No presente trabalho foram estudados a necessidade de suplementação nutricional do hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz para bioconversão a etanol pela levedura Pichia stipitis, e os efeitos da agitação e da razão Vfrasco/Vmeio, em frascos agitados, sobre os parâmetros fermentativos deste processo. Os estudos da suplementação do hidrolisado para produção de etanol por bioconversão pela levedura Pichia stipitis avaliou a adição dos nutrientes: uréia ( 0 a 2,3 g/L) MgSO4.7H2O (0 a 1,0 g/L) e extrato de levedura (0 a 3,0 g/L). Este estudo mostrou que apenas a adição 3 g/L de extrato de levedura foi necessária para que o processo alcançasse bons resultados de conversão (YP/S = 0,29 g/g) e produtividade em etanol (QP = 0,24 g/L.h) não necessitando portanto da adição dos demais nutrientes. Comparado com o meio suplementado com todos os nutrientes, a suplementação com apenas 3 g/L de extrato de levedura, levou a um aumento de 14% na produtividade do processo. A avaliação da oxigenação em frascos agitados mostrou que a aeração foi um fator capaz de influenciar fortemente os parâmetros de fermentação (YP/S e QP). A condição de maior aeração favoreceu a produção de células e a condição de menor aeração favoreceu a conversão em etanol, porém com baixa produtividade, sendo a produtividade em etanol favorecida por condições intermediárias de aeração, correspondente a agitação de 200 rpm e a razão Vfrasco/Vmeio de 2,5, onde foram alcançadas conversão em produto (YP/S) e produtividade em etanol (QP) de 0,36 g/g e 0,39 g/L.h, respectivamente, o que representa um aumento de cerca de 63% a produtividade e 24% a conversão em etanol, quando comparado com as condições de aeração utilizadas anteriormente. A cinética de fermentação de Pichia stipitis no hidrolisado empregando as condições de suplementação nutricional e aeração otimizadas mostrou que a máxima concentração de etanol alcançada para o hidrolisado suplementado foi cerca de 23,6 g/L após 48 horas, consumindo neste tempo 86 % dos açúcares presentes no meio. Comportamento semelhante foi observado para o meio sintético, onde, no mesmo tempo, a máxima concentração de etanol foi de 24,4 g/L, porém com completo consumo dos açúcares. / The present work studied the necessity of nutritional supplementation of rice straw hemicellulosic hydrolysate for ethanol bioconversion by Pichia stipitis, and the aeration (effects of agitation and Vflask/Vmedium ratio) in agitated flasks, on the fermentative parameters of the process. The studies on the hydrolysate supplementation for ethanol production by Pichia stipitis yeast bioconversion evaluated the nutrients addition: urea (0 to 2.3 g/L), MgSO47H2O (0 to 10 g/L) and yeast extract (0 to 3.0 g/L). This study showed that only the addition of 3g/L yeast extract was enough to obtain good results for ethanol conversion (YP/S = 0.29 g/g) and productivity (QP = 0.24 g/L.h). By comparing to the medium supplemented with all the nutrients, the supplementation with only 3 g/L yeast extract increased 14% the process productivity. The evaluation of the oxygenation in agitated flasks showed that the aeration highly influenced the fermentative parameters (YP/S and QP). The condition of higher aeration favored the cells production and the condition of lower aeration favored the ethanol conversion, but with low productivity. The ethanol productivity was favored by intermediary conditions of aeration, correspondent to 200 rpm agitation and 2.5 Vflask/Vmedium ratio, thus obtaining 0.36 g/g product conversion (YP/S) and 0.39 g/L.h ethanol productivity (QP). This means an increase of approximately 63% productivity and 24% ethanol conversion, when compared to the aeration conditions previously used. The kinetics of Pichia stipitis fermentation in the hydrolysate using the optimized conditions of nutritional supplementation and aeration rate showed that the maximum ethanol concentration for the supplemented hydrolysate was about 23.6 g/L after 48h, consuming 86% sugars present in the medium. Similar behavior was observed for the synthetic medium where, with the same time, the maximum ethanol concentration was 24.4 g/L, but with the complete sugars consumption.

O presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito da suplementação do meio de fermentação com diferentes fontes de nitrogênio e avaliar estratégias de aclimatação da levedura Pichia stipitis ao hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz visando melhorar a produção de etanol. Em uma primeira etapa do trabalho foram realizados estudos em meio semissintético para avaliar o efeito das fontes de nitrogênio arginina, ácido glutâmico, uréia e fosfato de amônio sobre a produção de etanol por P. stipitis. Os resultados em meio semissintético demonstraram que o meio composto por ácido glutâmico, fosfato de amônio e extrato de levedura nas concentrações de 3 g/L proporcionou os melhores resultados de conversão (YP/S = 0,36 g/g) e produtividade (QP = 0,71 g/L.h). O estudo de suplementação nutricional do hidrolisado mostrou que o crescimento de P. stipitis foi inibido pela suplementação com ácido glutâmico, e que a presença de extrato de levedura e fosfato de amônio não apresentou qualquer efeito sobre a produção de etanol, sendo o hidrolisado hemicelulósico capaz de suprir a necessidade nutricional da levedura, dispensando a sua suplementação para o uso como meio de fermentação. Na etapa de aclimatação da levedura P. stipitis ao hidrolisado, foram avaliadas cinco estratégias (A, B, C, D e E), baseadas em transferências sucessivas de células para meios com concentrações crescentes de hidrolisado, 45, 60 e 75 % (v/v). Durante a estratégia de aclimatação A foi possível isolar uma colônia (A75-2) capaz de fermentar em hidrolisado contendo 70 g/L de xilose, alcançando valores dos parâmetros YP/S (0,35 g/g) e QP (0,23 g/L.h), 10 e 28 % superiores, respectivamente, aos obtidos pela cepa original. Os resultados das estratégias B e C mostraram que mesmo empregando um maior número de transferências, assim como a utilização de elevadas concentrações celulares, não foram capazes de contribuir com o processo de aclimatação. Na avaliação das estratégias D e E, verificou-se que o emprego de condições de maiores níveis de fornecimento de oxigênio durante as etapas de transferências sucessivas propiciaram condições mais adequadas para que a levedura superasse os efeitos de inibição ocasionados pelos compostos tóxicos presentes no hidrolisado. A estratégia E, realizada sob condição de maior aeração, apresentou os melhores resultados dentre as estratégias de aclimatação avaliadas, sendo obtida uma produção de 27 g/L de etanol após 72 horas. Além disso, esta estratégia foi a única em que a levedura foi capaz de manter os valores de YP/S (0,33 g/g) e QP (0,35 g/L.h) durante todas as transferências, indicando uma maior aclimatação ao hidrolisado. Na fermentação em biorreator, o emprego de inóculo proveniente de cultivo sucessivo de células, quando comparado à fermentação realizada sem cultivo sucessivo, proporcionou um aumento de 7 e 50% sobre os valores de YP/S e QP, respectivamente. Com os resultados do presente trabalho pode-se concluir que estratégias de aclimatação da levedura P. stipitis em hidrolisado não destoxificado são métodos eficazes para a superação de inúmeros problemas relativos às condições de stress fisiológico e inibição do metabolismo microbiano. Porém, a resposta fisiológica da levedura P. stipitis é dependente do número de transferências, concentração celular e oxigenação do meio. / In this work, different acclimatization strategies employing the yeast Pichia stipitis on rice straw hemicellulosic hydrolysate with high xylose concentration were evaluated. Initially, the effects of nitrogen sources supplementation in the semisynthetic and hydrolysate medium on P.stipitis fermentation were studied. The results showed that in semisynthetic medium the addition of glutamic acid, ammonium phosphate and yeast extract at concentrations of 3 g/L provided the best conversion (YP/S = 0.36 g/g) and productivity (QP = 0.71 g/L.h). On the other hand, the hydrolysate supplementation with yeast extract and ammonium phosphate did not show effect on the fermentative parameters, whereas glutamic acid supplementation inhibited completely the cellular growth. These results show that the hemicellulosic hydrolysate can be used as a fermentation medium without any nutritional supplementation. To overcome the effects of inhibition caused by toxic compounds present on rice straw hemicellulosic hydrolysate, five acclimatization strategies (A, B, C, D and E) were performed by sequentially transferring of the cells in hydrolysate containing increasing concentrations (45, 60 and 75% (v/v). During the strategy A was possible isolate a colony (A75-2) with ability to ferment the hydrolysate containing xylose at 70 g/L (YP/S = 0.35 g/g and QP =0.23 g/L.h), which corresponded to increase of 10 and 28%, respectively, as compared to the values obtained by the original strain. Employing a greater number of transfers, as well as the use of high cell concentrations (strategies B and C) was not possible improve to the acclimatization process. Regarding the strategy E, which employed higher levels of oxygen supply during periods of successive transfers, showed the most appropriate for the yeast overcome the effects of inhibition caused by toxic compounds present in the hydrolysate. With this strategy the best results (27 g/L ethanol after 72 hours) among all assessed, were observed. Moreover, this approach was the only in which the yeast was able to keep the values of YP/S (0.33 g/g) and QP (0.35 g/L.h) for all transfers, indicating greater acclimatization to hydrolysate. By using this strategy in bioreactor fermentation, it was obtained an increase of 7 and 50% on the values of YP/S and QP, respectively, in relation the reference fermentation (without successive transfer). It is possible conclude that acclimatization strategies of the yeast P. stipitis in no detoxified hydrolysate are effective methods to overcome numerous problems concerning the physiological stress and inhibition of microbial metabolism. However, the physiological response of yeast is dependent on the transfers number, cell concentration and oxygenation level of the medium.

O presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito da suplementação do meio de fermentação com diferentes fontes de nitrogênio e avaliar estratégias de aclimatação da levedura Pichia stipitis ao hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz visando melhorar a produção de etanol. Em uma primeira etapa do trabalho foram realizados estudos em meio semissintético para avaliar o efeito das fontes de nitrogênio arginina, ácido glutâmico, uréia e fosfato de amônio sobre a produção de etanol por P. stipitis. Os resultados em meio semissintético demonstraram que o meio composto por ácido glutâmico, fosfato de amônio e extrato de levedura nas concentrações de 3 g/L proporcionou os melhores resultados de conversão (YP/S = 0,36 g/g) e produtividade (QP = 0,71 g/L.h). O estudo de suplementação nutricional do hidrolisado mostrou que o crescimento de P. stipitis foi inibido pela suplementação com ácido glutâmico, e que a presença de extrato de levedura e fosfato de amônio não apresentou qualquer efeito sobre a produção de etanol, sendo o hidrolisado hemicelulósico capaz de suprir a necessidade nutricional da levedura, dispensando a sua suplementação para o uso como meio de fermentação. Na etapa de aclimatação da levedura P. stipitis ao hidrolisado, foram avaliadas cinco estratégias (A, B, C, D e E), baseadas em transferências sucessivas de células para meios com concentrações crescentes de hidrolisado, 45, 60 e 75 % (v/v). Durante a estratégia de aclimatação A foi possível isolar uma colônia (A75-2) capaz de fermentar em hidrolisado contendo 70 g/L de xilose, alcançando valores dos parâmetros YP/S (0,35 g/g) e QP (0,23 g/L.h), 10 e 28 % superiores, respectivamente, aos obtidos pela cepa original. Os resultados das estratégias B e C mostraram que mesmo empregando um maior número de transferências, assim como a utilização de elevadas concentrações celulares, não foram capazes de contribuir com o processo de aclimatação. Na avaliação das estratégias D e E, verificou-se que o emprego de condições de maiores níveis de fornecimento de oxigênio durante as etapas de transferências sucessivas propiciaram condições mais adequadas para que a levedura superasse os efeitos de inibição ocasionados pelos compostos tóxicos presentes no hidrolisado. A estratégia E, realizada sob condição de maior aeração, apresentou os melhores resultados dentre as estratégias de aclimatação avaliadas, sendo obtida uma produção de 27 g/L de etanol após 72 horas. Além disso, esta estratégia foi a única em que a levedura foi capaz de manter os valores de YP/S (0,33 g/g) e QP (0,35 g/L.h) durante todas as transferências, indicando uma maior aclimatação ao hidrolisado. Na fermentação em biorreator, o emprego de inóculo proveniente de cultivo sucessivo de células, quando comparado à fermentação realizada sem cultivo sucessivo, proporcionou um aumento de 7 e 50% sobre os valores de YP/S e QP, respectivamente. Com os resultados do presente trabalho pode-se concluir que estratégias de aclimatação da levedura P. stipitis em hidrolisado não destoxificado são métodos eficazes para a superação de inúmeros problemas relativos às condições de stress fisiológico e inibição do metabolismo microbiano. Porém, a resposta fisiológica da levedura P. stipitis é dependente do número de transferências, concentração celular e oxigenação do meio. / In this work, different acclimatization strategies employing the yeast Pichia stipitis on rice straw hemicellulosic hydrolysate with high xylose concentration were evaluated. Initially, the effects of nitrogen sources supplementation in the semisynthetic and hydrolysate medium on P.stipitis fermentation were studied. The results showed that in semisynthetic medium the addition of glutamic acid, ammonium phosphate and yeast extract at concentrations of 3 g/L provided the best conversion (YP/S = 0.36 g/g) and productivity (QP = 0.71 g/L.h). On the other hand, the hydrolysate supplementation with yeast extract and ammonium phosphate did not show effect on the fermentative parameters, whereas glutamic acid supplementation inhibited completely the cellular growth. These results show that the hemicellulosic hydrolysate can be used as a fermentation medium without any nutritional supplementation. To overcome the effects of inhibition caused by toxic compounds present on rice straw hemicellulosic hydrolysate, five acclimatization strategies (A, B, C, D and E) were performed by sequentially transferring of the cells in hydrolysate containing increasing concentrations (45, 60 and 75% (v/v). During the strategy A was possible isolate a colony (A75-2) with ability to ferment the hydrolysate containing xylose at 70 g/L (YP/S = 0.35 g/g and QP =0.23 g/L.h), which corresponded to increase of 10 and 28%, respectively, as compared to the values obtained by the original strain. Employing a greater number of transfers, as well as the use of high cell concentrations (strategies B and C) was not possible improve to the acclimatization process. Regarding the strategy E, which employed higher levels of oxygen supply during periods of successive transfers, showed the most appropriate for the yeast overcome the effects of inhibition caused by toxic compounds present in the hydrolysate. With this strategy the best results (27 g/L ethanol after 72 hours) among all assessed, were observed. Moreover, this approach was the only in which the yeast was able to keep the values of YP/S (0.33 g/g) and QP (0.35 g/L.h) for all transfers, indicating greater acclimatization to hydrolysate. By using this strategy in bioreactor fermentation, it was obtained an increase of 7 and 50% on the values of YP/S and QP, respectively, in relation the reference fermentation (without successive transfer). It is possible conclude that acclimatization strategies of the yeast P. stipitis in no detoxified hydrolysate are effective methods to overcome numerous problems concerning the physiological stress and inhibition of microbial metabolism. However, the physiological response of yeast is dependent on the transfers number, cell concentration and oxygenation level of the medium.

No presente trabalho foram estudados a necessidade de suplementação nutricional do hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz para bioconversão a etanol pela levedura Pichia stipitis, e os efeitos da agitação e da razão Vfrasco/Vmeio, em frascos agitados, sobre os parâmetros fermentativos deste processo. Os estudos da suplementação do hidrolisado para produção de etanol por bioconversão pela levedura Pichia stipitis avaliou a adição dos nutrientes: uréia ( 0 a 2,3 g/L) MgSO4.7H2O (0 a 1,0 g/L) e extrato de levedura (0 a 3,0 g/L). Este estudo mostrou que apenas a adição 3 g/L de extrato de levedura foi necessária para que o processo alcançasse bons resultados de conversão (YP/S = 0,29 g/g) e produtividade em etanol (QP = 0,24 g/L.h) não necessitando portanto da adição dos demais nutrientes. Comparado com o meio suplementado com todos os nutrientes, a suplementação com apenas 3 g/L de extrato de levedura, levou a um aumento de 14% na produtividade do processo. A avaliação da oxigenação em frascos agitados mostrou que a aeração foi um fator capaz de influenciar fortemente os parâmetros de fermentação (YP/S e QP). A condição de maior aeração favoreceu a produção de células e a condição de menor aeração favoreceu a conversão em etanol, porém com baixa produtividade, sendo a produtividade em etanol favorecida por condições intermediárias de aeração, correspondente a agitação de 200 rpm e a razão Vfrasco/Vmeio de 2,5, onde foram alcançadas conversão em produto (YP/S) e produtividade em etanol (QP) de 0,36 g/g e 0,39 g/L.h, respectivamente, o que representa um aumento de cerca de 63% a produtividade e 24% a conversão em etanol, quando comparado com as condições de aeração utilizadas anteriormente. A cinética de fermentação de Pichia stipitis no hidrolisado empregando as condições de suplementação nutricional e aeração otimizadas mostrou que a máxima concentração de etanol alcançada para o hidrolisado suplementado foi cerca de 23,6 g/L após 48 horas, consumindo neste tempo 86 % dos açúcares presentes no meio. Comportamento semelhante foi observado para o meio sintético, onde, no mesmo tempo, a máxima concentração de etanol foi de 24,4 g/L, porém com completo consumo dos açúcares. / The present work studied the necessity of nutritional supplementation of rice straw hemicellulosic hydrolysate for ethanol bioconversion by Pichia stipitis, and the aeration (effects of agitation and Vflask/Vmedium ratio) in agitated flasks, on the fermentative parameters of the process. The studies on the hydrolysate supplementation for ethanol production by Pichia stipitis yeast bioconversion evaluated the nutrients addition: urea (0 to 2.3 g/L), MgSO47H2O (0 to 10 g/L) and yeast extract (0 to 3.0 g/L). This study showed that only the addition of 3g/L yeast extract was enough to obtain good results for ethanol conversion (YP/S = 0.29 g/g) and productivity (QP = 0.24 g/L.h). By comparing to the medium supplemented with all the nutrients, the supplementation with only 3 g/L yeast extract increased 14% the process productivity. The evaluation of the oxygenation in agitated flasks showed that the aeration highly influenced the fermentative parameters (YP/S and QP). The condition of higher aeration favored the cells production and the condition of lower aeration favored the ethanol conversion, but with low productivity. The ethanol productivity was favored by intermediary conditions of aeration, correspondent to 200 rpm agitation and 2.5 Vflask/Vmedium ratio, thus obtaining 0.36 g/g product conversion (YP/S) and 0.39 g/L.h ethanol productivity (QP). This means an increase of approximately 63% productivity and 24% ethanol conversion, when compared to the aeration conditions previously used. The kinetics of Pichia stipitis fermentation in the hydrolysate using the optimized conditions of nutritional supplementation and aeration rate showed that the maximum ethanol concentration for the supplemented hydrolysate was about 23.6 g/L after 48h, consuming 86% sugars present in the medium. Similar behavior was observed for the synthetic medium where, with the same time, the maximum ethanol concentration was 24.4 g/L, but with the complete sugars consumption.