Les phéochromocytomes (PCC) et les paragangliomes (PGL) sont des tumeurs neuroendocrines rares, pour lesquelles le déterminisme génétique est très important, avec 16 gènes de prédisposition identifiés à ce jour. Au cours de ce travail de thèse, je me suis plus particulièrement intéressée aux conséquences des mutations du gène SDHB, car il avait été préalablement démontré qu’elles constituaient un facteur de risque de mauvais pronostic, associé à un phénotype métastatique et à une réduction de la survie des patients. Grâce à l’analyse du transcriptome d’une large cohorte de 188 échantillons de PCC/PGL humains, j’ai pu mettre en évidence que la voie de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) était spécifiquement activée dans les tumeurs métastatiques SDHB-dépendantes. En effet, j’ai observé, dans ce sous-groupe de tumeurs, une surexpression de facteurs de transcription et de régulateurs précoces de l’EMT, comme TWIST1, TFC3, ou LOXL2 ; une perte d’expression de marqueurs de jonctions cellulaires, comme CDH2 et KRT19 ; ou encore une induction de gènes codant pour des enzymes pro-invasives, comme MMP1 et MMP2. Dans ces tumeurs, j’ai par ailleurs validé l’induction transcriptionnelle de l’EMT en mettant en évidence la rétention nucléaire de la protéine SNAIL (un facteur de transcription clé de l’EMT) sur des coupes de tissus. Dans cette même cohorte, l’analyse des données de méthylation globale de l’ADN nous a permis d’observer un phénotype hyperméthylateur dans les tumeurs SDHx, qui est expliqué par une inhibition de déméthylases de l’ADN et des histones par le succinate, qui s’accumule dans ces tumeurs où la succinate déshydrogénase est inactivée. Nous avons ainsi pu démontrer que le succinate est un oncométabolite qui induit des modifications épigénétiques impliquées dans l’extinction de nombreux gènes, et en particulier des gènes associés à l’EMT, comme le gène KRT19 (l’un des plus hyperméthylés dans les tumeurs SDHB-malignes, comparativement aux autres). J’ai ensuite caractérisé le premier modèle cellulaire de PCC/PGL porteur d’une inactivation complète du gène Sdhb, dans lequel j’ai confirmé l’activation de l’EMT, au niveau transcriptionnel et au niveau protéique. La caractérisation fonctionnelle de ces cellules m’a ensuite permis de mettre en évidence des propriétés migratoires, invasives, et adhésives spécifiques des cellules chromaffines Sdhb -/-. J’ai par la suite focalisé mon étude sur le gène Krt19, qui code pour une protéine du cytosquelette, la kératine 19 et qui est éteint dans les tumeurs et dans les cellules Sdhb -/-. La réintroduction de ce gène dans les cellules Sdhb -/- et son inhibition dans les cellules sauvages m’ont permis de conclure à l’implication de la kératine 19 dans les processus d’adhésion, de migration et d’invasion. Cependant je n’ai pas pu expliquer l’ensemble du phénotype par la seule modulation de ce gène, ce qui démontre l’implication d’autres acteurs dans la mise en place du phénotype invasif décrit. Mes travaux de thèse ont ainsi permis de démontrer que l’activation de l’EMT est responsable du caractère métastatique et invasif observé dans les tumeurs porteuses d'une mutation sur le gène SDHB et que cette activation est notamment secondaire aux modifications épigénétiques induites par l’inactivation de la succinate déshydrogénase. / Pheochromocytomas (PCC) and paragangliomas (PGL) are rare neuroendocrine tumors for which there is a major impact of genetic determinism with 16 identified predisposition genes to date. During this PhD training, I was particularly interested in the consequences of SDHB gene mutations because it was previously demonstrated that they constitute a high risk factor of poor prognosis, associated with metastatic phenotype and reduced survival. During my thesis, thanks to the analysis of transcriptomic data of a large cohort of 188 human PCC/PGL samples, I identified epithelial to mesenchymal transition (EMT) as activated in SDHB-metastatic tumors. Indeed, I observed a transcriptional induction of TWIST1, TCF3 and LOXL2, which are transcription factors or early regulators of EMT; a loss of expression of cellular junction components such as CDH2 and KRT19; and an up regulation of genes encoding pro-invasive proteases, such as MMP1 and MMP2. In these tumors, I validated the transcriptional induction of EMT by showing a nuclear retention of SNAIL protein, the master EMT transcription factor. In the same cohort, global DNA methylation data allowed us to describe a hypermethylator phenotype in SDHx related tumors, explained by the inhibition of DNA and histones déméthylases by succinate, which accumulates massively in cells inactivated for succinate dehydrogenase. We thus demonstrated that succinate is an oncometabolite responsible for epigenetic modifications implicated in gene extinction, including EMT-related genes such as KRT19 (one of the most hypermethylated genes in SDHB-metastatic samples). Following these observations, I characterized the first PCC/PGL cellular model displaying a complete Sdhb inactivation, in which I confirmed EMT activation, at transcriptional and protein levels. Functional characterization of these cells allowed me to show Sdhb-specific migratory, invasive and adhesive properties. I thus focused my study on Krt19, which encodes keratin 19, a cytoskeleton protein, lost in Sdhb -/- cells and in human SDHB-related tumors. Krt19 rescue in Sdhb -/- cells or Krt19 inhibition in wild-type cells allowed me to conclude that keratin 19 is implicated in adhesion, migration and invasion. However I was not able to explain the whole phenotype observed, demonstrating the implication of other actors in the establishment of the invasive phenotype. The main result of my PhD work is the discovery that EMT is a molecular pathway responsible for the metastatic and invasive phenotype observed in SDHB-mutated tumors as a result of epigenetic alterations due to succinate dehydrogenase inactivation.

Les phéochromocytomes (PCC) et les paragangliomes (PGL) sont des tumeurs neuroendocrines rares, pour lesquelles le déterminisme génétique est très important, avec 16 gènes de prédisposition identifiés à ce jour. Au cours de ce travail de thèse, je me suis plus particulièrement intéressée aux conséquences des mutations du gène SDHB, car il avait été préalablement démontré qu'elles constituaient un facteur de risque de mauvais pronostic, associé à un phénotype métastatique et à une réduction de la survie des patients. Grâce à l'analyse du transcriptome d'une large cohorte de 188 échantillons de PCC/PGL humains, j'ai pu mettre en évidence que la voie de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) était spécifiquement activée dans les tumeurs métastatiques SDHB-dépendantes. En effet, j'ai observé, dans ce sous-groupe de tumeurs, une surexpression de facteurs de transcription et de régulateurs précoces de l'EMT, comme TWIST1, TFC3, ou LOXL2 ; une perte d'expression de marqueurs de jonctions cellulaires, comme CDH2 et KRT19 ; ou encore une induction de gènes codant pour des enzymes pro-invasives, comme MMP1 et MMP2. Dans ces tumeurs, j'ai par ailleurs validé l'induction transcriptionnelle de l'EMT en mettant en évidence la rétention nucléaire de la protéine SNAIL (un facteur de transcription clé de l'EMT) sur des coupes de tissus. Dans cette même cohorte, l'analyse des données de méthylation globale de l'ADN nous a permis d'observer un phénotype hyperméthylateur dans les tumeurs SDHx, qui est expliqué par une inhibition de déméthylases de l'ADN et des histones par le succinate, qui s'accumule dans ces tumeurs où la succinate déshydrogénase est inactivée. Nous avons ainsi pu démontrer que le succinate est un oncométabolite qui induit des modifications épigénétiques impliquées dans l'extinction de nombreux gènes, et en particulier des gènes associés à l'EMT, comme le gène KRT19 (l'un des plus hyperméthylés dans les tumeurs SDHB-malignes, comparativement aux autres). J'ai ensuite caractérisé le premier modèle cellulaire de PCC/PGL porteur d'une inactivation complète du gène Sdhb, dans lequel j'ai confirmé l'activation de l'EMT, au niveau transcriptionnel et au niveau protéique. La caractérisation fonctionnelle de ces cellules m'a ensuite permis de mettre en évidence des propriétés migratoires, invasives, et adhésives spécifiques des cellules chromaffines Sdhb -/-. J'ai par la suite focalisé mon étude sur le gène Krt19, qui code pour une protéine du cytosquelette, la kératine 19 et qui est éteint dans les tumeurs et dans les cellules Sdhb -/-. La réintroduction de ce gène dans les cellules Sdhb -/- et son inhibition dans les cellules sauvages m'ont permis de conclure à l'implication de la kératine 19 dans les processus d'adhésion, de migration et d'invasion. Cependant je n'ai pas pu expliquer l'ensemble du phénotype par la seule modulation de ce gène, ce qui démontre l'implication d'autres acteurs dans la mise en place du phénotype invasif décrit. Mes travaux de thèse ont ainsi permis de démontrer que l'activation de l'EMT est responsable du caractère métastatique et invasif observé dans les tumeurs porteuses d'une mutation sur le gène SDHB et que cette activation est notamment secondaire aux modifications épigénétiques induites par l'inactivation de la succinate déshydrogénase.

<p>DNA methylation is an epigenetic modification that is nearly ubiquitous. Eukaryotic DNA methylation contributes to the regulation of gene expression and maintaining genome integrity. In mammals, DNA methylation occurs primarily on the C5 carbon of cytosine in a CpG dinucleotide context and is catalyzed by the DNA methyltransferases, DNMT1, DNMT3A and DNMT3B. While <i>dnmt3a</i> and <i>dnmt3b</i> genes are highly homologous, the enzymes have distinct functions. Some previous reports suggested differences in the enzymatic behavior of DNMT3A and 3B, which could affect their biological roles. The goal of my thesis work was to characterize kinetics mechanisms of DNMT3A and 3B, and to identify the similarities and differences in their catalytic properties that contribute to their distinct biological functions. Given the sequence similarity between the enzymes, we asked whether DNMT3B was kinetically similar to DNMT3A. In a series of experiments designed to distinguish between various kinetics mechanisms, we reported that unlike DNMT3A, DNMT3B methylated tandem CpG on DNA in a processive manner. We also reported that the disruption of the R-D interface, critical for the cooperativity of DNMT3A, had no effect on DNMT3B activity, supporting the non-cooperative mechanism of this enzyme. </p> <p>DNMT3A is frequently mutated in numerous cancers. Acute Myeloid Leukemia (AML) is a malignancy of hematopoietic stem cells in which numerous patients exhibit a high frequency of the heterozygous somatic mutation Arg882His in DNMT3A. Through thorough consensus motif building, we discovered a strong similarity in CpG flanking sequence preference between DNMT3A Arg882His variant and DNMT3B enzyme. Moreover, we found that the variant enzyme has the same kinetics mechanism as DNMT3B, indicating a gain-of-function effect caused by the mutation. This change is significant because the variant enzyme can aberrantly methylate DNMT3B targets in AML cells and effect global gene expression. In particular, given that DNMT3B has been shown to have oncogenic properties, this suggests that the Arg882His variant can acquire similar oncogenic properties and drive AML development.</p> <p>Taken together, my thesis work provides novel insights into the relationship between the biochemical properties and the biological functions of DNMT3A and 3B. </p>