O meduloblastoma (MB) é o tumor cerebral maligno mais comum na infância. A formação/progressão desta neoplasia foi associada a alterações moleculares, que inclui a desregulação da via de sinalização Wingless (Wnt), responsável pelo desenvolvimento embrionário. Além disso, as proteínas da família Aurora-quinases (A, B e C) têm sido amplamente estudadas, uma vez que a Aurora A e B foram encontrados hiperexpressas em diversas neoplasias, como o MB. Estudos recentes mostraram que existe uma associação entre a Via Wnt e as Aurora-quinases. No entanto, poucos trabalhos foram realizados para confirmar essa associação. Ademais, não existem trabalhos que relatem os efeitos do AMG900, um pan-inibidor de aurora-quinases, em MB, dando enfoque na regulação da via Wnt. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a modulação da via Wnt pelo inibidor AMG900 nas linhagens celulares de meduloblastoma pediátrico. Foram realizados os ensaios de PCR convencional, sequenciamento, qRT-PCR, transfecção transiente, ensaio clonogênico, Western Blot e ciclo celular. As linhagens celulares UW402, UW473 e ONS-76 não apresentaram mutações no éxon 3 do gene CTNNB1 (?-catenina) e no éxon 15 do gene APC. Não foi observada uma expressão significativa de CTNNB1, confirmando que as linhagens não possuíam a via Wnt ativa. Com isso foi necessário a transfecção transiente com a ?- catenina. Após este ensaio, houve um aumento da expressão de CTNNB1, Ciclina D1 e CMyc nas três linhagens, o que não ocorreu com as Auroras A e B. No ensaio clonogênico foi observado uma redução do número de colônias nas linhagens UW473 e ONS-76. Observou-se um aumento da expressão proteica da ?-catenina, da Aurora A e B na UW473, o que ocorreu somente com a ?-catenina na linhagem ONS-76. Após o tratamento com o AMG900 ocorreu uma diminuição da expressão proteica de ?-catenina, da Aurora A e B em ambas as linhagens. A transfecção não alterou o percentil celular em G2/M na UW402 e UW473. Já na ONS-76 houve um aumento significativo em G2/M, e o AMG900 potencializou esse bloqueio apenas nessa linhagem. Os resultados sugerem que pode haver alguma relação entre a inibição das proteínas Aurora-quinases e a expressão de proteínas da via Wnt. / Medulloblastoma (MB) is the most common malignant brain tumor in childhood. Tumor formation/progression has been associated to molecular alterations that include dysregulation of signaling pathway Wingless (Wnt), responsible for embryonic development. In addition, cell cycle proteins Aurora-kinase (A, B and C) have been widely studied since Aurora A and B were found overexpressed in many cancers such as MB. Recent studies show that there is an association between Wnt pathway and Aurora kinase proteins. However, few studies have been conducted to confirm this association. Moreover, there are no studies reporting the effects of AMG900 in MB, by focusing on the regulation of the Wnt pathway. The aim of this study is to evaluate Wnt pathway modulation by Aurora kinases inhibitor AMG900 in pediatric medulloblastoma cell lines. Conventional PCR, sequencing, qRT-PCR, transient transfection, clonogenic assay, Western Blot and cell cycle assays were performed. UW402, UW473 and ONS-76 cell lines did not present mutations in exon 3 of CTNNB1 gene and exon 15 of APC gene. There was no significant expression of CTNNB1 and their target genes in these cell lines, confirming that they did not have Wnt pathway activated. Considering this, transient transfection was necessary. After this trial, there was an increase in expression of CTNNB1 gene and its target genes Cyclin D1 and C-Myc in the three cell lines, which was not observed in Aurora kinases. Furthermore, in the clonogenic assay, a reduction in the number of colonies in UW473 and ONS-76 cell lines was observed. It was also observed an increase in ?-catenin protein, Aurora A and B in UW473 cell line, but not in ONS-76 cell line. However, after treatment there was a decrease in protein expression of ?-catenin, Aurora A and B in both cells. Transfection did not change the cellular percentile in G2 / M in UW402 and UW473. In ONS-76 there was a significant increase in G2 / M, and the treatment with AMG900 potentiated this block only in this cell line. Results suggest that there may be some relation between the inhibition of Aurora kinase protein and protein expression in Wnt pathway.

O meduloblastoma (MB) é o tumor cerebral maligno mais comum na infância. A formação/progressão desta neoplasia foi associada a alterações moleculares, que inclui a desregulação da via de sinalização Wingless (Wnt), responsável pelo desenvolvimento embrionário. Além disso, as proteínas da família Aurora-quinases (A, B e C) têm sido amplamente estudadas, uma vez que a Aurora A e B foram encontrados hiperexpressas em diversas neoplasias, como o MB. Estudos recentes mostraram que existe uma associação entre a Via Wnt e as Aurora-quinases. No entanto, poucos trabalhos foram realizados para confirmar essa associação. Ademais, não existem trabalhos que relatem os efeitos do AMG900, um pan-inibidor de aurora-quinases, em MB, dando enfoque na regulação da via Wnt. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a modulação da via Wnt pelo inibidor AMG900 nas linhagens celulares de meduloblastoma pediátrico. Foram realizados os ensaios de PCR convencional, sequenciamento, qRT-PCR, transfecção transiente, ensaio clonogênico, Western Blot e ciclo celular. As linhagens celulares UW402, UW473 e ONS-76 não apresentaram mutações no éxon 3 do gene CTNNB1 (?-catenina) e no éxon 15 do gene APC. Não foi observada uma expressão significativa de CTNNB1, confirmando que as linhagens não possuíam a via Wnt ativa. Com isso foi necessário a transfecção transiente com a ?- catenina. Após este ensaio, houve um aumento da expressão de CTNNB1, Ciclina D1 e CMyc nas três linhagens, o que não ocorreu com as Auroras A e B. No ensaio clonogênico foi observado uma redução do número de colônias nas linhagens UW473 e ONS-76. Observou-se um aumento da expressão proteica da ?-catenina, da Aurora A e B na UW473, o que ocorreu somente com a ?-catenina na linhagem ONS-76. Após o tratamento com o AMG900 ocorreu uma diminuição da expressão proteica de ?-catenina, da Aurora A e B em ambas as linhagens. A transfecção não alterou o percentil celular em G2/M na UW402 e UW473. Já na ONS-76 houve um aumento significativo em G2/M, e o AMG900 potencializou esse bloqueio apenas nessa linhagem. Os resultados sugerem que pode haver alguma relação entre a inibição das proteínas Aurora-quinases e a expressão de proteínas da via Wnt. / Medulloblastoma (MB) is the most common malignant brain tumor in childhood. Tumor formation/progression has been associated to molecular alterations that include dysregulation of signaling pathway Wingless (Wnt), responsible for embryonic development. In addition, cell cycle proteins Aurora-kinase (A, B and C) have been widely studied since Aurora A and B were found overexpressed in many cancers such as MB. Recent studies show that there is an association between Wnt pathway and Aurora kinase proteins. However, few studies have been conducted to confirm this association. Moreover, there are no studies reporting the effects of AMG900 in MB, by focusing on the regulation of the Wnt pathway. The aim of this study is to evaluate Wnt pathway modulation by Aurora kinases inhibitor AMG900 in pediatric medulloblastoma cell lines. Conventional PCR, sequencing, qRT-PCR, transient transfection, clonogenic assay, Western Blot and cell cycle assays were performed. UW402, UW473 and ONS-76 cell lines did not present mutations in exon 3 of CTNNB1 gene and exon 15 of APC gene. There was no significant expression of CTNNB1 and their target genes in these cell lines, confirming that they did not have Wnt pathway activated. Considering this, transient transfection was necessary. After this trial, there was an increase in expression of CTNNB1 gene and its target genes Cyclin D1 and C-Myc in the three cell lines, which was not observed in Aurora kinases. Furthermore, in the clonogenic assay, a reduction in the number of colonies in UW473 and ONS-76 cell lines was observed. It was also observed an increase in ?-catenin protein, Aurora A and B in UW473 cell line, but not in ONS-76 cell line. However, after treatment there was a decrease in protein expression of ?-catenin, Aurora A and B in both cells. Transfection did not change the cellular percentile in G2 / M in UW402 and UW473. In ONS-76 there was a significant increase in G2 / M, and the treatment with AMG900 potentiated this block only in this cell line. Results suggest that there may be some relation between the inhibition of Aurora kinase protein and protein expression in Wnt pathway.

Orientador: Lúcia Elvira Alvares / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T17:37:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pedrosa_AngelicaVasconcelos_M.pdf: 1992620 bytes, checksum: ed7d02568860e3ccf1e489cf2928818e (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A correta padronização do corpo do embrião requer a atividade de diferentes vias de sinalização. Dentre elas, uma que se destaca é via de sinalização Wnt de polaridade celular planar (Wnt/PCP), que é responsável pelo controle da polaridade celular e pela organização celular de diversos tecidos nos animais. Uma vez interrompida, a via Wnt/PCP pode causar falhas no fechamento do tubo neural, provocando defeitos congênitos. Em seres humanos, mutações em componentes-chave da via Wnt/PCP como as proteínas codificadas pelos genes Vangl1 e Vangl2 têm sido associadas à graves malformações geradas por falhas no fechamento do tubo neural. Estruturalmente, ambos os genes Vangl1 e Vangl2 codificam proteínas de superfície transmembranares, essenciais para o desenvolvimento apropriado do embrião. O presente trabalho teve como objetivo a caracterização do padrão de expressão dos genes Vangl1 e Vangl2 durante a embriogênese de Gallus gallus. Ensaios de hibridação in situ em embrião inteiro (whole mount) e cortes em vibratómo foram realizados com a finalidade de estabelecer temporal e espacialmente o padrão de expressão dos genes Vangl1 e Vangl2. Como resultado, observou-se que estes genes são expressos durante as etapas de gastrulação, neurulação e no início da organogênese do desenvolvimento embrionário de Gallus gallus. No início da gastrulação, os genes Vangl1 e Vangl2 possuem domínios de expressão comuns nos embriões de galinha, uma vez que ambos são expressos na linha primitiva, nódulo de Hensen e crescente cardiogênico. Contudo, nossos dados revelaram particularidades na expressão destes genes, uma vez que há uma predominância dos transcritos de Vangl1 na região posterior da linha primitiva, enquanto Vangl2 apresenta uma expressão uniforme ao longo desta estrutura. Em adição, enquanto Vangl1 é expresso na notocorda e em toda a extensão do nódulo de Hensen, Vangl2 é expresso no entorno desta estrutura. Ao longo da neurulação e na organogênese inicial, ambos os genes Vangl são expressos de maneira similar, em domínios que abrangem a placa, as pregas e o tubo neural. Outros importantes domínios de expressão dos Vangl correspondem às vesículas ópticas e óticas, às vesículas encefálicas particularmente na região das flexuras encefálicas, aos diferentes tipos de mesoderma (paraxial, intermediário e lateral) e ao assoalho da faringe. Ao comparar os resultados obtidos por hibridação in situ em galinha ao um levantamento bibliográfico sobre outros vertebrados, observou-se uma sobreposição dos domínios-chave de expressão nos diferentes organismos, demonstrando a conservação filogenética da atividade destes genes e sugerindo uma possível conservação funcional. Desta forma, nossos dados sugerem que os genes Vangl desempenham um importante papel no desenvolvimento embrionário de aves, possivelmente coordenando os movimentos morfogenéticos durante a gastrulação, bem como a formação da placa neural e posterior dobramento e fechamento do tubo neural, além de outros processos da embriogênese de aves / Abstract: The correct patterning of the embryo's body requires the activity of different signaling pathways. Among them, one that stands out is the Wnt Planar Cell Polarity Signaling Pathway (Wnt/PCP), which is responsible for controlling the cell polarity and cellular organization of many tissues in animals. Failures in the Wnt/PCP signaling can cause neural tube birth defects. In humans, mutations in key components of the Wnt/PCP as the Vangl1 and Vangl2 molecules were identified in patients with neural tube defects. Structurally, both Vangl1 and Vangl2 genes encode transmembrane surface proteins similar, which are essential to proper development. The present study aimed to characterize the expression pattern of Vangl1 and Vangl2 genes during embryogenesis in Gallus gallus. Whole-mount in situ hybridization assays and vibratome sectioning of embryos were conducted in order to establish the spatial and temporal expression pattern of Vangl1 and Vangl2 genes. Our results showed that these genes are expressed during gastrulation, neurulation and early organogenesis in Gallus gallus. At the onset of Gastrulation, Vangl1 and Vangl2 genes have common areas of expression in chicken embryos, since both are expressed in the primitive streak, Hensen's node and cardiogenic crescent. However, our data showed particularities in the expression of these genes, since there is a predominance of Vangl1 transcripts in the posterior region of the primitive streak while Vangl2 has a uniform expression throughout that structure. In addition, while Vangl1 is expressed in the notochord and in the full length of the Hensen's node, Vangl2 is expressed only around this structure. Throughout neurulation and early organogenesis, both Vangl genes are expressed in a similar manner on the neural plate, neural groove, neural folds and in the neural tube. Other important areas of Vangl expression correspond to optical and otic vesicles, the brain vesicles, the different types of mesoderm (paraxial, intermediate and lateral) and the floor of the pharynx. By comparing the chicken expression of Vangl genes with other vertebrates, we notice that there are overlapping expression patterns among key areas among different organisms, showing a phylogenetic conservation of expression domains and suggesting a possible functional conservation. Overall, our data suggests that Vangl genes play an important role in embryonic development of bird, possibly by coordinating the morphogenetic movements during gastrulation, as well as the formation of neural tube, among other processes during the birds embriogenesis / Mestrado / Biologia Celular / Mestra em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Lúcia Elvira Alvares, José Xavier Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T10:52:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sobreira_DeboraRodrigues_D.pdf: 9430834 bytes, checksum: 1c730ee238256c4ea0f303311fa3283b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os genes da família Dapper (Dpr) codificam proteínas adaptadoras capazes de ligar-se fisicamente a diferentes moléculas e modular as vias de sinalização Wnt e TGF-?. Diferentes análises funcionais revelaram que os Dpr atuam na especificação do eixo corporal e do tecido neural, nos movimentos morfogenéticos, no desenvolvimento do olho, na indução da cardiogênese, adipogênse e cicatrização. Diversos estudos foram realizados a fim de compreender o papel desempenhado pelos Dpr durante a embriogenêse dos vertebrados e na homeostase de tecidos adultos. Contudo, muitas questões ainda necessitam ser elucidadas. Este projeto de Doutorado teve como objetivo (1) descrever os sítios de expressão da família gênica Dpr durante a ontogênese dos membros de galinha, associando-a as vias de sinalização Wnt e TGF-? e (2) investigar a origem e a evolução desses genes durante a filogenia dos metazoários. Nossos resultados confirmaram que os genes Dpr são dinamicamente expressos durante o desenvolvimento dos membros de galinha, provavelmente, modulando os sinais Wnt e TGF-?. Os genes Dpr são encontrados no mesênquima indiferenciado dos membros em formação e em células progenitoras de condrócitos, pericôndrio e tendões. Esses resultados sugerem as moléculas Dpr como um novo grupo de marcadores do desenvolvimento dos membros em galinha. Já nossas análises filogenéticas revelaram que os Dprs surgiram durante a evolução dos organismos deuterostômios e um novo ortólogo dessa família de proteínas, denominado Dpr4, foi descrito. Acreditamos que o nosso trabalho irá fornecer bases para estudos moleculares com o intuito de estabelecer a função individual de cada membro da família Dpr, bem como auxiliar no entendimento sobre como estas proteínas podem interagir e cooperar entre si para modular diferentes vias de sinalização molecular em diferentes contextos celulares / Abstract: The Dapper (Dpr) genes form a small gene family of adaptor proteins important to several processes of vertebrates development, such as the specification of the body axis and neural tissue, morphogenetic movements, eye development, induction of cardiogenesis, adipogenesis and wound healing, by modulating the Wnt and TGF-? signaling pathways using specific conserved domains/motifs. Three Dpr genes have been identified in human and mouse, two in chicken, one in frog and two in zebrafish genome. Since the discovery of Dpr proteins, several assays have been performed in order to understand the role of this family during embryogenesis, although many questions still need to be elucidated. Thus, this PhD project aimed to (1) describe the possible role of Dpr genes during ontogeny of chicken regarding the regulation of Wnt and TGF-? signaling pathways and (2) investigate the origin and evolution of Dpr family over the course of metazoan evolution. Our results demonstrated that Dpr genes are involved in chicken limb development, probably, by modulating Wnt and TGF-? signals. Dpr genes were found in the undifferentiated limb mesenchyme, progenitor of chondrocytes, perichondrium and tendons. These results suggest that Dpr genes are good candidates to a new set of markers in chicken limb development. Furthermore, our phylogenetic analysis revealed that the Dprs arose late during the deuterostomes evolution and allowed the identification of a new Dpr paralog (Dpr4), meaning that a repertoire of four Dact genes is found in vertebrates. Thus, our work will provide the basis for molecular studies in order to establish the role of each individual member of this family as well as how the set of Dpr proteins can interact and cooperate to modulate different molecular signaling pathways in different cellular contexts / Doutorado / Biologia Tecidual / Doutora em Biologia Celular e Estrutural

Introdução: Baixas concentrações séricas de esclerostina foram descritas em pacientes com Espondilite Anquilosante (EA). No entanto, não existem dados sobre a importância deste inibidor da via de sinalização Wnt em pacientes com EA durante o tratamento com anti fator de necrose tumoral alfa (TNFa). Objetivos: Avaliar longitudinalmente os níveis séricos de esclerostina e sua associação com inflamação e densidade mineral óssea (DMO) em pacientes com EA em tratamento com anti-TNFa. Métodos: Trinta pacientes com EA em atividade foram avaliados no início, 6 e 12 meses, após terapia anti-TNFa em relação aos parâmetros clínicos (BASDAI, BASFI, BASMI e ASQoL), marcadores inflamatórios e dano radiológico basal (mSASSS). Trinta indivíduos saudáveis pareados por idade e sexo constituíram o grupo controle. As análises laboratoriais de esclerostina e da ligação de esclerostina ao receptor LRP6 e a DMO foram realizadas nos pacientes nos mesmos períodos de avaliação e comparadas aos controles. Resultados: Na avaliação inicial, pacientes com EA apresentavam menores concentrações séricas de esclerostina [60,5 (32,7) vs. 96,7 (52,9) pmol/l,P=0,002] e níveis similares de ligação de esclerostina ao receptor LRP6 (P=0,387) em relação aos controles. Foi observado melhora do BASDAI, BASFI, BASMI, ASQoL comparando tempo basal vs. 6 vs. 12 meses (P<0,01). Concomitantemente, observou-se um aumento gradual da DMO da coluna lombar (P<0,001) e no início do estudo os pacientes apresentavam uma correlação positiva entre avaliação radiológica basal (mSASSS) e a DMO da coluna lombar (r=0,468, P<0,01). Foi observada também uma redução dos marcadores inflamatórios comparando tempo basal vs. 6 vs. 12 meses (P<0,01). Os níveis de esclerostina aumentaram progressivamente após o tratamento com anti-TNFa [60,5 (32,7) vs. 67,1 (31,9) vs. 72,7 (32,3) pmol/l, P<0,001]. Entretanto, após 12 meses de terapia anti-TNFa as concentrações séricas de esclerostina permaneceram significativamente mais baixos em relação os controles [72,7 (32,3) vs. 96,7 (52,9) pmol/l, P=0,038]. Além disso, aos 12 meses, os níveis séricos de esclerostina ficaram mais baixos nos 10 pacientes que ainda apresentavam proteína C reativa elevada (PCR=5mg/l), comparados aos pacientes que apresentaram normalização dos níveis de PCR (P=0,004). Interessantemente, estes 10 pacientes com inflamação persistente já apresentavam concentrações séricas mais baixas de esclerostina quando comparados aos demais pacientes (P=0,023) antes do tratamento com anti- TNFa. A análise de regressão logística demonstrou que os pacientes com EA com níveis baixos de esclerostina apresentam um risco aumentado de apresentar PCR alta após 12 meses de tratamento (odds ratio = 7,43, 95% IC 1,23-45,01, P=0,020) quando comparados aos pacientes com níveis altos de esclerostina no tempo basal. Conclusão: Concentrações persistentemente baixas de esclerostina estão associados a inflamação contínua em pacientes com EA tratados com terapia anti-TNFa. / Introduction: Sclerostin levels have been reported to be low in ankylosing spondylitis (AS), but there is no data regarding the possible role of this Wnt inhibitor during anti tumor necrosis factor alpha (TNFa) therapy. Objectives: The present study longitudinally evaluated sclerostin levels, inflammatory markers and bone mineral density (BMD) in AS patients under anti-TNFa therapy. Methods: Thirty active AS patients were assessed at baseline, 6 and 12 months after anti-TNFa therapy regarding clinical parameters (BASDAI, BASFI, BASMI and ASQoL), inflammatory markers, BMD and baseline radiographic damage (mSASSS). Thirty age- and sex-matched healthy individuals comprised the control group. Patients\' sclerostin levels, sclerostin binding LRP6 and BMD were evaluated at the same time points and compared to controls. Results: At baseline, AS patients had lower sclerostin levels [60.5 (32.7) vs. 96.7 (52.9) pmol/l, P=0.002] and comparable sclerostin binding to LRP6 (P=0.387) than controls. Improvement of BASDAI, BASFI, BASMI, ASQoL was observed at baseline vs. 6 vs. 12 months (P<0.01). Concomitantly, a gradual increase in spine BMD (P<0.001) and a positive correlation between baseline mSASSS and spine BMD was found (r=0.468, P<0.01). Inflammatory parameters reduction was observed comparing baseline vs. 6 vs. 12 months (P<0.01). Sclerostin levels progressively increased [60.5 (32.7) vs. 67.1 (31.9) vs. 72.7 (32.3) pmol/l, P<0.001] after anti-TNFa treatment. At 12 months, the sclerostin levels remained significantly lower in patients compared to controls [72.7 (32.3) vs. 96.70 (52.85) pmol/l, P=0.038]. Moreover, sclerostin serum levels at 12 months were lower in the 10 patients with high CRP (=5mg/l) compared to the other 20 patients with normal CRP (P=0.004). Of note, these 10 patients with persistent inflammation also had lower sclerostin serum levels at baseline compared to the other patients (P=0.023). Univariate logistic regression analysis demonstrated that AS patients with lower sclerostin serum levels had an increased risk to have high CRP at 12 months (odds ratio=7.43, 95% CI 1.23-45.01, P=0.020) than those with higher sclerostin values. Conclusion: Persistent low sclerostin levels may underlie continuous inflammation in AS patients under anti-TNFa therapy.

Introdução: Baixas concentrações séricas de esclerostina foram descritas em pacientes com Espondilite Anquilosante (EA). No entanto, não existem dados sobre a importância deste inibidor da via de sinalização Wnt em pacientes com EA durante o tratamento com anti fator de necrose tumoral alfa (TNFa). Objetivos: Avaliar longitudinalmente os níveis séricos de esclerostina e sua associação com inflamação e densidade mineral óssea (DMO) em pacientes com EA em tratamento com anti-TNFa. Métodos: Trinta pacientes com EA em atividade foram avaliados no início, 6 e 12 meses, após terapia anti-TNFa em relação aos parâmetros clínicos (BASDAI, BASFI, BASMI e ASQoL), marcadores inflamatórios e dano radiológico basal (mSASSS). Trinta indivíduos saudáveis pareados por idade e sexo constituíram o grupo controle. As análises laboratoriais de esclerostina e da ligação de esclerostina ao receptor LRP6 e a DMO foram realizadas nos pacientes nos mesmos períodos de avaliação e comparadas aos controles. Resultados: Na avaliação inicial, pacientes com EA apresentavam menores concentrações séricas de esclerostina [60,5 (32,7) vs. 96,7 (52,9) pmol/l,P=0,002] e níveis similares de ligação de esclerostina ao receptor LRP6 (P=0,387) em relação aos controles. Foi observado melhora do BASDAI, BASFI, BASMI, ASQoL comparando tempo basal vs. 6 vs. 12 meses (P<0,01). Concomitantemente, observou-se um aumento gradual da DMO da coluna lombar (P<0,001) e no início do estudo os pacientes apresentavam uma correlação positiva entre avaliação radiológica basal (mSASSS) e a DMO da coluna lombar (r=0,468, P<0,01). Foi observada também uma redução dos marcadores inflamatórios comparando tempo basal vs. 6 vs. 12 meses (P<0,01). Os níveis de esclerostina aumentaram progressivamente após o tratamento com anti-TNFa [60,5 (32,7) vs. 67,1 (31,9) vs. 72,7 (32,3) pmol/l, P<0,001]. Entretanto, após 12 meses de terapia anti-TNFa as concentrações séricas de esclerostina permaneceram significativamente mais baixos em relação os controles [72,7 (32,3) vs. 96,7 (52,9) pmol/l, P=0,038]. Além disso, aos 12 meses, os níveis séricos de esclerostina ficaram mais baixos nos 10 pacientes que ainda apresentavam proteína C reativa elevada (PCR=5mg/l), comparados aos pacientes que apresentaram normalização dos níveis de PCR (P=0,004). Interessantemente, estes 10 pacientes com inflamação persistente já apresentavam concentrações séricas mais baixas de esclerostina quando comparados aos demais pacientes (P=0,023) antes do tratamento com anti- TNFa. A análise de regressão logística demonstrou que os pacientes com EA com níveis baixos de esclerostina apresentam um risco aumentado de apresentar PCR alta após 12 meses de tratamento (odds ratio = 7,43, 95% IC 1,23-45,01, P=0,020) quando comparados aos pacientes com níveis altos de esclerostina no tempo basal. Conclusão: Concentrações persistentemente baixas de esclerostina estão associados a inflamação contínua em pacientes com EA tratados com terapia anti-TNFa. / Introduction: Sclerostin levels have been reported to be low in ankylosing spondylitis (AS), but there is no data regarding the possible role of this Wnt inhibitor during anti tumor necrosis factor alpha (TNFa) therapy. Objectives: The present study longitudinally evaluated sclerostin levels, inflammatory markers and bone mineral density (BMD) in AS patients under anti-TNFa therapy. Methods: Thirty active AS patients were assessed at baseline, 6 and 12 months after anti-TNFa therapy regarding clinical parameters (BASDAI, BASFI, BASMI and ASQoL), inflammatory markers, BMD and baseline radiographic damage (mSASSS). Thirty age- and sex-matched healthy individuals comprised the control group. Patients\' sclerostin levels, sclerostin binding LRP6 and BMD were evaluated at the same time points and compared to controls. Results: At baseline, AS patients had lower sclerostin levels [60.5 (32.7) vs. 96.7 (52.9) pmol/l, P=0.002] and comparable sclerostin binding to LRP6 (P=0.387) than controls. Improvement of BASDAI, BASFI, BASMI, ASQoL was observed at baseline vs. 6 vs. 12 months (P<0.01). Concomitantly, a gradual increase in spine BMD (P<0.001) and a positive correlation between baseline mSASSS and spine BMD was found (r=0.468, P<0.01). Inflammatory parameters reduction was observed comparing baseline vs. 6 vs. 12 months (P<0.01). Sclerostin levels progressively increased [60.5 (32.7) vs. 67.1 (31.9) vs. 72.7 (32.3) pmol/l, P<0.001] after anti-TNFa treatment. At 12 months, the sclerostin levels remained significantly lower in patients compared to controls [72.7 (32.3) vs. 96.70 (52.85) pmol/l, P=0.038]. Moreover, sclerostin serum levels at 12 months were lower in the 10 patients with high CRP (=5mg/l) compared to the other 20 patients with normal CRP (P=0.004). Of note, these 10 patients with persistent inflammation also had lower sclerostin serum levels at baseline compared to the other patients (P=0.023). Univariate logistic regression analysis demonstrated that AS patients with lower sclerostin serum levels had an increased risk to have high CRP at 12 months (odds ratio=7.43, 95% CI 1.23-45.01, P=0.020) than those with higher sclerostin values. Conclusion: Persistent low sclerostin levels may underlie continuous inflammation in AS patients under anti-TNFa therapy.

O câncer de mama é a neoplasia responsável pelo maior número de mortes em mulheres no Brasil, portanto, é importante encontrar novos marcadores específicos e de diagnóstico precoce, utilizando procedimentos simples e rápidos. A via de sinalização Wnt regula importantes funções celulares como proliferação, sobrevida e adesão. Esta via está associada com os processos de iniciação e progressão em muitos tipos tumorais, como câncer de cólon familiar, melanoma e pulmão; sendo que mutações em &beta;-Catenina (CTNNb1) explicam só 30% dos casos de sinalização aberrante encontrada no câncer de mama, indicando que existem outros componentes e/ou reguladores da via que possam estar envolvidos. O objetivo deste trabalho foi avaliar as variantes genéticas e epigenéticas nos genes do complexo de degradação de &beta;-Catenina num grupo de pacientes com câncer de mama e num grupo controle; e determinar os perfis de transcrição dos componentes da via de sinalização Wnt e da molécula de expressão exclusiva do epitélio mamário, a Mamaglobina Humana (MGA), assim como associar estes resultados com as características clínicas, histológicas e patológicas do tumor. Para atingir este objetivo foram coletadas amostras de sangue periférico de 102 mulheres com câncer de mama e 102 mulheres sadias como grupo controle. A avaliação das variantes rs465899 do gene APC, rs2240308 e rs151279728 do gene AXIN2, rs5030625 do gene CDH1 e rs334558 do gene GSK3, foi realizada por meio de PCR-RFLPs e sequenciamento, a análise dos perfis de metilação dos promotores pela MS-PCR. A RT-qPCR foi usada para determinar os níveis de expressão dos componentes da via e a MGA. As variantes rs2240308 e rs151279728 do gene AXIN2 mostraram uma forte associação com o risco de desenvolver o câncer de mama. Um aumento significativo foi observado no nível de expressão de AXIN2 no grupo de mulheres com câncer de mama. Análises adicionais mostraram perfis de expressão diferencial dos genes APC, AXIN2, CTNNB1, GSK3 e CSNK1A1 associado ao status dos receptores hormonais e histogênese tumoral. MGA foi identificado exclusivamente em 38% dos pacientes com câncer de mama e foi associada com a progressão da doença. Este é o primeiro estudo que relaciona uma variante do gene AXIN2 com o câncer de mama na população brasileira. As variantes avaliadas do gene AXIN2 são marcadores promissores de susceptibilidade ao câncer de mama na população estudada, sendo importante, a avaliação desta variante genética na população e determinar o seu real efeito no processo de iniciação e/ou progressão do câncer de mama. / Background: Wnt/&beta;-catenin signaling pathway is an important regulator of cellular functions such as proliferation, survival and cell adhesion. This pathway is associated with tumor initiation and progression; -catenin (CTNNB1) mutations explains only 30% of aberrant signaling found in breast cancer, indicating that other components and/or regulating of the Wnt/&beta;-catenin pathway may be involved. Objective: The objective of the study was to evaluate the APC rs465899, AXIN2 rs2240308 and rs151279728, CDH1 rs5030625 and GSK3 rs334558 polymorphisms, APC, AXIN2, CDH1 and GSK3 promoter methylation status and expression profile of -Catenin destruction complex genes and MGA in peripheral blood of breast cancer patients. Methods: We collected peripheral blood samples from 102 breast cancer and 102 healthy subjects. The identification of the mutation was performed using PCR-RFLPs and DNA sequencing. MSP and HRM-MS was used to measure promoter methylation and RT-qPCR to determine expression profile. Results: We found significant association of AXIN2 rs2240308 polymorphism with breast cancer. Increased risk was observed even after stratification based on clinicpathological characteristics. AXIN2 rs151279728 polymorphism was found only in 9 breast cancer patients, but none in control group subject. APC and CDH1 polymorphisms were not associated with breast cancer. GSK3 polymorphism was weak associated with breast cancer and heterozygous status was associated with breast cancer protection after group stratification. APC and CDH1 promoter methylation in breast cancer patients was found. Significant increase was observed in AXIN2, CTNNB1 and GSK3 level expression in breast cancer patients. APC was down-regulated in breast cancer patients. Further analyses, showed APC, AXIN2, CTNNB1, GSK3 and CSKN1A1 gene expression associated to receptor status and histological type. MGA was found only in breast cancer patients and was associated with cancer progression. Conclusion: The present study reports, for the first time, that AXIN2 genetic defect and -catenin destruction complex expression disturbance may be found in breast cancer patients, providing additional support to the role of Wnt/-catenin pathway dysfunction in breast cancer tumorigenesis. However, the functional consequence of this genetic alteration remains to be determined. In another hand MGA was determined like a good biomarker for diagnosis and prognosis outcome.

A via canônica Wnt/beta-catenina regula várias funções em vertebrados, incluindo diferenciação de células T, bem como a proliferação, sobrevivência, morfogênese e migração de vários tipos celulares. As células T CD4+ é fundamental para a competência imunológica. Foi observado pelo nosso grupo que células T CD4+ humanas apresentam ativação da via Wnt/beta-catenina após tratamento com sais de lítio ou outros agonistas da via. A ativação desta via induziu a proliferação de células T CD4+ naive e de memória central. Em conjunto, estes dados sugerem um importante papel da via Wnt/beta-catenina na homeostase de células T CD4+ humanas. Seria importante avaliar o papel da via Wnt/beta-catenina nas células do sistema imune no modelo murino, já que pouco se sabe sobre seu efeito na homeostase de células T CD4+ murinas. A ativação da via Wnt/beta-catenina pode ser induzida com inibidores da proteína Glicogênio sintase quinase 3beta (GSK3beta), por exemplo, os sais de lítio (LiCl e Li2CO3) e inibidores específicos (SB, CHIR) em vários tipos celulares. Neste trabalho, avaliamos o efeito de inibidores de GSK3? na ativação da via Wnt/beta-catenina canônica em esplenócitos e células T CD4+, através da realização de experimentos in vivo e in vitro, avaliando a expressão de seus genes alvo HIG2, Bcl-xL, Ciclina D1 e c-myc. Verificou-se que o tratamento in vivo agudo (2-12 h após a administração) ou crônico (administração diária por 30 dias) de camundongos não é capaz de ativar a via Wnt/beta-catenina in vivo em células esplênicas e células T CD4+, embora o mesmo tratamento induza a expressão dos genes alvo da via no tecido cerebral (córtex e hipocampo). Além disso, também não foi possível verificar ativação da via em esplenócitos e células T CD4+ após tratamento in vitro das mesmas com LiCl ou os inibidores específicos de GSK3beta testados(CHIR99021, SB-216763), embora essa ativação tenha sido observada na linhagem celular HEK293. Nossos resultados sugerem que a via Wnt/beta-catenina (canônica) não é induzível em células T CD4+ murinas maduras, com os agonistas testados. Isso pode ter implicações fisiológicas, por exemplo sobre a homeostase de células T CD4+, já que a proliferação homeostática de células T, influenciada em humanos pela via Wnt/beta-catenina, é menos importante em camundongos / The Wnt/beta-catenin pathway regulates many functions in vertebrates, including T cell differentiation, as well as proliferation, morphogenesis and migration in different cell types. CD4+ T cells play is fundamental for immunological competence. Our group has observed that human CD4+ T cells present activation of the Wnt/beta-catenin pathway after treatment with lithium salts or other pathway agonists. The activation of this pathway induced proliferation in naive and central memory CD4+ T cells. Together, these results suggest an important role for the Wnt/beta-catenin pathway in the homeostasis of human CD4+ T cells. It would be very important to evaluate the role of the Wnt/beta-catenin pathway in T cells in the mouse model, since little is known about its effect in mice CD4+ T cell homeostasis. The activation of the Wnt/beta-catenin pathway may be induced with Glycogen Synthase Kinase 3B (GSK3beta) inhibitors, i.e., lithium salts as mentioned above, and specific GSK3beta inhibitors (SB, CHIR) in different cell types. In this work, we evaluated the effect of GSK3beta inhibitors in the activation of the canonical Wnt/beta-catenin in splenocytes and CD4+ T cells, by conducting experiments in vivo and in vitro, evaluating the expression of its target genes HIG2, Bcl-xL, Cyclin D1 and c-myc. We verified that acute (2-12 hours after administration) or chronic (daily administration for 30 days) treatment of mice with lithium salts is not able to activate the Wnt/beta-catenin pathway in splenocytes and CD4+ T cells, although we could observe activation in brain tissues (cortex and hypothalamus). Besides, no activation of the Wnt/beta-catenin pathway was observed in these cell types after in vitro treatment with LiCl or the specific inhibitors of GSK3beta (CHIR99021, SB-216763), while the pathway was activated by the same treatments in HEK293 cells. Our results suggest that the Wnt/beta-catenin pathway is not inducible in murine mature CD4+ T cells with the tested agonists. This may have physiological implications, for instance on the homeostasis of CD4+ T cells, where homeostatic proliferation - influenced the Wnt/beta-catenin pathway in human T cells - is less important in the maintenance of the murine peripheral T cell pool

O PAWR (Prostate apoptosis response- 4) também conhecido como PAR-4 é um gene pró-apoptótico identificado em células de câncer de próstata quando expostas a estímulos apoptóticos. A expressão de PAR-4 pode aumentar a sensibilidade da célula a apoptose, incluindo células de câncer de mama. Ensaios de expressão gênica por transcriptoma foram realizados em nosso laboratório (dados ainda não publicados), com o objetivo de analisar genes diferencialmente expressos associados à quimiossensibilidade ao docetaxel em células MCF-7 transfectadas com o vetor de expressão para PAR-4 (MCF7pcPAR4) e o com vetor vazio (MCF7pcNEO) antes e após o tratamento com docetaxel. Para avaliar a interação entre os genes diferencialmente expressos foram geradas redes gênicas funcionais utilizando o programa IPA- Ingenuity®. Dentre as diversas redes gênicas geradas destacaram-se as que continham genes relacionados direta ou indiretamente com a via de sinalização WNT (Wingless-Type MMTV Integration 1). O presente estudo visa validar genes diferencialmente expressos identificados em células MCF-7 com diferenças de expressão de PAR-4 antes e após a exposição de docetaxel. Através da anotação manual dos genes mais diferencialmente expressos, foram selecionados os genes EGR1, XAF1, TARP e WNT5A para validação por PCR em Tempo Real (qRT-PCR). A plataforma Human WNT Signaling Pathway RT2 Profiler(TM) PCR Array (PCR Array) foi utilizada para avaliar o efeito da overexpressão de PAR-4 e do tratamento de docetaxel na expressão de genes das vias canônica e não canônica do WNT. A expressão positiva do gene WNT5A nas células MCF7pcPAR4 em relação a MCF7pcNEO foi confirmada por qRT-PCR na ausença e presença do tratamento com docetaxel. O gene EGR1 apresentou regulação positiva significativa na técnica de qRT-PCR na ausência de tratamento, porém não apresenta o mesmo perfil de expressão observado no ensaio de transcriptoma. O gene XAF1 apresentou regulação negativa nas células MCF7pcPAR4 quando comparadas com as células MCF7pcNEO na ausência e presença de docetaxel, com tendência a validação na ausência de tratamento e de não validação na presença de docetaxel. Foi observado o aumento significativo da expressão de TARP nas células MCF7pcPAR4 por qRT-PCR na ausência e presença de docetaxel, porém esses achados não confirmam os resultados obtidos no transcriptoma. Em nossos dados de PCR Array na comparação MCF7pcPAR4 vs MCF7pcNEO antes do tratamento, encontramos diferença de expressão significativa (p < 0,005) em 9 genes. Sendo que, os genes CDKN2A, EGR1, FGF7, IL6 e TWIST apresentaram expressão positiva e os genes NTRK2, SOX2, SOX9 e WISP1 tiveram expressão negativa. Na comparação na presença de docetaxel observamos que os genes CACNAD2A3, GDF5, IL6, FGF7, LEF1 e TWIST apresentaram regulação positiva e FST apresentou regulação negativa com significância estatística (p < 0,005). Dos 84 genes da plataforma PCR array foram observados 21 e 14 genes comuns entre ambas às técnicas na ausência e presença de docetaxel, respectivamente. Na ausência de docetaxel 16 genes apresentaram o mesmo perfil de expressão, dentre estes a regulação positiva de GJA1, IGF1, IGF2, LEF1, MMP2, PDGFRA, PTGS2 e TWIST, associadas á regulação negativa de CDH1, JAG1, NTRK2 sugerem ativação da via WNT/?-catenina. Enquanto, a expressão de DAB2, WNT5A, FZD7 e RUNX2 indica inativação dessa via. Na presença do tratamento 6 genes apresentaram o mesmo perfil de expressão. Dentre estes, a regulação positiva de CTGF, DAB2 e EGR1 sugerem inativação da via WNT/beta-catenina. Por outro lado, a expressão positiva de FGF20, LEF1 e PDGFRA sugerem que via WNT/beta-catenina estaria ativa. Neste estudo, podemos mostrar que PAR-4 modula genes da via de sinalização WNT. Porém, mais experimentos serão necessários para verificar quais mecanismos estão envolvidos e de que forma isso reflete na quimiossensibilidade a drogas / PAWR (Prostate Apoptosis Response-4) also known as PAR-4 is a pro-apoptotic gene identified in prostate cancer cells when exposed to apoptotic stimuli. PAR-4 expression can increase sensitivity of cells to apoptosis, including breast cancer cells. Our laboratory performed transcriptome profiling (unpublished data), with the aim of analyzing differentially expressed genes associated with chemosensitivity to docetaxel in transfected MCF-7 cells with PAR-4 expression plasmid (MCF7pcPAR4) and with empty vector (MCF7pcNEO) before and after treatment with docetaxel. To assess the interaction between the differentially expressed genes functional gene networks were generated using the IPA Ingenuity® software. Networks generated containing genes directly or indirectly related with the WNT signaling pathway (Wingless-Type MMTV Integration 1) were highlighted. The present study aims to validate the differentially expressed genes identified in MCF-7 cells with different PAR-4 expression before and after exposure of docetaxel. By manual annotation of the genes most differentially expressed, the genes EGR1, XAF1, TARP and WNT5A were selected to be validated by quantitative real time PCR (qRT-PCR). The platform WNT Signaling Pathway Human RT2 Profiler (TM) PCR Array (Array PCR) was used to evaluate the effect of PAR-4 overexpression and docetaxel treatment in gene expression of canonical and noncanonical WNT pathways. The positive expression of WNT5A in MCF7pcPAR4 cells relative to MCF7pcNEO was confirmed by qRT-PCR in the presence and absence of docetaxel. The EGR1 gene showed significant upregulation in the qRT-PCR in the absence of treatment, but showed a different expression profile of the one observed in the transcriptome assay. The XAF1 showed a negative regulation in MCF7pcPAR4 cells when compared with MCF7pcNEO cells in the absence and presence of docetaxel, showing a similar trend in the absence of treatment but opposed trend in the presence of docetaxel. It was observed a significant increase in TARP expression in MCF7pcPAR4 cells by qRT-PCR in the absence and presence of docetaxel, but these findings do not confirm the results of the transcriptome. PCR Array data of MCF7pcPAR4 vs MCF7pcNEO comparison before treatment, showed a significant expression difference in nine genes (p < 0.005). The genes CDKN2A, EGR1, FGF7, IL6 and TWIST showed positive expression and the genes NTRK2, SOX2, SOX9 and WISP1 had negative expression. In the presence of docetaxel it was observed that the genes CACNAD2A3, GDF5, IL6, FGF7, LEF1 and TWIST showed upregulation and FST downregulation with statistical significance (p < 0.005). From 84 genes of the platform PCR array we observed 21 and 14 common genes between both techniques in the absence and presence docetaxel, respectively. In the absence of docetaxel 16 genes showed similar expression profile, among them the upregulation of GJA1, IGF1, IGF2, LEF1, MMP2, PDGFRA, PTGS2 and TWIST, together with downregulation of CDH1, JAG1, NTRK2 suggest activation of the WNT/beta-catenin pathway. While the expression of DAB2, WNT5A, FZD7 and RUNX2 indicates inactivation of this pathway. In the presence of treatment six genes showed the same expression profile. Among these, the upregulation of CTGF, DAB2 EGR1 suggest the inactivation of Wnt/beta-catenin pathway. On the other hand, positive expression of FGF20, LEF1 and PDGFRA suggests that Wnt/beta-catenin would be active. In this study, we show that PAR-4 modulates genes of the WNT signaling pathway. However, more experiments are needed to clarify the role of WNT canonical and non-canonical pathways and how this reflects on drug chemosensitivity

O câncer de mama é a neoplasia responsável pelo maior número de mortes em mulheres no Brasil, portanto, é importante encontrar novos marcadores específicos e de diagnóstico precoce, utilizando procedimentos simples e rápidos. A via de sinalização Wnt regula importantes funções celulares como proliferação, sobrevida e adesão. Esta via está associada com os processos de iniciação e progressão em muitos tipos tumorais, como câncer de cólon familiar, melanoma e pulmão; sendo que mutações em &beta;-Catenina (CTNNb1) explicam só 30% dos casos de sinalização aberrante encontrada no câncer de mama, indicando que existem outros componentes e/ou reguladores da via que possam estar envolvidos. O objetivo deste trabalho foi avaliar as variantes genéticas e epigenéticas nos genes do complexo de degradação de &beta;-Catenina num grupo de pacientes com câncer de mama e num grupo controle; e determinar os perfis de transcrição dos componentes da via de sinalização Wnt e da molécula de expressão exclusiva do epitélio mamário, a Mamaglobina Humana (MGA), assim como associar estes resultados com as características clínicas, histológicas e patológicas do tumor. Para atingir este objetivo foram coletadas amostras de sangue periférico de 102 mulheres com câncer de mama e 102 mulheres sadias como grupo controle. A avaliação das variantes rs465899 do gene APC, rs2240308 e rs151279728 do gene AXIN2, rs5030625 do gene CDH1 e rs334558 do gene GSK3, foi realizada por meio de PCR-RFLPs e sequenciamento, a análise dos perfis de metilação dos promotores pela MS-PCR. A RT-qPCR foi usada para determinar os níveis de expressão dos componentes da via e a MGA. As variantes rs2240308 e rs151279728 do gene AXIN2 mostraram uma forte associação com o risco de desenvolver o câncer de mama. Um aumento significativo foi observado no nível de expressão de AXIN2 no grupo de mulheres com câncer de mama. Análises adicionais mostraram perfis de expressão diferencial dos genes APC, AXIN2, CTNNB1, GSK3 e CSNK1A1 associado ao status dos receptores hormonais e histogênese tumoral. MGA foi identificado exclusivamente em 38% dos pacientes com câncer de mama e foi associada com a progressão da doença. Este é o primeiro estudo que relaciona uma variante do gene AXIN2 com o câncer de mama na população brasileira. As variantes avaliadas do gene AXIN2 são marcadores promissores de susceptibilidade ao câncer de mama na população estudada, sendo importante, a avaliação desta variante genética na população e determinar o seu real efeito no processo de iniciação e/ou progressão do câncer de mama. / Background: Wnt/&beta;-catenin signaling pathway is an important regulator of cellular functions such as proliferation, survival and cell adhesion. This pathway is associated with tumor initiation and progression; -catenin (CTNNB1) mutations explains only 30% of aberrant signaling found in breast cancer, indicating that other components and/or regulating of the Wnt/&beta;-catenin pathway may be involved. Objective: The objective of the study was to evaluate the APC rs465899, AXIN2 rs2240308 and rs151279728, CDH1 rs5030625 and GSK3 rs334558 polymorphisms, APC, AXIN2, CDH1 and GSK3 promoter methylation status and expression profile of -Catenin destruction complex genes and MGA in peripheral blood of breast cancer patients. Methods: We collected peripheral blood samples from 102 breast cancer and 102 healthy subjects. The identification of the mutation was performed using PCR-RFLPs and DNA sequencing. MSP and HRM-MS was used to measure promoter methylation and RT-qPCR to determine expression profile. Results: We found significant association of AXIN2 rs2240308 polymorphism with breast cancer. Increased risk was observed even after stratification based on clinicpathological characteristics. AXIN2 rs151279728 polymorphism was found only in 9 breast cancer patients, but none in control group subject. APC and CDH1 polymorphisms were not associated with breast cancer. GSK3 polymorphism was weak associated with breast cancer and heterozygous status was associated with breast cancer protection after group stratification. APC and CDH1 promoter methylation in breast cancer patients was found. Significant increase was observed in AXIN2, CTNNB1 and GSK3 level expression in breast cancer patients. APC was down-regulated in breast cancer patients. Further analyses, showed APC, AXIN2, CTNNB1, GSK3 and CSKN1A1 gene expression associated to receptor status and histological type. MGA was found only in breast cancer patients and was associated with cancer progression. Conclusion: The present study reports, for the first time, that AXIN2 genetic defect and -catenin destruction complex expression disturbance may be found in breast cancer patients, providing additional support to the role of Wnt/-catenin pathway dysfunction in breast cancer tumorigenesis. However, the functional consequence of this genetic alteration remains to be determined. In another hand MGA was determined like a good biomarker for diagnosis and prognosis outcome.