Les phéochromocytomes (PCC) et les paragangliomes (PGL) sont des tumeurs neuroendocrines rares, pour lesquelles le déterminisme génétique est très important, avec 16 gènes de prédisposition identifiés à ce jour. Au cours de ce travail de thèse, je me suis plus particulièrement intéressée aux conséquences des mutations du gène SDHB, car il avait été préalablement démontré qu’elles constituaient un facteur de risque de mauvais pronostic, associé à un phénotype métastatique et à une réduction de la survie des patients. Grâce à l’analyse du transcriptome d’une large cohorte de 188 échantillons de PCC/PGL humains, j’ai pu mettre en évidence que la voie de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) était spécifiquement activée dans les tumeurs métastatiques SDHB-dépendantes. En effet, j’ai observé, dans ce sous-groupe de tumeurs, une surexpression de facteurs de transcription et de régulateurs précoces de l’EMT, comme TWIST1, TFC3, ou LOXL2 ; une perte d’expression de marqueurs de jonctions cellulaires, comme CDH2 et KRT19 ; ou encore une induction de gènes codant pour des enzymes pro-invasives, comme MMP1 et MMP2. Dans ces tumeurs, j’ai par ailleurs validé l’induction transcriptionnelle de l’EMT en mettant en évidence la rétention nucléaire de la protéine SNAIL (un facteur de transcription clé de l’EMT) sur des coupes de tissus. Dans cette même cohorte, l’analyse des données de méthylation globale de l’ADN nous a permis d’observer un phénotype hyperméthylateur dans les tumeurs SDHx, qui est expliqué par une inhibition de déméthylases de l’ADN et des histones par le succinate, qui s’accumule dans ces tumeurs où la succinate déshydrogénase est inactivée. Nous avons ainsi pu démontrer que le succinate est un oncométabolite qui induit des modifications épigénétiques impliquées dans l’extinction de nombreux gènes, et en particulier des gènes associés à l’EMT, comme le gène KRT19 (l’un des plus hyperméthylés dans les tumeurs SDHB-malignes, comparativement aux autres). J’ai ensuite caractérisé le premier modèle cellulaire de PCC/PGL porteur d’une inactivation complète du gène Sdhb, dans lequel j’ai confirmé l’activation de l’EMT, au niveau transcriptionnel et au niveau protéique. La caractérisation fonctionnelle de ces cellules m’a ensuite permis de mettre en évidence des propriétés migratoires, invasives, et adhésives spécifiques des cellules chromaffines Sdhb -/-. J’ai par la suite focalisé mon étude sur le gène Krt19, qui code pour une protéine du cytosquelette, la kératine 19 et qui est éteint dans les tumeurs et dans les cellules Sdhb -/-. La réintroduction de ce gène dans les cellules Sdhb -/- et son inhibition dans les cellules sauvages m’ont permis de conclure à l’implication de la kératine 19 dans les processus d’adhésion, de migration et d’invasion. Cependant je n’ai pas pu expliquer l’ensemble du phénotype par la seule modulation de ce gène, ce qui démontre l’implication d’autres acteurs dans la mise en place du phénotype invasif décrit. Mes travaux de thèse ont ainsi permis de démontrer que l’activation de l’EMT est responsable du caractère métastatique et invasif observé dans les tumeurs porteuses d'une mutation sur le gène SDHB et que cette activation est notamment secondaire aux modifications épigénétiques induites par l’inactivation de la succinate déshydrogénase. / Pheochromocytomas (PCC) and paragangliomas (PGL) are rare neuroendocrine tumors for which there is a major impact of genetic determinism with 16 identified predisposition genes to date. During this PhD training, I was particularly interested in the consequences of SDHB gene mutations because it was previously demonstrated that they constitute a high risk factor of poor prognosis, associated with metastatic phenotype and reduced survival. During my thesis, thanks to the analysis of transcriptomic data of a large cohort of 188 human PCC/PGL samples, I identified epithelial to mesenchymal transition (EMT) as activated in SDHB-metastatic tumors. Indeed, I observed a transcriptional induction of TWIST1, TCF3 and LOXL2, which are transcription factors or early regulators of EMT; a loss of expression of cellular junction components such as CDH2 and KRT19; and an up regulation of genes encoding pro-invasive proteases, such as MMP1 and MMP2. In these tumors, I validated the transcriptional induction of EMT by showing a nuclear retention of SNAIL protein, the master EMT transcription factor. In the same cohort, global DNA methylation data allowed us to describe a hypermethylator phenotype in SDHx related tumors, explained by the inhibition of DNA and histones déméthylases by succinate, which accumulates massively in cells inactivated for succinate dehydrogenase. We thus demonstrated that succinate is an oncometabolite responsible for epigenetic modifications implicated in gene extinction, including EMT-related genes such as KRT19 (one of the most hypermethylated genes in SDHB-metastatic samples). Following these observations, I characterized the first PCC/PGL cellular model displaying a complete Sdhb inactivation, in which I confirmed EMT activation, at transcriptional and protein levels. Functional characterization of these cells allowed me to show Sdhb-specific migratory, invasive and adhesive properties. I thus focused my study on Krt19, which encodes keratin 19, a cytoskeleton protein, lost in Sdhb -/- cells and in human SDHB-related tumors. Krt19 rescue in Sdhb -/- cells or Krt19 inhibition in wild-type cells allowed me to conclude that keratin 19 is implicated in adhesion, migration and invasion. However I was not able to explain the whole phenotype observed, demonstrating the implication of other actors in the establishment of the invasive phenotype. The main result of my PhD work is the discovery that EMT is a molecular pathway responsible for the metastatic and invasive phenotype observed in SDHB-mutated tumors as a result of epigenetic alterations due to succinate dehydrogenase inactivation.

This work summarizes the results of a research inquiring into relatively rare neuroendocrine tumors - pheochromocytomas and paragangliomas (PHEO/PGL) These tumors may arise on a hereditary genetic predisposition basis. On that account we primarily focused on a genetic examination of patients with PHEO/PGL. Methods for diagnostics of changes in SDHD, SDHB and RET genes were implemented. The number of examined genes has been (and is still being) extended. Currently we are investigating these genes: ATRX, BRAF, CDH1, CDKN2A, CDKN2B, FGFR1, FH, FHIT, GNAS, HIF2A (EPAS1), H-RAS, IDH1, IDH2, KIF1Bß, KMT2D, K-RAS, MAML3, MAX, MDH2, MET, NF1, NGFR, N-RAS, PHD2/EGLN1, RET, SDHA, SDHAF2, SDHB, SDHC, SDHD, TERT, TMEM 127, TP53 and VHL, using next generation sequencing. The number of variations of the above mentioned genes is different (23%) in Czech patients with PHEO/PGL in comparison with some foreign studies (27%, 40%). This may be caused by geographical influences or selection of patients. PHEO/PGL occur mainly (75%) in a benign form. A malignant form may be indicated by the presence of chromaffin tissue in locations where these tumors do not usually occur - liver, lungs, bones. In our study we focused on characteristics indicating the malignancy, for example, the lower age of patients with the first manifestation...

Les phéochromocytomes et les paragangliomes (PCC/PGL) sont des tumeurs neuroendocrines rares qui se développent aux dépens de la médullosurrénale et des paraganglions sympathiques et parasympathiques. Près de 40% des patients ont une prédisposition génétique, et, à ce jour 13 gènes de prédisposition ont été identifiés. Les mutations du gène SDHB sont un facteur de risque de malignité et de mauvais pronostic qui conduisent à une perte de fonction de la succinate déshydrogénase (SDH), enzyme du complexe mitochondrial II. Il en résulte une accumulation intracellulaire de succinate responsable du phénomène dit de « pseudohypoxie » qui stimule la production de VEGF et donc l’angiogenèse, ainsi que l’expression du transporteur membranaire du glucose GLUT-1. Le surrisque de malignité liée à SDHB et l’absence de traitement curatif des formes métastatiques de PCC/PGL justifient l’élaboration d’un modèle murin permettant de mettre en place des essais précliniques. L’obtention d’un modèle murin prédisposé au PCC/PGL par mutation du gène Sdhb s’étant révélée infructueuse, notre équipe a finalement généré des cellules chromaffines Sdhb-/- immortalisées (imCC Sdhb-/-) dont l’implantation dans le coussinet adipeux sous-cutané (Fat-pad) de souris nudes NMRI a permis l’établissement du premier modèle de tumeurs porteuses d’une inactivation complète du gène Sdhb. La caractérisation phénotypique du modèle a été réalisée par imagerie multimodalité in vivo, comparativement à un groupe contrôle de souris ayant reçu des imCC non mutées (WT). L’angiogenèse tumorale évaluée par imagerie optique retrouve une expression des intégrines αvβ3 plus marquée dans le groupe Sdhb-/- avec une rétention du traceur prolongée 12 h après injection. L’IRM dynamique de contraste (IRM-DCE), montre un rehaussement tumoral global nettement plus important dans le modèle Sdhb-/-, que le post-traitement par le logiciel PhysioD3D permet d’attribuer à une augmentation du volume capillaire intratumoral. Sur le plan métabolique, la consommation globale de glucose mesurée par TEP au 18FDG est également plus marquée dans les tumeurs Sdhb-/-. Enfin, la spectroscopie par résonance magnétique (1H-MRS) a mis en évidence une accumulation de succinate dans les tumeurs Sdhb-/-, non retrouvée dans les tumeurs WT. Ce résultat a été confirmé par spectrométrie de masse et cette technique innovante de détection du succinate in vivo a été transférée avec succès en clinique pour l’exploration des patients porteurs de PCC/PGL. En conclusion, l’imagerie in vivo a permis de distinguer le phénotype des tumeurs Sdhb-/- de celui des WT, avec une néoangiogenèse, une microcirculation et un métabolisme glucidique augmentés. Ces résultats permettent de proposer des études précliniques de réponse précoce aux traitements. La détection de l’accumulation de succinate par 1H-MRS ouvre la possibilité d’un diagnostic « métabolique » préopératoire pour détecter les patients de mauvais pronostic. / Pheochromocytomas and paragangliomas (PCC/PGL) are rare neuroendocrine tumours that arise from chromaffin cells of the adrenal medulla, sympathetic and parasympathetic paraganglia respectively. Around 15% of PCC are malignant. SDHB mutations are associated with malignancy and poor prognosis. SDH deficiency leads to succinate accumulation that induces a cellular pseudohypoxic phenotype, promoting in particular VEGF and GLUT-1 expression and increasing angiogenesis and glucose metabolism. The high malignancy hazard associated with SDHB and the absence of curative treatment of metastatic forms of the disease make it essential to develop a mouse model for preclinical trials launching. The quest for a predisposed mouse model of Sdhb-deficient tumors being unsuccessful, Sdhb-/- and wild-type (WT) immortalized mouse chromaffin cells previously generated in the laboratory were propagated in the fat pad of NMRI nude mice, thereby providing the first pattern of Sdhb- deficient tumors. These mice were compared to a control group receiving non-mutated imCC (WT) and characterization was performed in vivo by multimodality imaging. Optical imaging assessing the tumor angiogenesis with Angiostamp®, an RGD fluorescent peptide, found an increased expression of integrins αvβ3 in the Sdhb-/- group 12 h after tracer injection. Dynamic contrast enhanced MRI (DCE-MRI) showed an overall tumor enhancement significantly higher in the Sdhb-/- model secondary to an increase of the tumor blood flow (F) and of the intratumoral capillary volume fraction (Vb) (compartmental analysis using PhysioD3D software). Metabolic imaging assessed by 18FDG-PET confirmed the expected high glucose consumption by Sdhb-/- tumors. Finally, magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) detected succinate accumulation in Sdhb-/- tumors and not in WT tumors. This result was confirmed by mass spectrometry and this innovative procedure for in vivo detection of succinate was translated into patients suffering from PCC/PGL. A succinate peak was specifically observed in SDHx-related PCC/PGL patients. In conclusion, these results show strong differences between Sdhb-/- and WT allografts and suggest that preclinical therapeutic studies could be implemented in this unique model of Sdhb-deficient tumour. Our noninvasive, highly sensitive and specific method allowing in vivo detection of succinate, the major biomarker of SDHx-mutated tumors was translated into clinical imaging.

Les phéochromocytomes (PCC) et les paragangliomes (PGL) sont des tumeurs neuroendocrines rares, pour lesquelles le déterminisme génétique est très important, avec 16 gènes de prédisposition identifiés à ce jour. Au cours de ce travail de thèse, je me suis plus particulièrement intéressée aux conséquences des mutations du gène SDHB, car il avait été préalablement démontré qu'elles constituaient un facteur de risque de mauvais pronostic, associé à un phénotype métastatique et à une réduction de la survie des patients. Grâce à l'analyse du transcriptome d'une large cohorte de 188 échantillons de PCC/PGL humains, j'ai pu mettre en évidence que la voie de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) était spécifiquement activée dans les tumeurs métastatiques SDHB-dépendantes. En effet, j'ai observé, dans ce sous-groupe de tumeurs, une surexpression de facteurs de transcription et de régulateurs précoces de l'EMT, comme TWIST1, TFC3, ou LOXL2 ; une perte d'expression de marqueurs de jonctions cellulaires, comme CDH2 et KRT19 ; ou encore une induction de gènes codant pour des enzymes pro-invasives, comme MMP1 et MMP2. Dans ces tumeurs, j'ai par ailleurs validé l'induction transcriptionnelle de l'EMT en mettant en évidence la rétention nucléaire de la protéine SNAIL (un facteur de transcription clé de l'EMT) sur des coupes de tissus. Dans cette même cohorte, l'analyse des données de méthylation globale de l'ADN nous a permis d'observer un phénotype hyperméthylateur dans les tumeurs SDHx, qui est expliqué par une inhibition de déméthylases de l'ADN et des histones par le succinate, qui s'accumule dans ces tumeurs où la succinate déshydrogénase est inactivée. Nous avons ainsi pu démontrer que le succinate est un oncométabolite qui induit des modifications épigénétiques impliquées dans l'extinction de nombreux gènes, et en particulier des gènes associés à l'EMT, comme le gène KRT19 (l'un des plus hyperméthylés dans les tumeurs SDHB-malignes, comparativement aux autres). J'ai ensuite caractérisé le premier modèle cellulaire de PCC/PGL porteur d'une inactivation complète du gène Sdhb, dans lequel j'ai confirmé l'activation de l'EMT, au niveau transcriptionnel et au niveau protéique. La caractérisation fonctionnelle de ces cellules m'a ensuite permis de mettre en évidence des propriétés migratoires, invasives, et adhésives spécifiques des cellules chromaffines Sdhb -/-. J'ai par la suite focalisé mon étude sur le gène Krt19, qui code pour une protéine du cytosquelette, la kératine 19 et qui est éteint dans les tumeurs et dans les cellules Sdhb -/-. La réintroduction de ce gène dans les cellules Sdhb -/- et son inhibition dans les cellules sauvages m'ont permis de conclure à l'implication de la kératine 19 dans les processus d'adhésion, de migration et d'invasion. Cependant je n'ai pas pu expliquer l'ensemble du phénotype par la seule modulation de ce gène, ce qui démontre l'implication d'autres acteurs dans la mise en place du phénotype invasif décrit. Mes travaux de thèse ont ainsi permis de démontrer que l'activation de l'EMT est responsable du caractère métastatique et invasif observé dans les tumeurs porteuses d'une mutation sur le gène SDHB et que cette activation est notamment secondaire aux modifications épigénétiques induites par l'inactivation de la succinate déshydrogénase.