed that human CD4+ T cells present activation of the Wnt/beta-catenin pathway after treatment with lithium salts or other pathway agonists. The activation of this pathway induced proliferation in naive and central memory CD4+ T cells. Together, these results suggest an important role for the Wnt/beta-catenin pathway in the homeostasis of human CD4+ T cells. It would be very important to evaluate the role of the Wnt/beta-catenin pathway in T cells in the mouse model, since little is known about its effect in mice CD4+ T cell homeostasis. The activation of the Wnt/beta-catenin pathway may be induced with Glycogen Synthase Kinase 3B (GSK3beta) inhibitors, i.e., lithium salts as mentioned above, and specific GSK3beta inhibitors (SB, CHIR) in different cell types. In this work, we evaluated the effect of GSK3beta inhibitors in the activation of the canonical Wnt/beta-catenin in splenocytes and CD4+ T cells, by conducting experiments in vivo and in vitro, evaluating the expression of its target genes HIG2, Bcl-xL, Cyclin D1 and c-myc. We verified that acute (2-12 hours after administration) or chronic (daily administration for 30 days) treatment of mice with lithium salts is not able to activate the Wnt/beta-catenin pathway in splenocytes and CD4+ T cells, although we could observe activation in brain tissues (cortex and hypothalamus). Besides, no activation of the Wnt/beta-catenin pathway was observed in these cell types after in vitro treatment with LiCl or the specific inhibitors of GSK3beta (CHIR99021, SB-216763), while the pathway was activated by the same treatments in HEK293 cells. Our results suggest that the Wnt/beta-catenin pathway is not inducible in murine mature CD4+ T cells with the tested agonists. This may have physiological implications, for instance on the homeostasis of CD4+ T cells, where homeostatic proliferation - influenced the Wnt/beta-catenin pathway in human T cells - is less important in the maintenance of the murine peripheral T cell pool