A biogênese do ribossomo é um processo complexo, altamente ordenado e regulado, no qual o transcrito primário é processado por endo e exonucleases para gerar os RNAs ribossomais maduros. Este processo foi melhor caracterizado em Saccharomyces cerevisiae, porém alguns fatores atuantes em humanos tiveram uma função divergente descrita. Um desses fatores é a proteína NIP7, altamente conservada em eucariotos, que atua na formação da subunidade ribossomal 60S, em levedura, e 40S, em humanos. Assim, esse trabalho propôs a caracterização funcional da proteína CrNIP7, homóloga a NIP7, presente em Chlamydomonas reinhardtii. C. reinhardtii é uma alga verde unicelular ancestral a plantas, utilizada como modelo eucarioto para estudos de fotossíntese e de flagelos. Nesse trabalho, um estudo de complementação funcional foi realizado utilizando duas linhagens de Saccharomyces cerevisiae diferentes e em ambas CrNIP7 complementou a função de Nip7p de leveduras, indicando uma participação na síntese da subunidade 60S do ribossomo. Uma busca por parceiros de interação de CrNIP7 foi também realizada, utilizando CrNIP7 como isca para rastrear uma biblioteca de cDNA de C. reinhardtii em sistema de duplo híbrido em leveduras, o que resultou em dois novos potenciais parceiros de interação. Esses parceiros foram identificados como proteínas preditas conceitualmente no genoma de C. reinhardtii, denominadas Predicted e G-patch. Adicionalmente, a interação entre CrNIP7 e CrSBDS, proteína homóloga a Sdo1 (de levedura) e HsSBDS (de humanos), foi confirmada através de um experimento de duplo híbrido dirigido. A interação entre as proteínas CrNIP7 e CrSBDS foi validada por pull down e um teste preliminar sugeriu que CrNIP7 e Predicted também interagem in vitro. Análises de bioinformática indicam que Predicted, G-patch e CrSBDS tenham regiões intrinsicamente desordenadas, as quais podem se estruturar na interação com seus parceiros. Em conjunto, os resultados desse trabalho contribuem para entendimento do papel de CrNIP7 na biogênese de ribossomos em Chlamydomonas reinhardtii em comparação com outros modelos eucarióticos. / Ribosome biogenesis is a complex, highly regulated and ordered process in which the primary transcript is processed by endo- and exonucleases to generate the mature ribosomal RNAs. This process was best characterized in Saccharomyces cerevisiae, but some factors have been described in humans with different function. One of these divergent factors is NIP7, a highly conserved protein in eukaryotes, which acts in the formation of ribosomal 60S subunit, in yeast, and 40S, in humans. Based on this, this work proposed the functional characterization of CrNIP7 protein, homologous to NIP7, from Chlamydomonas reinhardtii. C. reinhardtii is a green alga, ancestral to plants, that is used as an eukaryote model for photosynthesis and flagella studies. In this study, a functional complementation assay was performed using two different strains of Saccharomyces cerevisiae and, in both approaches, CrNIP7 protein complemented the function of Nip7p from yeast, indicating its participation in the synthesis of the 60S ribosomal subunit. A two-hybrid assay was carried out using CrNIP7 as bait to screen a C. reinhardtii cDNA library in order to find out CrNIP7 interaction partners, wich resulted in two novel potentially partners. The interacting proteins were identified as conceptually predicted proteins in the genome of C. reinhardtii and were called Predicted and G-patch. Additionally, the interaction between CrNIP7 and CrSBDS, a protein homologous to Sdo1 (yeast) and HsSBDS (humans), was confirmed by a direct two-hybrid assay. The interaction between CrNIP7 and CrSBDS proteins was validated by pull down and a preliminary test suggested that CrNIP7 and Predicted also interact in vitro. Bioinformatics analyzes indicate that Predicted, G-patch and CrSBDS have intrinsically disordered regions, which can be ordered in the moment of interaction. Taken together, the results of this work contribute to understand the role played by CrNIP7 in ribosome biogenesis in Chlamydomonas reinhardtii compared to other eukaryotic models.

A biogênese do ribossomo é um processo complexo, altamente ordenado e regulado, no qual o transcrito primário é processado por endo e exonucleases para gerar os RNAs ribossomais maduros. Este processo foi melhor caracterizado em Saccharomyces cerevisiae, porém alguns fatores atuantes em humanos tiveram uma função divergente descrita. Um desses fatores é a proteína NIP7, altamente conservada em eucariotos, que atua na formação da subunidade ribossomal 60S, em levedura, e 40S, em humanos. Assim, esse trabalho propôs a caracterização funcional da proteína CrNIP7, homóloga a NIP7, presente em Chlamydomonas reinhardtii. C. reinhardtii é uma alga verde unicelular ancestral a plantas, utilizada como modelo eucarioto para estudos de fotossíntese e de flagelos. Nesse trabalho, um estudo de complementação funcional foi realizado utilizando duas linhagens de Saccharomyces cerevisiae diferentes e em ambas CrNIP7 complementou a função de Nip7p de leveduras, indicando uma participação na síntese da subunidade 60S do ribossomo. Uma busca por parceiros de interação de CrNIP7 foi também realizada, utilizando CrNIP7 como isca para rastrear uma biblioteca de cDNA de C. reinhardtii em sistema de duplo híbrido em leveduras, o que resultou em dois novos potenciais parceiros de interação. Esses parceiros foram identificados como proteínas preditas conceitualmente no genoma de C. reinhardtii, denominadas Predicted e G-patch. Adicionalmente, a interação entre CrNIP7 e CrSBDS, proteína homóloga a Sdo1 (de levedura) e HsSBDS (de humanos), foi confirmada através de um experimento de duplo híbrido dirigido. A interação entre as proteínas CrNIP7 e CrSBDS foi validada por pull down e um teste preliminar sugeriu que CrNIP7 e Predicted também interagem in vitro. Análises de bioinformática indicam que Predicted, G-patch e CrSBDS tenham regiões intrinsicamente desordenadas, as quais podem se estruturar na interação com seus parceiros. Em conjunto, os resultados desse trabalho contribuem para entendimento do papel de CrNIP7 na biogênese de ribossomos em Chlamydomonas reinhardtii em comparação com outros modelos eucarióticos. / Ribosome biogenesis is a complex, highly regulated and ordered process in which the primary transcript is processed by endo- and exonucleases to generate the mature ribosomal RNAs. This process was best characterized in Saccharomyces cerevisiae, but some factors have been described in humans with different function. One of these divergent factors is NIP7, a highly conserved protein in eukaryotes, which acts in the formation of ribosomal 60S subunit, in yeast, and 40S, in humans. Based on this, this work proposed the functional characterization of CrNIP7 protein, homologous to NIP7, from Chlamydomonas reinhardtii. C. reinhardtii is a green alga, ancestral to plants, that is used as an eukaryote model for photosynthesis and flagella studies. In this study, a functional complementation assay was performed using two different strains of Saccharomyces cerevisiae and, in both approaches, CrNIP7 protein complemented the function of Nip7p from yeast, indicating its participation in the synthesis of the 60S ribosomal subunit. A two-hybrid assay was carried out using CrNIP7 as bait to screen a C. reinhardtii cDNA library in order to find out CrNIP7 interaction partners, wich resulted in two novel potentially partners. The interacting proteins were identified as conceptually predicted proteins in the genome of C. reinhardtii and were called Predicted and G-patch. Additionally, the interaction between CrNIP7 and CrSBDS, a protein homologous to Sdo1 (yeast) and HsSBDS (humans), was confirmed by a direct two-hybrid assay. The interaction between CrNIP7 and CrSBDS proteins was validated by pull down and a preliminary test suggested that CrNIP7 and Predicted also interact in vitro. Bioinformatics analyzes indicate that Predicted, G-patch and CrSBDS have intrinsically disordered regions, which can be ordered in the moment of interaction. Taken together, the results of this work contribute to understand the role played by CrNIP7 in ribosome biogenesis in Chlamydomonas reinhardtii compared to other eukaryotic models.

Em eucariotos, a formação das subunidades ribossomais envolve múltiplos fatores, responsáveis pelas etapas de maturação dos rRNAs e por sua associação a proteínas ribossomais. A via de processamento de pré-rRNA é bastante complexa e inclui várias etapas de modificação de nucleotídeos e clivagens endo- e exonucleolíticas. As modificações de nucleotídeos são dirigidas por snoRNPs, formados por snoRNAs e proteínas, que são divididos em duas classes gerais, de box H/ACA (pseudouridilação) e de box C/D (metilação). Dentre os snoRNP de box C/D está o U3, que embora apresente as seqüências características e se associe a proteínas desse grupo de snoRNPs, não dirige metilações no rRNA, mas sim as clivagens iniciais no pré-rRNA 35S. O snoRNA U3 de Saccharomyces cerevisiae é codificado por dois genes que contêm introns, snR17A e snR17B. Embora a via de montagem do snoRNP U3 ainda não tenha sido determinada com precisão, sabe-se que algumas proteínas do core de box C/D ligam-se ao pré-snoRNA U3 co-transcricionalmente, afetando o splicing e o processamento da extremidade 3´ deste snoRNA. A proteína Cwc24p, cuja caracterização funcional foi o objetivo deste trabalho, foi isolada em nosso laboratório interagindo com Nop17p, um fator de montagem dos snoRNPs de box C/D. Cwc24p possui um domínio RING conservado e foi isolada previamente em um complexo contendo o fator de splicing Cef1p. Os resultados aqui obtidos mostram que, de maneira condizente com os dados de interação, Cwc24p é uma proteína nuclear e sua depleção leva ao acúmulo do pré-snoRNA U3, o que acarreta uma diminuição da velocidade de processamento do pré-rRNA 35S. O modelo aqui proposto prevê o recrutamento de Cwc24p para o pré-snoRNA U3 por Nop17p, onde atua como um fator de eficiência do splicing. Estes resultados levaram à conclusão de que Cwc24p está envolvida no splicing do pré-snoRNA U3, afetando indiretamente o processamento do pré-rRNA. / In eukaryotes, the ribosome biogenesis involves a large number of factors, that are responsible for the rRNAs maturation and for their association with ribosomal proteins. The pre-rRNA processing pathway is very complex and includes many steps of nucleotide modifications and endo- and exonucleolytic cleavage reactions. The nucleotide modifications are directed by snoRNPs that are formed by snoRNAs and proteins, divided in two major groups, of box H/ACA (which direct pseudouridilation), or of box C/D (methylation). Although the snoRNP U3 presents the snoRNA sequences and the proteins characteristics of box C/D class, it is not involved in methylation, but rather in the early cleavages of pre-rRNA 35S. U3 snoRNA is transcribed from two intron-containing genes in yeast, snR17A and snR17B. Although the assembly of the U3 snoRNP has not been precisely determined, at least some of the core box C/D proteins are known to bind pre-U3 cotranscriptionally, thereby affecting splicing and 3\'-end processing of this snoRNA. We identified the interaction between the box C/D assembly factor Nop17p and Cwc24p, a novel yeast RING-finger protein which had been previously isolated in a complex with the splicing factor Cef1p. Here we show that, consistently with the protein interaction data, Cwc24p localizes to the cell nucleus, and its depletion leads to the accumulation of both U3 pre-snoRNAs. U3 snoRNA is involved in the early cleavages of 35S pre-rRNA, and the defective splicing of pre-U3 detected in cells depleted of Cwc24p causes the accumulation of the 35S precursor rRNA. These results led us to the conclusion that Cwc24p is involved in pre-U3 snoRNA splicing, indirectly affecting pre-rRNA processing.

Em eucariotos, a formação das subunidades ribossomais envolve múltiplos fatores, responsáveis pelas etapas de maturação dos rRNAs e por sua associação a proteínas ribossomais. A via de processamento de pré-rRNA é bastante complexa e inclui várias etapas de modificação de nucleotídeos e clivagens endo- e exonucleolíticas. As modificações de nucleotídeos são dirigidas por snoRNPs, formados por snoRNAs e proteínas, que são divididos em duas classes gerais, de box H/ACA (pseudouridilação) e de box C/D (metilação). Dentre os snoRNP de box C/D está o U3, que embora apresente as seqüências características e se associe a proteínas desse grupo de snoRNPs, não dirige metilações no rRNA, mas sim as clivagens iniciais no pré-rRNA 35S. O snoRNA U3 de Saccharomyces cerevisiae é codificado por dois genes que contêm introns, snR17A e snR17B. Embora a via de montagem do snoRNP U3 ainda não tenha sido determinada com precisão, sabe-se que algumas proteínas do core de box C/D ligam-se ao pré-snoRNA U3 co-transcricionalmente, afetando o splicing e o processamento da extremidade 3´ deste snoRNA. A proteína Cwc24p, cuja caracterização funcional foi o objetivo deste trabalho, foi isolada em nosso laboratório interagindo com Nop17p, um fator de montagem dos snoRNPs de box C/D. Cwc24p possui um domínio RING conservado e foi isolada previamente em um complexo contendo o fator de splicing Cef1p. Os resultados aqui obtidos mostram que, de maneira condizente com os dados de interação, Cwc24p é uma proteína nuclear e sua depleção leva ao acúmulo do pré-snoRNA U3, o que acarreta uma diminuição da velocidade de processamento do pré-rRNA 35S. O modelo aqui proposto prevê o recrutamento de Cwc24p para o pré-snoRNA U3 por Nop17p, onde atua como um fator de eficiência do splicing. Estes resultados levaram à conclusão de que Cwc24p está envolvida no splicing do pré-snoRNA U3, afetando indiretamente o processamento do pré-rRNA. / In eukaryotes, the ribosome biogenesis involves a large number of factors, that are responsible for the rRNAs maturation and for their association with ribosomal proteins. The pre-rRNA processing pathway is very complex and includes many steps of nucleotide modifications and endo- and exonucleolytic cleavage reactions. The nucleotide modifications are directed by snoRNPs that are formed by snoRNAs and proteins, divided in two major groups, of box H/ACA (which direct pseudouridilation), or of box C/D (methylation). Although the snoRNP U3 presents the snoRNA sequences and the proteins characteristics of box C/D class, it is not involved in methylation, but rather in the early cleavages of pre-rRNA 35S. U3 snoRNA is transcribed from two intron-containing genes in yeast, snR17A and snR17B. Although the assembly of the U3 snoRNP has not been precisely determined, at least some of the core box C/D proteins are known to bind pre-U3 cotranscriptionally, thereby affecting splicing and 3\'-end processing of this snoRNA. We identified the interaction between the box C/D assembly factor Nop17p and Cwc24p, a novel yeast RING-finger protein which had been previously isolated in a complex with the splicing factor Cef1p. Here we show that, consistently with the protein interaction data, Cwc24p localizes to the cell nucleus, and its depletion leads to the accumulation of both U3 pre-snoRNAs. U3 snoRNA is involved in the early cleavages of 35S pre-rRNA, and the defective splicing of pre-U3 detected in cells depleted of Cwc24p causes the accumulation of the 35S precursor rRNA. These results led us to the conclusion that Cwc24p is involved in pre-U3 snoRNA splicing, indirectly affecting pre-rRNA processing.