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Entwicklung einer Reversen Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zum Nachweis der Persistenz von Rotaviren beim Schwein

Schwarz, Bernd-Andreas 05 September 2003 (has links)
Im Graduiertenkolleg „Schlachttierbelastung und Produktsicherheit“ der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig sollten in interdisziplinärer Zusammenarbeit Erkenntnisse zum Verhalten transportbelasteter Schlachtschweine in Bezug auf bakterielle Translokationsprozesse erarbeitet werden. Es wurden Mastschweine aus herkömmlichen Mastbetrieben definierten Belastungssituationen ausgesetzt , geschlachtet und untersucht. Dabei sollten physiologische, pathologisch-anatomische, immunologische, lebensmittel- und fleischhygienische, bakteriologische, virologische sowie ethologische Fragestellungen bearbeitet werden. Ziel war es festzustellen, ob eine Belastung der Tiere (u.a. durch den Transport) Auswirkungen auf die Produktqualität hat und ob durch eine Translokation pathogener Erreger ein Risiko für die Gesundheit des Verbrauchers besteht. Im Teilprojekt des Institutes für Virologie wurde untersucht, ob Rotavirus-Infektionen von Schlachtschweinen unter der Problematik der Belastung ein mögliches Infektionsrisiko für den Menschen darstellen. Um die zu erwartende niedrige Konzentration von Rotaviren in Organen von Schlachtschweinen nachweisen zu können, wurde eine kompetitive RT-PCR zum Nachweis von Rotaviren der Gruppe A verschiedener Spezies entwickelt. Dazu wurde ein sogenannter Kompetitor synthetisch hergestellt, welcher als interne oder externe Reaktionskontrolle eingesetzt wurde. Zum einen diente er der Überprüfung des ordnungsgemäßen Verlaufes einer RT-PCR, zum anderen wurde er zur Herstellung von Standards verwendet. Die RT-PCR wurde anschließend in eine „Real time“ RT-PCR umgewandelt. Sowohl mit der herkömmlichen als auch mit der „Real-time“ RT-PCR konnten 10 spezifische RNA-Moleküle in einer Probe nachgewiesen werden. In einer SPF-Schweineherde, welche einer Belastung infolge eines Tiertransports ausgesetzt war, konnten mit Hilfe der RT-PCR klinisch gesunde intermittierende Rotavirus-Ausscheider entdeckt werden. Bei einigen dieser Tiere gelang der Nachweis der Virusausscheidung über einen Zeitraum von drei Monaten. Nach der Schlachtung wurden in Organen des lymphatischen Systems bei zwei Schweinen sehr geringe Konzentrationen an rotavirus-spezifischer RNA detektiert. Infektiöses Virus konnte daraus allerdings nicht isoliert werden. Auch in einer Mastschweineherde konnte bei einigen Tieren Rotavirus-spezifische RNA im Kot nachgewiesen werden. Ein Infektionsversuch dieser Tiere mit Salmonella typhimurium konnte keine Reaktivierung der Rotavirus-Infektion auslösen. Aufgrund des Zoonose-Potentials von Rotaviren kann nach den Untersuchungen ein Infektionsrisiko für den Verbraucher durch eine endogene Kontamination von Schlachttieren mit Rotaviren nicht sicher ausgeschlossen werden. Die Untersuchungen zeigten auch, dass intermittierende Rotavirus-Ausscheider ein Infektionsrisiko für den Verbraucher darstellen, wenn z.B. bei der Schlachtung der Tiere oder bei der Verarbeitung des Fleisches dieser Tiere hygienische Grundregeln verletzt werden. Besonders gefährdet wären hierbei Neugeborene, Kinder, Senioren und immunsupprimierte Personen. Ein Ort einer Viruspersistenz in Organen konnte auch nach diesen Untersuchungen nicht gefunden werden. Dennoch scheint es, dass Rotaviren in der Natur oder in einer Population von Menschen oder Tieren persistieren. Durch ständige Neuinfektionen bzw. Reinfektionen empfänglicher Organismen haben Rotaviren so ihre Erhaltung gesichert. / Within the graduate programme “Schlachttierbelastung und Produktsicherheit” of the Veterinary Faculty of the University of Leipzig, the behaviour of slaughter swine exposed to the stress of transport was observed in an interdisciplinary collaboration concerning the translocation processes of bacteria. Fattened pigs from conventional pig fattening units were exposed to particular stress situations, and then slaughtered and examined. The following aspects of this process were investigated: physiology, pathological-anatomy, immunology, food and meat hygiene, bacteriology, virology and ethology. The aim of this study was to verify whether exposing the animals to stress situations (such as transport) influences the quality of the product and whether the translocation of pathogens represents a risk for consumer health. Within the sub-project of the Institute for Virology, analyses were made to verify whether rotavirus infections of slaughter swine exposed to stress situations represents a potential contamination risk for humans. In order to detect the expected low concentration of rotaviruses in the organs of slaughtered pigs, a competitive RT-PCR was developed as a test of rotaviruses for various group A species. To do this, a so-called competitor was synthetically created, which was used as an internal and external reaction control. On one hand, it was used to verify the regular course of an RT-PCR reaction, and on the other hand, it was implemented to develop standards. RT-PCR was then modified by means of a real time RT-PCR. Both with the conventional and with the real time RT-PCR, it was possible to detect 10 specific RNA molecules/ sample.With this new very sensitive and specific amplification process, it was possible to detect rotavirus-specific RNA in the excrement of people and of pigs, cows, horses, rabbits and monkeys. the evidence of the virus excretion was produced over a time period of three months. After slaughtering, low amounts of rotavirus specific RNA were found in the organs of the lymphatic system. There were no indications that any of these organs were infectious. Rotavirus specific RNA was also found in the excrement of some fattened pigs. An attempt to infect these animals with Salmonella typhimurium was unable to cause any reactivation of the rotavirus infection. An infection risk for the consumer through an endogenous rotavirus contamination of fattened pigs cannot be excluded with any degree of certainty on the basis of these analyses due to the zoonotic potential of rotaviruses. The analyses also showed that intermittent rotavirus excretors represent an infection risk for the consumer, if for example basic hygiene rules are broken during the slaughter or meat processing of these animals. At special risk may be new-borns, children, youth, the elderly and people suffering from immunodeficiency. These examinations could not find a specific place in the organs where the virus persists. Nevertheless, it seems that rotaviruses persist in the environment or in a population of people or animals. With constant new infections or re-infections of receptive organisms, rotaviruses seem to have assured their survival.

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