Les bactéries se prêtent très bien aux analyses phylogénétiques en raison du fait que plusieurs génomes ont été entièrement séquencés -et leur nombre continue d'augmenter -et leurs génomes sont petits et ne contiennent que peu d'ADN répétitif en contraste avec les génomes des eucaryotes. La molécule d'ARNr 16S, l'ARN composant de la petite sous-unité du ribosome, a été établie comme la macromolécule de choix pour les analyses phylogénétiques et l'identification des espèces bactériennes. En dépit de sa position centrale, l'utilisation de l'ARNr 16S n'est pas sans inconvénients. En effet, l'évolution d'un seul gène n'est pas nécessairement représentative de l'évolution d'un génome entier, des hétérogénéités entre des copies du gène d'ARNr 16S -des allèles -ne sont pas exceptionnelles, et des copies paralogues peuvent suggérer des phylogénies différentes. De plus, au cours des dernières années, des analyses phylogénétiques basées sur des séquences codant pour des protéines conservées -telles des gènes de ménage (house-keeping genes) -ont donné des résultats discordants. Parmi les bactéries, les y-protéobactéries avec 33 génomes entièrement séquencés sont les plus étudiées, certainement en raison de leurs importances cliniques et biologiques. L'objectif de mon travail a été, d'une part d'étudier l'hétérogénéité des séquences des allèles de l'ARNr 16S chez 33 y-protéobactéries et de déterminer si un seul allèle par bactérie est suffisant pour établir une phylogénie, d'autre part de construire les arbres phylogénétiques de ces 33 y-protéobactéries à partir de l'analyse comparée des séquences de certains gènes de ménage à savoir: l'adénylate kinase (adk), la shikimate déshydrogénase (aroE), la glucose-6-phosphate déshydrogénase (gdh) et de leurs séquences concaténées. Ces phylogénies seront comparées entre elles et aussi à celle établie à partir du gène de l'ARNr 16S. Les analyses phylogénétiques ont démontré que la plupart des séquences alléliques d'une même souche sont identiques ou quasi identiques et sont regroupées à l'intérieur d'un même genre et d'une même espèce. À cause de leurs homogénéités, un seul allèle du gène de l'ARNr 16S est suffisant pour construire la phylogénie des y-protéobactéries au niveau du genre et de l'espèce. Les arbres phylogénétiques construits à partir de chacun des trois gènes de ménage -adk, aroE et gdh -et des séquences concaténées des trois gènes sont, en général, similaires à l'arbre construit à partir du gène de l'ARNr 16S, aux niveaux de la famille, du genre, de l'espèce et de la souche, avec certaines exceptions. Les gènes de ménage, cependant, montrent un plus haut taux de substitutions nucléotidiques que le gène de l'ARNr 16S. De plus, parce que les trois gènes de ménage ont chacun un pourcentage plus bas de similarité de séquences que le gène de l'ARNr 16S, ils ont montré une meilleure différenciation des neuf souches de bactéries entériques Escherichia-Shigella-Salmonella. Ils peuvent potentiellement révéler des relations sur des branches plus profondes d'un arbre phylogénétique que ne le peut le gène de l'ARNr 16S. De plus, puisque ces gènes de ménage sont utilisés dans les typages de séquence multi-locus "multilocus sequence typing (MLST)", nous pouvons nous attendre à ce que le nombre de séquences disponibles dans le domaine public pour ces trois gènes de ménage augmente rapidement les rendant ainsi d'autant plus utiles pour complémenter le gène de l'ARNr 16S dans des études phylogénétiques, ou pour certaines autres analyses phylogénétiques très ciblées. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : y-protéobactéries, Gènes de ménage, Phylogénie, ARNr 16S.

Le virus de l'immunodéficience bovine (VIB) est un rétrovirus qui partage des propriétés similaires avec les autres lentivirus, dont le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). L'expression des gènes lentiviraux dépend des protéines régulatrices virales Tat et Rev qui interviennent, dans le cycle de réplication virale, aux niveaux transcriptionnel et post-transcriptionnel, respectivement. Les longues répétitions terminales (LTR) du génome viral fournissent, quant à elles, les signaux d'initiation, d'amplification et de terminaison de la transcription. La protéine Tat, pour exercer son activité transactivatrice, interagit avec une séquence d'ARN appelée TAR ("transactivaton response element") présente sur tous les transcrits viraux. Tat recrute le facteur positif de l'élongation de la transcription b (pTEFb) au niveau du promoteur viral des LTR pour augmenter l'efficacité de transcription de l'ARN polymérase II. La protéine nucléaire Rev est impliquée dans le transport nucléo-cytoplasmique des ARN viraux mono- et non épissés. Récemment, une protéine hybride Tat/Rev constituée de 236 acides aminés (Tat 236) a été découverte à partir de virions isolés de la rate de lapins qui avaient été infectés trois ans auparavant, suggérant une évolution temporelle du virus in vivo. L'objectif de ce travail était de déterminer si des variations génétiques et/ou fonctionnelles pouvaient se retrouver dans d'autres parties du génome du variant du VIB impliquées dans la régulation de l'expression génique virale, notamment au niveau du LTR et du gène accessoire rev du VIB. Ainsi, en utilisant la technique d'amplification en chaîne des gènes (PCR), une séquence LTR mutante (LTRm) fut mise en évidence, démontrant la présence de trois mutations aux positions 191, 250 et 271 lorsque comparée à celle du LTR pré-infection obtenue du génome des virus ayant servi à l'infection des lapins. La séquence du LTR pré-infection était 100% identique à celle du LTR sauvage (LTRs) retrouvée dans la littérature. En utilisant un test de transactivation CAT in vitro avec la protéine Tat103 comme agent transactivateur, le LTRm démontra une activité promotrice d'au moins deux fois supérieure à celle obtenue avec le LTRs. Pour tenter d'associer ces mutations au nouveau caractère phénotypique de LTRm, des mutants de restauration furent développés par PCR-mutagenèse pour revenir au phénotype LTRs. L'ensemble des résultats obtenus suggère que les mutations en positions 250 et 271 seraient impliquées dans l'activité promotrice augmentée de LTRm. Finalement, l'analyse de séquences du gène rev pré- et post- infection a montré deux mutations aux positions 48 (Val → Ile) et 76 (Pro → Leu), la dernière étant localisée dans un domaine riche en arginine. Fait intéressant, la mutation à la position 76 avait aussi été rapportée auparavant dans la portion Rev de Tat236. Les résultats obtenus suggèrent une évolution temporelle du VIB dans le cours d'infections in vivo au niveau du LTR et du gène rev, similaire à celle antérieurement décrite pour le gène tat. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : lentivirus, région du LTR, gène rev, diversité génétique

La nécessité de valoriser les co-produits laitiers, dans un souci de croissance économique dans ce secteur, a conduit à l'émergence de nouveaux ingrédients. Par exemple, les hydrolysats de protéines lactosériques constituent une source importante de peptides potentiellement bioactifs. Toutefois, l'isolation et la purification de telles molécules semblent nécessaires afin d'améliorer leur bioefficacité. Les peptides peuvent être dessalés par électrodialyse (ED) mais leur colmatage sur les membranes échangeuses d'anions (MEA) et de cations (MEC) diminue l'efficacité du procédé. Dans cette optique, la présente étude a pour objectifs (1) d'identifier, caractériser et quantifier les séquences peptidiques responsables du colmatage des MEA et MEC, (2) de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents au colmatage et (3) d'évaluer l'impact des différents régimes de courant en ED quant-à l'éventuelle prévention du colmatage. Dans un premier temps, le colmatage a été généré en condition statiques sans application de courant puis caractérisé. Dans un second temps, les phénomènes de dissociation d'eau et d'électroconvection ont été étudiés afin d’optimiser le procédé in-situ avec courant. Ainsi, en conditions statiques, les MEA chargées positivement (N+(CH3)3), présentaient un colmatage plus élevé à pH 6 et 10 qu’à pH 2. Les analyses HPLC-MS ont révélé que les peptides VLVLDTDYK, TPEVDDEALEK et IDALNENK (chargés négativement à pH 6 et 10) constituaient 86% du colmatage à ces pH alors qu’aucun peptide n’a été détecté à pH 2. Par conséquent, des interactions électrostatiques entre les charges peptidiques (COO-) et les groupements des MEA se sont établies. Concernant les MEC chargées négativement (SO3-), le colmatage était plus important à pH 6 qu'à pH 2 et 10. En outre, les analyses HPLC-MS ont révélé qu'à pH 6, les séquences ALPMHIR et TKIPAVFK chargées positivement (NH3+) ont établit des interactions (1) électrostatiques peptide/MEC créant une première couche puis (2) hydrophobes peptide/peptide via leurs résidus hydrophobes respectifs générant une seconde couche. Néanmoins à pH 2, le colmatage était moindre alors que ces peptides portaient théoriquement davantage de charges positives. Il est possible qu'à pH acide, les charges membranaires des MEC aient été protonnées (HSO3) et donc non chargées contrecarrant ainsi l'établissement d'interactions électrostatiques. Dans la seconde partie avec application de courant, le colmatage respectif des MEA et MEC a été réduit de 62 et 36 % en conditions électroconvectives. Les résultats démontrent que travailler à pH acide ou en régime post-limite permettrait de limiter voire d'éviter totalement le colmatage des membranes augmentant ainsi leur durée de vie et l'efficacité du procédé. Cette thèse propose différents mécanismes de colmatage en fonction de la nature de la MEI et des caractéristiques physico-chimiques des peptides. L'utilisation future de séquences peptidiques modèles, connues et synthétiques permettrait d'améliorer davantage les connaissances de ces mécanismes. / In the dairy industry, the economical growth led to the necessity of creating high added-value products from low commercial value by-products. For example, whey proteins hydrolysates (WPH) are an important source of peptides potentially bioactive. However, bioactive peptides need to be isolated and purified in order to enhance their bioactivities. The WPH demineralization by conventional electrodialysis (ED) may lead to peptide fouling on anion (AEM) and cation-exchange membranes (CEM) and decrease the process efficiency. Therefore, this study aimed (1) to identify, characterize and quantify the peptide sequences responsible for membrane fouling, (2) to better understand the mechanisms involved in peptide fouling and (3) to evaluate the impact of non-conventional ED modes on fouling. In a first phase, peptide fouling was generated and characterized in static conditions and without applying current. In a second phase, fouling was carried-out in real hydrodynamic conditions using ohmic, limiting and overlimiting currents in order to optimize the demineralization process. Results showed that in static conditions for AEMs, fouling was important at pH 6 and 10 and absent at pH 2. Based on HPLC-MS results, the VLVLDTDYK, TPEVDDEALEK and IDALNENK sequences (negatively charged at pH 6 and 10) represented 86% of the total fouling at these pH values whereas no peptide was detected at pH 2. Consequently, electrostatic interactions were established between the negative peptide charges (COO-) and positive AEM charges (N+(CH3)3). Concerning the CEMs, fouling was more important at pH 6 than 2 and 10. At pH 6, ALPMHIR and TKIPAVFK sequences firstly established electrostatic interactions with the negative CEM charges (SO3-) through their positive residues (NH3+) creating a first layer. Secondly, peptide/peptide interactions occurred through their respective hydrophobic residues creating a second layer. Nonetheless at pH 2, fouling was twice lower whereas peptides carried more positive charges. It is possible that for acidic pH values, CEM charges were partially protonated (HSO3) and consequently neutralized and unable to establish electrostatic interactions. Finally during a demineralization step in hydrodynamic conditions, fouling of AEM and CEM was reduced using overlimiting current by 62 and 36 %, respectively. According to these results, working at acidic pH values or using overlimiting conditions would hamper nay avoid fouling on membranes which would increase their lifetime and effectiveness. Different fouling mechanism models depending on the nature of IEM and the physicochemical characteristics of peptides are suggested in this thesis. In the future, the use of synthetic and well-characterized peptide sequences would enable to improve the knowledge of these mechanisms.

Le présent mémoire se divise en deux parties principales. La première traite de la synthèse efficace de macrocycles peptidiques par une approche sur support solide. La seconde partie présente le design et les avancements dans la synthèse d'une nouvelle nanostructure peptidique de type canal. Ces deux projets ont en commun l'utilisation de macrocycles peptidiques. Le premier chapitre constitue une introduction aux canaux et nanopores naturels et artificiels développés dans le passé, ainsi que l'approche novatrice de notre groupe de recherche, amenant ainsi les objectifs de ce projet de maîtrise. Le deuxième chapitre traite de la synthèse de séquences peptidiques modèles pour le développement et la compréhension des paramètres influençant une réaction clé de clivage cyclidatif, permettant l'obtention de macrocycles peptidiques. Le troisième chapitre porte sur l'étude de la séquence sur cette même réaction clé, facteur très important pour cette réaction. Le quatrième chapitre traite quant à lui du design et de la stratégie pour la formation d'un nanopore moléculaire, incluant un macrocycle peptidique comme élément de pore de la nanostructure. Les essais et avancements pour la synthèse de ce canal cible seront discutés.