Les furocoumarines constituent l'une des classes de métabolites secondaires dérivant de la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes. Elles ont été décrites comme étant des phytoaléxines mais sont également très largement utilisées par l'Homme pour leurs propriétés thérapeutiques. Un certain nombre d'études biochimiques ont été réalisées afin d'en comprendre la biosynthèse mais peu de choses sont connues concernant leur déterminisme moléculaire. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur la caractérisation fonctionnelle de gènes appartenant aux prényltransférases aromatiques potentiellement impliquées dans cette voie de biosynthèse. Les prényltransférases catalysent la première étape de la voie de biosynthèse des furocoumarines linéaires ou angulaires. Elles permettent l'addition d'un groupement dimethylally pyrophosphate (DMAPP) sur l'umbelliférone. En utilisant SfN8DT-1, une prényltransférase aromatique récemment caractérisée, comme sonde, nous avons identifié 7 gènes candidats chez deux familles de plantes (Rutaceae et Apiaceae). Dans la mesure où il a été décrit que ces enzymes étaient des protéines membranaires, nous avons adapté un système d'expression hétérologue basé sur l'utilisation de N. benthamiana. Ce système a été validé par l'expression de deux protéines membranaires : un cytochrome P450 CYP98A22 et une prényltransférase déjà caractérisée SfN8DT-1. Nous avons ensuite utilisé ce système d'expression pour réaliser l'étude des 7 gènes nouvellement isolés. Ces travaux nous ont permis de caractériser la première umbelliferone prenyltransferase de Petroselinum crispum capable de catalyser in vitro et in vivo la prénylation du carbone 6 ou 8 de l'umbelliférone en présence de DMAPP permettant ainsi la synthèse respectivement de demethylsuberosin et d'osthenol. Par ailleurs, une étude réalisée in planta chez le persil a permis de mettre en évidence une relation positive entre le niveau d'expression du gène et la teneur en umbelliférone prénylée. L'étude de la surexpression du gène chez Ruta graveolens a permis de mettre en évidence un lien entre l'expression du gène et la disparition de l'umbelliférone. Enfin nous avons identifié la même activité pour une prényltransférase de Pastinaca sativa, ce qui nous amène à émettre l'hypothèse que l'étape de prénylation n'est pas une étape limitante dans la biosynthèse des furocoumarines angulaires, étant donné que le persil ne produit que des furocoumarines linéaires, tandis que le panais produit des furocoumarines linéaires et angulaires. L'utilisation de ces mêmes systèmes d'expression hétérologue de N. benthamiana et R. graveolens nous a également permis d'identifier une seconde prényltransférase aromatique capable de catalyser l'addition de géranylpyrophosphate (GPP) sur l'umbelliférone et sur l'esculétine / Furanocoumarins constitute one of the classes of secondary metabolites deriving from the phenylpropanoid biosynthetic pathway. These molecules are described as phytoalexins in plants but are also used by humans for their pharmaceutical properties. A large number of biochemical studies were carried out to understand their biosynthetic pathway but little information was available concerning the genes involved in the pathway. In this study, we focused on the characterization of genes encoding for aromatic prenyltransferases which were described to be involved in this pathway. Prenlyltransferases catalyze the entry step to the linear or angular furanocoumarin pathway. Hence they catalyze the addition of a dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) prenyl moiety to umbelliferone. Using a recently characterized aromatic prenyltransferase (SfN8DT-1) as a probe, we isolated 7 different candidate genes from two plant families (Rutaceae and Apiaceae). As these enzymes were described as membrane bound proteins, we adapted a heterologous expression system made up of Nicotiana benthamian aand we validated its efficiency by using two membrane-associated enzymes: a cytochrome P450 (CYP98A22) and the already described prenyltransferase SfN8DT-1. Subsequently, this system was used to perform the functional characterization of the 7 newly identified proteins. This way we succeeded to characterize the first umbelliferone prenyltransferase of Petroselinum crispum that was able to catalyze both the 6-C and 8-C prenylation of umbelliferone with DMAPP producing demethylsuberosin and osthenol respectively. We made evidence that these reactions occurred both in vitro and in vivo. In addition, in planta studies performed in P.crispum showed a positive relationship between the gene expression level and the content of prenylated umbelliferone. The overexpression of this gene was investigated in Ruta graveolens and we could provide evidences of a link between the enzymatic activity and the disappearance of umbelliferone. We also reported a similar activity for a prenyltransferase isolated from Pastinaca sativa, which makes us assume that the prenylation step is not a rate limiting step in the biosynthetic pathway of angular furanocoumarins since parsley is producing only linear furanocoumarins whereas parsnip is producing both linear and angular furanocoumarins. In addition, using the same N. benthamiana and R. graveolens heterologous expression systems, we identified a second aromatic prenyltransferase able to catalyze the addition of geranyl pyrophosphate (GPP) both to umbelliferone and esculetin

La rue officinale (Ruta graveolens L) est une plante connue comme étant particulièrement riche en métabolites secondaires et produisant notamment des molécules d’intérêt pharmaceutique comme les furocoumarines. Nous avons tenté par une approche de génie métabolique d’augmenter la teneur en furocoumarines produites dans les plantes. La mise en place de telles approches nous a également permis de mieux comprendre les mécanismes de régulation de la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes. Pour atteindre ces objectifs nous avons transformé la rue avec différents gènes placés sous le contrôle d’un promoteur constitutif fort, le promoteur 35S du CaMV. Pour chaque série de transformants nous avons étudié la teneur en furocoumarines et analysé les variations de composés phénylpropanoïdes (rutine, umbelliférone, ferulate, scopolétine). Parallèlement à cette analyse métabolique, une corrélation a été réalisée avec le niveau d’expression des transgènes et de certains endogènes par l’utilisation d’approche de PCR quantitative. Les séries de plantes transgéniques surexprimant les gènes codants pour la Coumaroyl ester 3’-Hydroxylase de rue (CYP98A22) et d’A. thaliana (CYP98A3) présentent toutes les deux une augmentation significative d’une facteur 3 de la teneur en furocoumarines. Par contre si les premières sont caractérisées par une diminution de la production en rutine et en umbelliférone, les secondes présentent une augmentation importante de la teneur en Scopolétine et en umbelliférone. Ces résultats suggèrent la coexistence de deux C3’H chez R. graveolens ayant des fonctions différentes, l’une d’entre elles étant impliquée directement ou non dans la synthèse de scopolétine. Si la transformation génétique de rues avec des gènes de la famille CYP98A induit des modifications du métabolisme secondaire, la surexpression d’un gène spécifique à la voie de biosynthèse des furocoumarines (gène cyp71AJ1, codant pour la psoralène synthase d’A. majus) permet d’augmenter uniquement la teneur en furocoumarines (X4). L’ensemble de ces travaux a permis de montrer l’intérêt d’une approche de génie métabolique pour générer des plantes présentant un intérêt potentiel pour la production de molécules d’intérêts pharmaceutiques / Garden Rue (Ruta graveolens L.) is a plant known as being particularly rich in secondary metabolites and in particular producing molecules of pharmaceutical interest like furocoumarines. By the use of a metabolic engineering approach, we tried to increase the content of furocoumarines produced in these plants but also to better understand the regulation mechanisms of the phenylpropanoïd biosynthesis pathway. To achieve these goals we transformed Ruta plants with various genes placed under the control of a strong constitutive promoter, CaMV 35S promoter. The plants we obtained were analyzed for their ability to overproduce furocoumarines but also other phenylpropanoïds like ferulate, umbelliferone, scopoletine or rutin. Using Real Time PCR experiments, a correlation was carried out with the level of expression of each transgene and several endogenous genes. Plants overexpressing either the Ruta or the Arabidopsis Coumaroyl ester 3 '-Hydroxylase (CYP98A22 and CYP98A3 respectively) display both a significant increase (3 time level) of the furocoumarin. However if the S-98A22 plants are characterized by a reduction in the production of rutin and umbelliferone, S-98A3 transgenic plants display a significant increase scopoletine and umbelliferone content. These results suggest the coexistence of two C3'H having different functions in Ruta. One of them might be involved more specifically in the synthesis of scopoletine. If the transformation of Ruta with genes belonging to the CYP98A family generates an enlarged of the secondary metabolism, we also showed that the overexpression of a gene belonging to the furocoumarins biosynthesis pathway (CYP71AJ1, the psoralen synthase) allowed a specific stimulation. Indeed a 4 time increase of the content of furocouramins was noticed in these transgenic plant lines. This work made it possible to make evidence of the interest of a metabolic engineering approach to generate plants of interest for the production of pharmaceutical molecules

Les furocoumarines sont des phytoalexines offrant un potentiel thérapeutique important. Les travaux présentés ici portent sur les cytochromes P450 participant à leur voie de biosynthèse. Une étude «structure-fonction» de la cinnamate-4-hydroxylase (C4H) a été réalisée pour identifier les déterminants de la faible sensibilité de la C4H de Ruta graveolens (CYP73A32) au psoralène. Deux régions protéiques semblent impliquées dans l’inactivation différentielle entre CYP73A32 et CYP73A1. L’une, entre les résidus 31 et 58, est responsable de l’affinité pour le psoralène. L’autre, entre les résidus 229 et 379, contrôle la vitesse d’inactivation. La caractérisation de nouveaux P450 de la biosynthèse des furocoumarines a été entreprise. D’une part, plusieurs ADNc partiels ont été clonés chez Ruta graveolens. D’autre part, CYP71AJ1 isolé chez Ammi majus, a été caractérisé comme étant une psoralène synthase. La spécificité de CYP71AJ1 pour la marmésine a été approchée par l’étude d’un modèle 3D. Mots clés : cytochrome P450, psoralène synthase, cinnamate-4-Hydroxylase, C4H, métabolite secondaire, Ruta graveolens, Ammi majus, inactivation autocatalytique, furocoumarines, psoralène, (+)-marmésine, Modélisation 3D, (+)-columbianetine / Furocoumarins are phytoalexins known as efficient therapeutic agents. The work reported here focuses on cytochromes P450 involved in their biosynthesis pathway. A “structure-function” study was realized to understand how C4H from Ruta graveolens (CYP73A32) can resist to psoralen mechanism-based inactivation. Two parts of the protein seems involved in the differential susceptibility of CYP73A32 and CYP73A1 to psoralen. The first, between amino acids 31 and 58, defines differential affinity to psoralen. The second between residues 229 and 379 controls inactivation kinetic. The second part of this work was devoted to cloning and identification of new P450 involved in furocoumarin biosynthesis. On the one hand, several partial cDNA were cloned from Ruta graveolens. On the other hand, CYP71AJ1, cloned from Ammi majus, was identified as a psoralen synthase. The specificity of CYP71AJ1 for marmesin was approached by the study of a 3D model.