Although the etiology surrounding many autoimmune diseases remains unknown, the underlying characteristic of many of these diseases is a disruption in the balance of pro- and anti- inflammatory cytokines It is well established that the dysregulation of the IL-12 family of cytokines, an increase in IL-12/IL-23 and a decrease in IL-27 production has been implicated in these conditions. We used ELISA, RT-PCR, Immunofluorescence and Western immunoblotting in conjunction with pharmalogical inhibitors and siRNA to demonstrate the role of SHP-1/Src in the regulation of IL-12, IL-23, IL-27 and IL-10 in LPS-stimulated human THP-1 cells, monocytes and MDMs. My results show for the first time that Src kinase activity relies on SHP-1 activity, and together this complex functions in TLR4-mediated MyD88 and TRIF pathways. Furthermore Src exhibits a dual role as a positive regulator for anti-inflammatory IL-10/IL-27 and as a negative regulator of pro-inflammatory IL-12/IL-23 downstream of TLR4. Moreover, the involvement of PI3K and JNK MAPK, dependent on SHP-1/Src complex, in the regulation of IL-12 family and IL-10 downstream of TLR4 was shown.

Although the etiology surrounding many autoimmune diseases remains unknown, the underlying characteristic of many of these diseases is a disruption in the balance of pro- and anti- inflammatory cytokines It is well established that the dysregulation of the IL-12 family of cytokines, an increase in IL-12/IL-23 and a decrease in IL-27 production has been implicated in these conditions. We used ELISA, RT-PCR, Immunofluorescence and Western immunoblotting in conjunction with pharmalogical inhibitors and siRNA to demonstrate the role of SHP-1/Src in the regulation of IL-12, IL-23, IL-27 and IL-10 in LPS-stimulated human THP-1 cells, monocytes and MDMs. My results show for the first time that Src kinase activity relies on SHP-1 activity, and together this complex functions in TLR4-mediated MyD88 and TRIF pathways. Furthermore Src exhibits a dual role as a positive regulator for anti-inflammatory IL-10/IL-27 and as a negative regulator of pro-inflammatory IL-12/IL-23 downstream of TLR4. Moreover, the involvement of PI3K and JNK MAPK, dependent on SHP-1/Src complex, in the regulation of IL-12 family and IL-10 downstream of TLR4 was shown.

Résumé : Les patients diabétiques ont plus de risques d’être amputés d’une jambe en raison d’une plus faible néovascularisation suite à une ischémie. Nous avons montré une association entre une plus faible réponse angiogénique du VEGF chez les souris diabétiques (DM) et une augmentation de l’expression de SHP-1, pouvant être activée par les récepteurs (AT[indice inférieur 1]/AT[indice inférieur 2]). La délétion du récepteur AT[indice inférieur 2] chez des souris favorise l’angiogenèse dans le muscle ischémique, mais son rôle en condition diabétique demeure inconnu. Notre objectif est de vérifier si la délétion du récepteur AT[indice inférieur 2] chez des souris DM favorise l’angiogenèse suivant l’induction d’une ischémie. Des souris DM de type 1 déficientes (KO) ou non pour le récepteur AT[indice inférieur 2] ont été utilisées. L’ischémie a été induite par la ligature de l'artère fémorale. La perfusion sanguine a été mesurée pendant 2 ou 4 semaines avant la récolte des tissus. Les effets de l’ischémie sur l’expression des récepteurs AT[indice inférieur 1] et AT[indice inférieur 2], des phosphatases SHP-1, SHP-2 et PTP1B, ainsi que l’état de la voie de signalisation du VEGF ont été mesurés. Un essai phosphatase a aussi été effectué suite à l’immunoprécipitation de SHP-1 chez des BAECs stimulés au CGP42112A. Quatre semaines après la chirurgie, le flot sanguin dans le muscle ischémique des souris DM AT[indice inférieur 2]KO s’est rétabli plus rapidement (80%) comparativement à une récupération de 47% chez les souris DM contrôles. L’expression des facteurs pro-angiogéniques (HIF-1α et VEGF) était similaire dans tous les groupes après 2 semaines d’ischémie, mais diminuée chez les DM et retournait à un niveau basal chez les DM-AT[indice inférieur 2]KO après 4 semaines, suggérant un reperfusion plus rapide chez ces souris. La phosphorylation de Akt était aussi plus faible chez les souris DM contrôles mais était rétablie chez les souris AT[indice inférieur 2]KO après 4 semaines d’ischémie. L'expression de SHP-1 était doublée dans le muscle ischémique des souris DM, en comparaison aux souris non DM, un effet absent chez les souris DM AT[indice inférieur 2]KO. L’expression de SHP-2 et PTP1B ne variait pas chez les souris DM sauvages et AT[indice inférieur 2]KO. De plus, l’expression des récepteurs AT[indice inférieur 1] et AT[indice inférieur 2] est augmentée chez les souris DM sauvages en comparaison aux souris NDM. La stimulation du récepteur AT[indice inférieur 2] chez les BAECs a permis d’augmenter l’activité phosphatase de SHP-1. Nos résultats suggèrent que l’expression élevée d’AT[indice inférieur 2] chez les souris DM mène à la surexpression et/ou l’activation de SHP-1, inhibant le signal angiogénique issu du VEGF et empêchant la reperfusion sanguine suite à l’ischémie. / Abstract : Ischemia due to narrowing of femoral artery and distal vessels is a major cause of peripheral arterial disease and morbidity affecting patients with diabetes. We have previously reported that the inhibition of the angiogenic response to PDGF and VEGF in diabetic mice (DM) is associated with the increase expression of SHP-1, a protein that can be activated by the AT[subscript 2] receptor. It has been shown that the deletion of AT[subscript 2] receptor in mice promotes angiogenesis within the ischemic muscle, but its role in diabetic condition remains unknown. Our hypothesis is that AT[subscript 2] receptor induced SHP-1 which contributed to inhibition of pro-angiogenic factor actions in DM mice during ischemia. Non-DM and DM AT[subscript 2] null mice underwent femoral artery ligation. Blood perfusion was measured every week up to 4 weeks post-surgery. Expression of AT[subscript 1] and AT[subscript 2] receptors, SHP-1, SHP-2 and PTP1B, and VEGF pathway was evaluated. A phosphatase assay was executed to assess SHP-1 activity in bovine aortic endothelial cells (BAECs) following CGP42112A stimulation. Blood flow in the ischemic muscle of DM AT[subscript 2]KO mice recovered faster and up to 80% four weeks following the surgery, compared to a 47% recovery in DM mice. After four weeks, the expression of pro-angiogenic factors (HIF-1α and VEGF) was similar in each group after two weeks but diminished in the DM and remained at a basal state in the DM-AT[subscript 2]KO after four weeks suggesting a faster recovery process in these mice. Akt phosphorylation was also diminished in the DM mice but restored in DM AT[subscript 2]KO after four weeks of ischemia. SHP-1 expression was two times more elevated in DM compared to NDM mice, an effect that was not seen in AT[subscript 2]KO mice. SHP-2 and PTP1B expression did not varied in DM wildtype and AT[subscript 2]KO mice. Also, expression of AT[subscript 1] and AT[subscript 2] receptor was upregulated by diabetes in wildtype mice. Stimulation of AT[subscript 2] receptor in BAECs caused increased SHP-1 activity. Our results suggest that elevated expression of the AT[subscript 2] receptor in DM mice lead to up-regulation/activation of SHP-1, inhibiting the VEGF angiogenic signal causing diminished blood flow reperfusion following ischemia.

The spatio-temporal organization and dynamic behavior of microtubules accurately react to cellular needs during intracellular transport, signal transduction, growth, division, and differentiation. The cell generates centrosomal microtubules de novo with the help of γ-tubulin complexes (γTuRCs). The post-translational modifications fine-tune microtubule nucleation by targeting the proteins, interacting with γTuRCs. However, the exact signaling pathways, regulating centrosomal microtubule nucleation, remain mostly unknown. In the presented thesis, we functionally characterized protein tyrosine phosphatase SHP-1 and E3 UFM-protein ligase 1 (UFL1) with its interacting protein CDK5RAP3 (C53) in the regulation of centrosomal microtubule nucleation. We also elucidated the role of actin regulatory protein profilin 1 in this process. We found that SHP-1 formed complexes with γTuRC proteins and negatively regulated microtubule nucleation by modulating the amount of γ-tubulin/γTuRC at the centrosomes in bone marrow-derived mast cells (BMMCs). We suggested a novel mechanism with centrosomal tyrosine-phosphorylated Syk kinase, targeted by SHP-1 during Ag-induced BMMCs activation, regulating microtubules. We showed for the first time that UFL1/C53 protein complex is involved in the regulation of microtubule...

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Résumé : Les podocytes, cellules épithéliales rénales, sont nécessaires au maintien de la structure et de la fonction de filtration des glomérules rénaux. La dédifférenciation et l’apoptose des podocytes sont des évènements précoces de la néphropathie diabétique. Des études ont rapporté que l’insuline est nécessaire à la survie des podocytes puisque la délétion du récepteur à l’insuline dans les podocytes de souris entraîne une pathologie glomérulaire semblable à la néphropathie. D’autres études ont montré que la protéine tyrosine phosphatase Src homology-2 domain-containing phosphatase-1 (SHP-1) inhibe les voies de signalisation de l’insuline au niveau du foie et du muscle en déphosphorylant la sous-unité bêta du récepteur à l’insuline (IRβ) et la kinase Phosphatidylinositide 3-kinase (PI3K). Il a récemment été démontré que l’expression de SHP-1 est élevée dans les cortex rénaux de souris diabétiques. Nous avons donc émis l’hypothèse que l’expression de SHP-1 induite par l’hyperglycémie altère les actions de l’insuline dans les podocytes. Nous avons premièrement utilisé un modèle in vivo de souris diabétiques de type 1 (Ins2+/C96Y; Akita). Comparées aux souris contrôles (Ins2+/+), les souris Akita présentaient une apoptose élevée des podocytes ainsi qu’une perte des pédicelles. La phosphorylation de la protéine kinase B (Akt) et de Extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2), suite à une injection systémique d’insuline, était également significativement diminuée dans les cortex rénaux des souris Akita. Cette diminution correspondant à une résistance à l’insuline corrélait avec une augmentation de deux fois de l’expression de SHP-1 dans les glomérules. Nous avons ensuite utilisé une lignée immortalisée de podocytes murins en culture et avons observé que l’exposition à des concentrations élevées de glucose (HG; 25 mM) pendant 96 h, entraînait l’augmentation de l’expression de marqueurs apoptotiques et de l’activité enzymatique de caspase-3/7 en comparaison aux concentrations normales de glucose (NG; 5,6 mM). L’exposition en HG a augmenté l’expression de l’ARNm et protéique de SHP-1, en plus de réduire la signalisation de l’insuline dans les podocytes. La surexpression de la forme dominante-négative de SHP-1 dans les podocytes a permis de renverser les effets de HG et de restaurer les actions de l’insuline. Finalement, l’augmentation de l’expression de SHP-1, tant in vivo qu’in vitro, a été directement corrélée à son association avec IRβ et à la diminution de la phosphorylation de IRβ, Akt et ERK1/2 suite à une stimulation à l’insuline. En conclusion, nous avons montré que l’expression élevée de SHP-1 dans les glomérules cause une résistance à l’insuline et la mort des podocytes contribuant ainsi à la néphropathie diabétique. // Abstract : Podocytes are epithelial renal cells required to preserve glomerular structure and filtration. Their dedifferentiation and apoptosis are early events of diabetic nephropathy progression. Previous studies have shown that insulin action is critical for podocyte survival since deletion of its receptor lead to a glomerular pathology similar to nephropathy. It has also been demonstrated that Src homology-2 domain-containing phosphatase-1 (SHP-1), a protein tyrosine phosphatase, inhibits insulin signaling pathway in liver and muscle by dephosphorylating tyrosine residues on insulin receptor beta-subunit (IRβ) and the Phosphatidylinositide 3-kinase (PI3K). A recent study concluded that SHP-1 is elevated in kidney cortex of type 1 diabetic mice. We hypothesized that hyperglycemia-induced SHP-1 expression may affect insulin actions in podocytes. To confirm this hypothesis, we used type 1 diabetic Akita mice (Ins2+/C96Y). Compared to control littermate mice (Ins2+/+), Akita mice developed elevated podocyte foot process effacement and podocyte apoptosis. In contrast to control mice, insulin-stimulated protein kinase B (Akt) and extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) phosphorylation was remarkably reduced in renal podocytes of Akita mice. This phosphorylation diminution associated to a renal insulin resistance was correlated with a two-fold increase of SHP-1 expression in the glomeruli. We then used cultured murine podocytes cell line to confirm our in vivo results. Podocytes exposed to high glucose concentration (HG; 25 mM) for 96 h exhibited high levels of apoptotic markers and caspase-3/7 enzymatic activity as compared to normal glucose concentration (NG; 5,6 mM). HG exposure raised mRNA and protein levels of SHP-1 and reduced the insulin-signaling pathway in podocytes. Overexpression of dominant-negative SHP-1 in podocytes prevented HG effects and restored insulin actions. Finally, elevated SHP-1 expression induced by high glucose levels was directly correlated to an increased association with insulin receptor-β subunit (IRβ) in vitro and in vivo. This association is therefore leading to the reduction of both IRβ phosphorylation and insulin-stimulated Akt and ERK phosphorylation. In conclusion, our results showed that high levels of SHP-1 in glomeruli cause insulin resistance and podocyte loss, thereby contributing to diabetic nephropathy.

8 1 ABSTRACT (EN) This thesis is focused mainly on understanding mechanisms of regulatory roles of C-terminal Src kinase (CSK) and phosphoprotein associated with glycosphingolipid- enriched microdomains (PAG) in the high-affinity IgE receptor (FcɛRI)-mediated signaling of murine mast cells. FcɛRI activation is initiated by aggregation of the receptor by complexes of multivalent antigen with IgE, followed by activation and enhanced activities of protein tyrosine kinases, phosphatases, adaptor proteins and number of other signal transduction molecules. The signaling events result in mast cell degranulation and release of variety of proinflammatory mediators, responsible for initiation of allergy and other inflammatory diseases. Understanding the function of key regulatory molecules controlling FcεRI-mediated mast cell activation, degranulation, and cytokines production could have therapeutic impact. CSK is a major negative regulator of Src family tyrosine kinases (SFKs) that play a critical role in various immunoreceptor signaling events. However, its function in mast cell activation has not been completely understood. Because of its cytoplasmic localization, CSK was assumed to be brought to the vicinity of the plasma membrane- bound SFKs via binding to membrane-bound adaptors and PAG was a major candidate....

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Résumé : Bien que l’hypoxie soit un puissant inducteur de l’angiogenèse, l’activation des facteurs de croissance est perturbée en hyperglycémie au niveau du pied et du cœur. Cette perturbation entraîne la perte de prolifération et de migration chez les cellules endothéliales, musculaires lisses vasculaires et péricytes empêchant la formation de nouveaux vaisseaux qui mènera à l’amputation des membres inférieurs chez les patients diabétiques. Une étude a démontré qu’une augmentation de la protéine tyrosine phosphatase Src homology-2 domain-containing phosphatase-1 (SHP-1) en condition hyperglycémique chez les péricytes entraînait l’inhibition de la signalisation du PDGF-BB, ce qui résultait en le développement d’une rétinopathie diabétique. Nous avons alors soulevé l’hypothèse que l’expression de SHP-1 dans les cellules musculaires lisses vasculaires affecte la prolifération et la migration cellulaire par l’inhibition de la signalisation de l’insuline et du PDGF-BB en condition diabétique. Nos expérimentations ont été effectuées principalement à l’aide d’une culture primaire de cellules musculaires lisses primaires provenant d’aortes bovines. Comparativement aux concentrations normales de glucose (NG : 5,6 mM), l’exposition à des concentrations élevées de glucose (HG : 25 mM) pendant 48 h a résulté en l’inhibition de la prolifération cellulaire par l’insuline et le PDGF-BB autant en normoxie (20% O2) qu’en hypoxie (24 dernières heures à 1% O2). Lors des essais de migration cellulaire, aucun effet de l’insuline n’a été observé alors que la migration par le PDGF-BB fut inhibée en HG autant en normoxie qu’en hypoxie. L’exposition en HG à mener à l’inhibition de la signalisation de la voie PI3K/Akt de l’insuline et du PDGF-BB en hypoxie. Aucune variation de l’expression de SHP-1 n’a été observée mais son activité phosphatase en hypoxie était fortement inhibée en NG contrairement en HG où on observait une augmentation de cette activité. Finalement, une association a été constatée entre SHP-1 et la sous-unité bêta du récepteur au PDGF. En conclusion, nous avons démontré que l’augmentation de l’activité phosphatase de SHP-1 en hypoxie cause l’inhibition des voies de l’insuline et du PDGF-BB réduisant les processus angiogéniques des cellules musculaires lisses vasculaires dans la maladie des artères périphériques. / Abstract : Even though hypoxia is a strong angiogenic inducer, pro-angiogenic factor signaling pathways in peripheral limb and heart are altered by hyperglycemia. This disruption leads to loss of endothelial cells, vascular smooth muscle cells and pericytes proliferation and migration preventing new blood vessel formation which results in amputation of lower extremities in diabetic patients. A study has shown that increase expression of the protein tyrosine phosphatase Src homology-2 domain-containing phosphatase-1 (SHP-1) in hyperglycemic condition in pericytes caused PDGF-BB signaling inhibition resulting in the development of diabetic retinopathy. Our hypothesis is that SHP-1 expression in vascular smooth muscle cells inhibits cell proliferation and migration induced by insulin and PDGF-BB in diabetic condition. Our experiments were performed using primary culture of vascular smooth muscle cells (SMC) from bovine aortas. As compared to normal glucose concentrations (NG:5,6 mM), high glucose level (HG: 25 mM) exposure for 48h inhibited SMC proliferation induced by insulin and PDGF-BB in both normoxia (20% O2) or hypoxia (1% O2 for the last 24h). During cell migration assays, no effect of insulin was observed while PDGF-BB action of SMC migration was reduced in HG in both normal and low oxygen concentrations. HG exposure lead to inhibition of insulin- and PDGF-BB-stimulated PI3K/Akt signaling pathway in hypoxia. No variation of SHP-1 expression was observed in HG condition. However, SHP-1 phosphatase activity was elevated in HG condition during hypoxia as compared to NG concentrations. Finally, our data showed an association between SHP-1 and the PDGF receptor beta subunit. In conclusion, our results demonstrated that the increase of SHP-1 phosphatase activity in hyperglycemia and hypoxia environment caused inhibition of insulin and PDGF-BB signaling pathways reducing angiogenic processes in vascular smooth muscle cells contributing to peripheral arterial disease in diabetes.