As espécies reativas de oxigênio (ERO) em baixos níveis são necessárias para as funções normais do espermatozoide, as quais estão envolvidas com a capacidade de fertilização. Entretanto, várias evidências demonstram que a produção excessiva de ERO leva ao estresse oxidativo, que por sua vez está relacionado à infertilidade masculina. Uma correlação positiva entre os níveis excessivos de ERO e concentrações anormais de espermatozoides, motilidade e morfologia tem sido descrita. Além disso, a capacidade antioxidante total do sêmen tem sido significativamente menor em casos de infertilidade comparado com casos férteis. O estresse oxidativo também tem sido relacionado ao envelhecimento e há evidências de que o acúmulo de radicais livres danifica o DNA do espermatozoide e prejudica a fertilização. A Organização Mundial da Saúde tem enfatizado a importância da avaliação do estresse oxidativo seminal e recomendado que cada laboratório estabeleça os valores de referência para os parâmetros do sêmen em sua população. O objetivo deste estudo foi avaliar o estado redox no sêmen humano e sua correlação com os parâmetros do espermograma. Para tanto, avaliou-se a medida de ERO (quimioluminescência, QL), a atividade antioxidante (QL e catalase), a peroxidação lipídica (malondialdeído, MDA), a medida dos produtos avançados de oxidação proteica (AOPP) e apoptose/necrose (anexina/iodeto de propídeo, citometria de fluxo) no sêmen humano de homens saudáveis e férteis (Controles; n=7). As metodologias foram padronizadas para aplicá-las à análise do sêmen de homens que estavam em investigação de infertilidade (Pacientes; n=23), e correlacionar os resultados com os parâmetros do espermograma. Os principais resultados mostraram 1) a medida de ERO no sêmen de Pacientes sem alterações no espermograma (Pacientesa; n=9) foi maior do aquela para sêmen dos Pacientes com alterações no espermograma (Pacientesb; n=14) e dos Controles, sugerindo comprometimento da qualidade do sêmen pelo aumento de ERO, mesmo com espermograma normal; 2) não houve diferenças entre os grupos quanto à peroxidação lipídica (MDA), aos AOPP, catalase e apoptose/necrose; 3) quanto às correlações entre os parâmetros analisados, observou-se: correlação positiva entre a medida de ERO no sêmen in natura e no sêmen lavado do grupo Pacientes, validando a utilização do sêmen in natura para esta metodologia; correlação positiva entre a medida de ERO in natura e a apoptose, número de espermatozoides e número de leucócitos somente para o grupo Pacientesb; correlação entre a medida de ERO in natura e a motilidade progressiva somente para o grupo Controle; correlação entre apoptose e número de espermatozoides nos grupos Pacientes e Pacientesa; estes resultados mostram correlações particulares em cada grupo e correlações compartilhadas, que caracterizam Controles e Pacientes. O perfil da presença e da ausência destas correlações no grupo Controle pode estabelecer um padrão de referência para as análises do estresse oxidativo no sêmen. Os resultados poderão contribuir para a aplicação da medida das ERO e das suas correlações com parâmetros do espermograma na análise de rotina do sêmen humano, para a investigação da infertilidade e de patologias do sistema reprodutor masculino. / Reactive oxygen species (ROS) at low levels are required for normal function of sperm, which are involved in fertilization capacity. However, evidences show that the excessive production of ROS leads to oxidative stress, which in turn is related to male infertility. A positive correlation between excessive levels of ROS and abnormal sperm concentration, motility and morphology has been described. Moreover, the total antioxidant capacity of the semen has been significantly lower in cases of infertility compared with fertile cases. Oxidative stress has also been associated with aging and there is evidence that the excess of free radicals damages the DNA of sperm and impairs fertilization. The World Health Organization has emphasized the importance of the evaluation of seminal oxidative stress and recommended that each laboratory establish reference values for the parameters of semen in their population. The aim of this study was to evaluate the redox state in human semen and its correlation with semen parameters. For this purpose, we evaluated the measurement of ROS (chemiluminescence, CL), the antioxidant activity (CL and catalase), lipid peroxidation (malondialdehyde, MDA), the advanced oxidation protein products (AOPP) and apoptosis / necrosis (annexin / propidium iodide flow cytometry) in semen of healthy, fertile men (Controls, n = 7). The methods were standardized to apply them to the analysis of semen of men who were in infertility investigation (Patients, n = 23), and to correlate the results with the parameters of sperm. The main results showed: 1) the measurement of ROS in the semen of patients with normal semen (Patientsa, n = 9) was higher than that for semen of patients with abnormal semen analysis (Patientsb, n = 14) and Controls, suggesting impairment of the quality semen by increasing ROS, despite normal semen; 2) no differences were found among the groups regarding to lipid peroxidation (MDA), the AOPP, catalase and apoptosis / necrosis; 3) concerning the correlations among the parameters analyzed, we observed: positive correlation between the measurement of ROS in semen in natura and washed semen of Patients group, validating the use of semen in natura for this method; positive correlation between the measurement of ROS in semen in natura and apoptosis, number of spermatozoa and leukocytes only for the Patientsb group; correlation between the measurement of ROS in semen in natura and progressive motility only for the Control group; correlation between apoptosis and number of spermatozoa in the groups Patients and Patientsa; these results show particular and shared correlations in each group, which characterize Controls and Patients. The profile of the presence and absence of these correlations in the Control group may establish a reference standard for the analysis of oxidative stress in the semen. These results may contribute to the use of the measurement of ROS and their correlations with semen parameters in routine analysis of human semen, for the investigation of infertility and disorders of the male reproductive system.

OBJETIVO: Comparar dois meios de congelamento para sêmen: o comercialmente disponível Meio de Congelamento TEST Yolk Buffer-Irvine Scientific - USA (TYB) e o crioprotetor sintético suplementado com fosfatidilcolina (PC) e antioxidante L-acetil-carnitina (ANTIOXPC - delineado pela Invitra Tecnologia de Reprodução Assistida - Brasil) em relação a motilidade progressiva (PR) e índice de fragmentação do DNA (IFD) em amostras de sêmen obtidas de homens com parâmetros seminais alterados. DESENHO: Ensaio clínico de nãoinferioridade. MATERIAIS E MÉTODOS: Foram incluídas amostras de sêmen com parâmetros seminais alterados (astenozoospermia) de 58 voluntários no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. As amostras de sêmen foram submetidas à análise antes e após a criopreservação. A motilidade dos espermatozoides foi avaliada pelo espermograma e a fragmentação do DNA espermático foi analisada pela técnica transferase-mediated dUTP nick-end labelling (TUNEL). Antes da criopreservação, todas as amostras de sêmen foram divididas e randomizadas para receber os crioprotetores TYB ou ANTIOX-PC, congelados no período mínimo de 30 dias e descongelados. Uma análise exploratória dos dados foi realizada através de medidas de posição central e dispersão. O teste t pareado foi usado para comparar os grupos. Comparações entre os dois meios, ANTIOX-PC e TYB, e sêmen fresco foram realizadas através de contrastes ortogonais, utilizando o modelo de regressão linear de efeitos mistos. Este modelo foi implementado no programa SAS 9.3 considerando o PROC MIXED. RESULTADOS: A motilidade PR (P = 0,78) e o IFD (P = 0,06) não foram diferentes quando comparados os meios ANTIOX-PC (12,40 ± 11,49 e 13,33 ± 10,54) e o TYB (12,09 ± 11,11 e15,83 ± 11,04), respectivamente. Esses dados mostraram que o crioprotetor sintético delineado não foi inferior na proteção dos espermatozoides comparado com o meio TYB. Além disso, o ANTIOX-PC reteve taxas mais altas de motilidade total43,36 ± 26,77) do que o TYB (34,79 ± 22,86; P <0,0001) e reduziu significativamente as taxas de espermatozoides imóveis (56,64 ± 26,77; P <0,0001) em relação ao TYB (65.00 ± 23.00).CONCLUSÃO: O meio ANTIOX-PC não pode ser considerado menos efetivo que o TYB em relação à motilidade PR e ao IFD. Parâmetros cinéticos observados em espermatozoides pósdescongelamento do diluente ANTIOX-PC demonstraram o impacto positivo do tratamento com fosfolipídios/antioxidantes na criotolerância espermática humana na ausência de aditivos animais. / OBJECTIVE: To compare two sperm freezing media: commercially available Freezing Medium TEST Yolk Buffer-Irvine Scientific - USA (TYB) and a synthetic cryoprotectant supplemented with phosphatidylcholine (PC) and antioxidante L-acetyl-carnitine (ANTIOXPC - designed by Invitra Assisted Reproduction Technology - Brazil) in relation to progressive motility and sperm DNA fragmentation index (DFI) in sêmen samples obtained from men with altered seminal parameters. DESIGN: Non-inferiority clinical trial. MATERIALS AND METHODS: Were included semen samples with altered seminal parameters (asthenospermia) from 58 volunteers at the Clinical Hospital of Ribeirao Preto Medical School, University of São Paulo. Semen samples were subjected to analysis both before and after cryopreservation. The sperm motility was evaluated by the spermogram and the sperm DNA fragmentation was analyzed by the transferase-mediated dUTP nick-end labeling technique (TUNEL). Before cryopreservation, all semen samples were divided and randomized to receive the cryoprotectants TYB or ANTIOX-PC, frozen and thawed after 30 days. An exploratory data analysis was carried out through measures of central position and dispersion. The paired t-test was used to compare the groups. Comparisons between the two media ANTIOX-PC and TYB, and fresh semen were performed through orthogonal contrasts using the mixed effects linear regression model. This model was implemented in the SAS 9.3 program considering PROC MIXED. RESULTS: Progressive motility (P = 0.78) and DFI (P = 0.06) were not different when comparing ANTIOX-PC (12.40 ± 11.49; and 13,33 ± 10.54) and TYB (12.09 ± 11.11 and 15.83 ± 11.04), respectively. These data showed that the synthetic cryoprotectant designed was not inferior in sperm protection compared to the TYB medium. In addition, ANTIOX-PC retained higher rates of overall motility (43.36 ± 26.77)than TYB (34.79 ± 22.86; P<0,0001) and significantly reduced the immotile sperm rates (56.64 ± 26.77; P<0,0001) when compared with TYB (65.00 ± 23.00). CONCLUSION: ANTIOX-PC medium can not be considered less effective than TYB relative to progressive motility and IFD. Kinetic parameters observed in post-thaw sperm from ANTIOX-PC extender demonstrated the positive impact of the phospholipid/antioxidant treatment on human sperm cryotolerance in the absence of animal aditives.

OBJETIVO: Comparar dois meios de congelamento para sêmen: o comercialmente disponível Meio de Congelamento TEST Yolk Buffer-Irvine Scientific - USA (TYB) e o crioprotetor sintético suplementado com fosfatidilcolina (PC) e antioxidante L-acetil-carnitina (ANTIOXPC - delineado pela Invitra Tecnologia de Reprodução Assistida - Brasil) em relação a motilidade progressiva (PR) e índice de fragmentação do DNA (IFD) em amostras de sêmen obtidas de homens com parâmetros seminais alterados. DESENHO: Ensaio clínico de nãoinferioridade. MATERIAIS E MÉTODOS: Foram incluídas amostras de sêmen com parâmetros seminais alterados (astenozoospermia) de 58 voluntários no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. As amostras de sêmen foram submetidas à análise antes e após a criopreservação. A motilidade dos espermatozoides foi avaliada pelo espermograma e a fragmentação do DNA espermático foi analisada pela técnica transferase-mediated dUTP nick-end labelling (TUNEL). Antes da criopreservação, todas as amostras de sêmen foram divididas e randomizadas para receber os crioprotetores TYB ou ANTIOX-PC, congelados no período mínimo de 30 dias e descongelados. Uma análise exploratória dos dados foi realizada através de medidas de posição central e dispersão. O teste t pareado foi usado para comparar os grupos. Comparações entre os dois meios, ANTIOX-PC e TYB, e sêmen fresco foram realizadas através de contrastes ortogonais, utilizando o modelo de regressão linear de efeitos mistos. Este modelo foi implementado no programa SAS 9.3 considerando o PROC MIXED. RESULTADOS: A motilidade PR (P = 0,78) e o IFD (P = 0,06) não foram diferentes quando comparados os meios ANTIOX-PC (12,40 ± 11,49 e 13,33 ± 10,54) e o TYB (12,09 ± 11,11 e15,83 ± 11,04), respectivamente. Esses dados mostraram que o crioprotetor sintético delineado não foi inferior na proteção dos espermatozoides comparado com o meio TYB. Além disso, o ANTIOX-PC reteve taxas mais altas de motilidade total43,36 ± 26,77) do que o TYB (34,79 ± 22,86; P <0,0001) e reduziu significativamente as taxas de espermatozoides imóveis (56,64 ± 26,77; P <0,0001) em relação ao TYB (65.00 ± 23.00).CONCLUSÃO: O meio ANTIOX-PC não pode ser considerado menos efetivo que o TYB em relação à motilidade PR e ao IFD. Parâmetros cinéticos observados em espermatozoides pósdescongelamento do diluente ANTIOX-PC demonstraram o impacto positivo do tratamento com fosfolipídios/antioxidantes na criotolerância espermática humana na ausência de aditivos animais. / OBJECTIVE: To compare two sperm freezing media: commercially available Freezing Medium TEST Yolk Buffer-Irvine Scientific - USA (TYB) and a synthetic cryoprotectant supplemented with phosphatidylcholine (PC) and antioxidante L-acetyl-carnitine (ANTIOXPC - designed by Invitra Assisted Reproduction Technology - Brazil) in relation to progressive motility and sperm DNA fragmentation index (DFI) in sêmen samples obtained from men with altered seminal parameters. DESIGN: Non-inferiority clinical trial. MATERIALS AND METHODS: Were included semen samples with altered seminal parameters (asthenospermia) from 58 volunteers at the Clinical Hospital of Ribeirao Preto Medical School, University of São Paulo. Semen samples were subjected to analysis both before and after cryopreservation. The sperm motility was evaluated by the spermogram and the sperm DNA fragmentation was analyzed by the transferase-mediated dUTP nick-end labeling technique (TUNEL). Before cryopreservation, all semen samples were divided and randomized to receive the cryoprotectants TYB or ANTIOX-PC, frozen and thawed after 30 days. An exploratory data analysis was carried out through measures of central position and dispersion. The paired t-test was used to compare the groups. Comparisons between the two media ANTIOX-PC and TYB, and fresh semen were performed through orthogonal contrasts using the mixed effects linear regression model. This model was implemented in the SAS 9.3 program considering PROC MIXED. RESULTS: Progressive motility (P = 0.78) and DFI (P = 0.06) were not different when comparing ANTIOX-PC (12.40 ± 11.49; and 13,33 ± 10.54) and TYB (12.09 ± 11.11 and 15.83 ± 11.04), respectively. These data showed that the synthetic cryoprotectant designed was not inferior in sperm protection compared to the TYB medium. In addition, ANTIOX-PC retained higher rates of overall motility (43.36 ± 26.77)than TYB (34.79 ± 22.86; P<0,0001) and significantly reduced the immotile sperm rates (56.64 ± 26.77; P<0,0001) when compared with TYB (65.00 ± 23.00). CONCLUSION: ANTIOX-PC medium can not be considered less effective than TYB relative to progressive motility and IFD. Kinetic parameters observed in post-thaw sperm from ANTIOX-PC extender demonstrated the positive impact of the phospholipid/antioxidant treatment on human sperm cryotolerance in the absence of animal aditives.

OBJETIVOS: Avaliar a eficácia de um meio de criopreservação sintético para sêmen humano contendo fosfolipídios e antioxidantes (ANTIOX-PL, Invitra/Supera Parque de Inovação e Tecnologia de Ribeirão Preto) em comparação com o meio convencional à base de gema de ovo (TEST-yolk buffer, Irvine Scientific), mensurada pelos parâmetros in vitro de motilidade progressiva dos espermatozoides e índice de fragmentação do DNA espermático. MÉTODOS: Ensaio clínico de não-inferioridade. Foram recrutados 63 homens (julho de 2015 a outubro de 2016), com idade entre 18 a 50 anos, amostra seminal com volume >= 1,5 mL, concentração de espermatozoides >= 15 x 106/mL e motilidade progressiva >= 32%. O sêmen foi dividido em duas alíquotas com volumes iguais, randomizadas aleatoriamente nos grupos estudo (ANTIOX-PC) e controle (TEST-yolk buffer) para receberem os meios de criopreservação. A avaliação dos desfechos foi cega para atribuição de grupo, verificados antes do congelamento e após o descongelamento. Os dados foram comparados pelo teste t pareado pelo SAS versão 9.3; ?=0,05. RESULTADOS: A motilidade progressiva (p=0.83) e o índice de fragmentação do DNA (p=0.32) analisados nas amostras de sêmen congeladas com o meio A (ANTIOXPL) não apresentaram diferença significativa em relação às que foram congeladas com o meio B (TEST-yolk buffer). A concentração (p=0.02), a concentração total (p=0.02), o percentual de espermatozoides I (p<0.01) e a vitalidade (p<0.01) foram superiores nas amostras congeladas com o meio B (TEST-yolk buffer). A motilidade não progressiva (p<0.01) e a motilidade total (p<0.01) foram superiores nas amostras congeladas com o meio A (ANTIOX-PC). E a morfologia (p=0.07) não apresentou diferença significativa entre os meios de criopreservação. CONCLUSÕES: Em relação aos desfechos primários analisados, motilidade progressiva dos espermatozoides e índice de fragmentação do DNA espermático, a nova formulação proposta neste projeto de pesquisa, ANTIOX-PC, mostrou-se não inferior ao meio convencional, TEST-yolk buffer. / OBJECTIVES: To evaluate the efficacy of a synthetic cryopreservation medium for human semen containing phospholipids and antioxidants (ANTIOX-PC, Invitra / Supera Parque de Inovação e Tecnologia de Ribeirão Preto) compared to conventional egg yolk medium (TEST-yolk buffer, Irvine Scientific), measured by the in vitro parameters of progressive sperm motility and sperm DNA fragmentation index. METHODS: Non-inferiority clinical trial. 63 men (July 2015 to October 2016), aged 18 to 50 years, seminal sample with volume >= 1,5 mL, spermatozoa >= 15 x 106/mL and progressive motility >= 32% were recruited. The semen was divided into two aliquots with equal volumes, randomly randomized in the study (ANTIOX-PC) and control (TEST-yolk buffer) groups to receive cryopreservation media. The evaluation of the outcomes was blind to group assignment, verified before freezing and after thawing. The data were compared by the t-test paired by SAS version 9.3; ? = 0.05. RESULTS: Progressive motility (p=0.83) and DNA fragmentation index (p=0.32) analyzed in the semen samples frozen with medium A (ANTIOX-PL) showed no significant difference in relation to those frozen with the medium B (TEST-yolk buffer). The concentration (p=0.02), the total concentration (p=0.02), the percentage of immobile spermatozoa (p<0.01) and vitality (p<0.01) were higher in the samples frozen with medium B TEST-yolk buffer). Nonprogressive motility (p<0.01) and total motility (p <0.01) were higher in samples frozen with medium A (ANTIOX-PC). And the morphology (p=0.07) showed no significant difference between the cryopreservation media. CONCLUSIONS: The new formulation proposed in this research project, ANTIOX-PC, was not inferior to the conventional medium, TEST-yolk buffer, in relation to the primary endpoints analyzed, sperm motile spermatozoa and sperm DNA fragmentation index.

OBJETIVOS: Avaliar a eficácia de um meio de criopreservação sintético para sêmen humano contendo fosfolipídios e antioxidantes (ANTIOX-PL, Invitra/Supera Parque de Inovação e Tecnologia de Ribeirão Preto) em comparação com o meio convencional à base de gema de ovo (TEST-yolk buffer, Irvine Scientific), mensurada pelos parâmetros in vitro de motilidade progressiva dos espermatozoides e índice de fragmentação do DNA espermático. MÉTODOS: Ensaio clínico de não-inferioridade. Foram recrutados 63 homens (julho de 2015 a outubro de 2016), com idade entre 18 a 50 anos, amostra seminal com volume >= 1,5 mL, concentração de espermatozoides >= 15 x 106/mL e motilidade progressiva >= 32%. O sêmen foi dividido em duas alíquotas com volumes iguais, randomizadas aleatoriamente nos grupos estudo (ANTIOX-PC) e controle (TEST-yolk buffer) para receberem os meios de criopreservação. A avaliação dos desfechos foi cega para atribuição de grupo, verificados antes do congelamento e após o descongelamento. Os dados foram comparados pelo teste t pareado pelo SAS versão 9.3; ?=0,05. RESULTADOS: A motilidade progressiva (p=0.83) e o índice de fragmentação do DNA (p=0.32) analisados nas amostras de sêmen congeladas com o meio A (ANTIOXPL) não apresentaram diferença significativa em relação às que foram congeladas com o meio B (TEST-yolk buffer). A concentração (p=0.02), a concentração total (p=0.02), o percentual de espermatozoides I (p<0.01) e a vitalidade (p<0.01) foram superiores nas amostras congeladas com o meio B (TEST-yolk buffer). A motilidade não progressiva (p<0.01) e a motilidade total (p<0.01) foram superiores nas amostras congeladas com o meio A (ANTIOX-PC). E a morfologia (p=0.07) não apresentou diferença significativa entre os meios de criopreservação. CONCLUSÕES: Em relação aos desfechos primários analisados, motilidade progressiva dos espermatozoides e índice de fragmentação do DNA espermático, a nova formulação proposta neste projeto de pesquisa, ANTIOX-PC, mostrou-se não inferior ao meio convencional, TEST-yolk buffer. / OBJECTIVES: To evaluate the efficacy of a synthetic cryopreservation medium for human semen containing phospholipids and antioxidants (ANTIOX-PC, Invitra / Supera Parque de Inovação e Tecnologia de Ribeirão Preto) compared to conventional egg yolk medium (TEST-yolk buffer, Irvine Scientific), measured by the in vitro parameters of progressive sperm motility and sperm DNA fragmentation index. METHODS: Non-inferiority clinical trial. 63 men (July 2015 to October 2016), aged 18 to 50 years, seminal sample with volume >= 1,5 mL, spermatozoa >= 15 x 106/mL and progressive motility >= 32% were recruited. The semen was divided into two aliquots with equal volumes, randomly randomized in the study (ANTIOX-PC) and control (TEST-yolk buffer) groups to receive cryopreservation media. The evaluation of the outcomes was blind to group assignment, verified before freezing and after thawing. The data were compared by the t-test paired by SAS version 9.3; ? = 0.05. RESULTS: Progressive motility (p=0.83) and DNA fragmentation index (p=0.32) analyzed in the semen samples frozen with medium A (ANTIOX-PL) showed no significant difference in relation to those frozen with the medium B (TEST-yolk buffer). The concentration (p=0.02), the total concentration (p=0.02), the percentage of immobile spermatozoa (p<0.01) and vitality (p<0.01) were higher in the samples frozen with medium B TEST-yolk buffer). Nonprogressive motility (p<0.01) and total motility (p <0.01) were higher in samples frozen with medium A (ANTIOX-PC). And the morphology (p=0.07) showed no significant difference between the cryopreservation media. CONCLUSIONS: The new formulation proposed in this research project, ANTIOX-PC, was not inferior to the conventional medium, TEST-yolk buffer, in relation to the primary endpoints analyzed, sperm motile spermatozoa and sperm DNA fragmentation index.