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No / Summary. Background: Endothelial nitric oxide synthase (eNOS) activity in endothelial cells is regulated by post-translational phosphorylation of critical serine, threonine and tyrosine residues in response to a variety of stimuli. However, the post-translational regulation of eNOS in platelets is poorly defined. Objectives: We investigated the role of tyrosine phosphorylation in the regulation of platelet eNOS activity. Methods: Tyrosine phosphorylation of eNOS and interaction with the tyrosine phosphatase SHP-1 were investigated by coimmunoprecipitation and immunoblotting. An in vitro immunoassay was used to determine eNOS activity together with the contribution of protein tyrosine phosphorylation. Results: We found platelet eNOS was tyrosine phosphorylated under basal conditions. Thrombin induced a dose- and time-dependent increase in eNOS activity without altering overall level of tyrosine phosphorylation, although we did observe evidence of minor tyrosine dephosphorylation. In vitro tyrosine dephosphorylation of platelet eNOS using a recombinant protein tyrosine phosphatase enhanced thrombin-induced activity compared to thrombin alone, but had no effect on endothelial eNOS activity either at basal or after stimulation with bradykinin. Having shown that dephosphorylation could modulate platelet eNOS activity we examined the role of potential protein phosphatases important for platelet eNOS activity. We found SHP-1 protein tyrosine phosphatase, co-associated with platelet eNOS in resting platelets, but does not associate with eNOS in endothelial cells. Stimulation of platelets with thrombin increased SHP-1 association with eNOS, while inhibition of SHP-1 abolished the ability of thrombin to induce elevated eNOS activity. Conclusions: Our data suggest a novel role for tyrosine dephosphorylation in platelet eNOS activation, which may be mediated by SHP-1.

Résumé : La néphropathie diabétique (ND) est la principale cause d’insuffisance rénale de stade terminal en Amérique du Nord. Les podocytes, cellules épithéliales hautement spécialisées du glomérule, supportent et maintiennent les mécanismes de filtration glomérulaire. Des biopsies de reins de patients diabétiques ont montré que le nombre de podocytes est significativement réduit chez les patients avec un diabète récent. Néphrine est une protéine transmembranaire qui a été démontrée comme ayant un rôle majeur dans le maintien de l’intégrité de ces cellules. Une diminution de l’expression de néphrine est observée chez les personnes atteintes de la ND. Des études ont démontré que la phosphorylation en tyrosine de néphrine était impliquée dans la régulation de l’inhibition des voies de l’apoptose et le remodelage du cytosquelette d’actine. Notre laboratoire a publié que l’expression de la tyrosine phosphatase SHP-1 était augmentée dans les podocytes exposés à des concentrations élevées de glucose (HG). Les résidus tyrosines de néphrine sont contenus dans des séquences pouvant être reconnues par SHP-1. Notre hypothèse est que SHP-1 interagit avec néphrine, et que l’augmentation de l’expression de SHP-1 en condition d’hyperglycémie et de diabète viendrait déréguler les voies de signalisation de néphrine, contribuant aux dommages des podocytes dans la maladie. Des coimmunoprécipitations dans des podocytes montrent une interaction entre SHP-1 et néphrine, qui est augmentée en condition HG. Cette augmentation en HG était associée à une baisse des niveaux de phosphorylation de néphrine. La surexpression de la forme inactive de SHP-1 dans les podocyte rétablie les niveaux de phosphorylation de néphrine en condition HG. Dans un modèle de surexpression avec des cellules HEK, la surexpression de SHP-1 diminue les niveaux de phosphorylation des tyrosines 1176/1193 et 1217, qui sont associées au remodelage de l’actine. Des coimmunoprécipitations avec des mutants de néphrine montrent que les tyrosines 1114 et 1138 sont essentielles pour l’interaction de SHP-1 avec néphrine. Dans un modèle murin de diabète de type 1, une diminution de l’expression et de la phosphorylation de néphrine sont observée comparativement aux souris de type sauvage. Ces diminutions sont associées avec une augmentation de l’expression de SHP-1. En conclusion, l’augmentation de l’expression de SHP-1 en condition d’hyperglycémie réduit les niveaux de phosphorylation en tyrosine de néphrine et vient potentiellement inhiber ses voies de signalisation dans le diabète, contribuant à la dysfonction podocytaire et à la néphropathie diabétique. / Abstract : Diabetic nephropathy (DN) is the leading cause of end-stage renal disease in North America. Podocytes are highly specialized epithelial cells involved in the glomerular filtration process. Morphometric observation from kidney biopsies of diabetic patients showed a significant reduction in the number of podocytes in patients with short duration of diabetes before the apparition of microalbuminuria. Nephrin, a transmembrane protein found in the slit diaphragm, has been found to play a key role in the integrity of the podocytes. Clinical observations indicated that nephrin expression was reduced in kidney biopsy of diabetes patients. Recent studies have shown that phosphorylation of tyrosine residues of nephrin participate in intracellular pathways regulating actin dynamics and podocyte survival. Our laboratory has recently published that the expression of the tyrosine phosphatase SHP-1 is elevated in podocytes exposed to high glucose concentrations (HG). Nephrin contains sequences that are known to be potential target for SHP-1. Our hypothesis is that SHP-1 can interact with nephrin, and the increase of SHP-1 expression in diabetic nephropathy deregulates nephrin-mediated pathways, contributing to podocyte’s damage in the disease. Coimmunoprecipitation experiments show an interaction between SHP-1 and nephrin which is increased in podocytes exposed to HG. Overexpression of the inactive form of SHP-1 in podocytes exposed to HG restores nephrin phosphorylation. In HEK cells, overexpression of SHP-1 reduces nephrin phosphorylation specifically on tyrosine 1176/1193 and 1217, which regulates actin dynamics. Coimmunoprecipitation experiments with nephrin mutants show that tyrosine 1114 and 1138 are essentials to the interaction between SHP-1 and nephrin. In a type 1 diabetic murine model, a reduction of the expression and phosphorylation levels of nephrin are observed. Both reductions are associated with an increase in SHP-1 expression. In conclusion, diabetes triggered SHP-1 expression in podocytes which reduces nephrin tyrosine phosphorylation and potentially inhibits nephrin signaling in diabetes, contributing to podocytes dysfunction in diabetic nephropathy.

SHP-1 is a protein tyrosine phosphatase that often targets the phosphatidylinositol 3'-kinase (PI3K)/Akt signalling pathway. PI3K/Akt signalling regulates cell growth and survival, proliferation and differentiation. Growth factor-stimulated PI3K phospholipid production at the plasma membrane helps to recruit 3'-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 (PDK1) and Akt, where PDK1 phosphorylates and activates the pro-survival kinase Akt.<p>Tyrosine phosphorylation of PDK1 may regulate its function and, perhaps more importantly, its nuclear localization. Yet, it is unclear how PDK1 is imported into the nucleus as it does not contain a nuclear localization signal (NLS), although it does contain a nuclear export signal (NES). Interestingly, several tyrosines in PDK1 are targets for Src kinase and are putative target motifs for SHP-1, which does have an NLS.<p>Hypothesis: SHP-1 and PDK1 form a tyrosine-dependent, nucleo-cytoplasmic shuttling complex. <p>Removal of serum from C6 glioma cell cultures induces a platelet-derived growth factor receptor (PDGFR)-sensitive redistribution of PI3K lipid kinase activity to the nucleus. PDK1 tyrosine phosphorylation and its association with SHP-1 are also increased, as is the accumulation of both SHP-1 and PDK1 in the nucleus. Site-directed mutagenesis of tyrosine residues in PDK1 reveals that tyrosine 9 (Tyr9) and Tyr376 are important for the interaction of PDK1 with SHP1, whereas Tyr333 and Tyr 373 are not. Using pharmacological and genetic manipulations, it was demonstrated that SHP-1 and PDK1 shuttle between the nucleus and cytoplasm, and that the C-terminal-expressed NLS of SHP-1 facilitates shuttling, while dephosphorylation of PDK1 Tyr9 and Tyr376 regulates the rate of PDK1 (and by virtue of association, SHP-1) export from the nucleus. The SHP-1/PDK1 complex, which is constitutive in most cell lines, is functionally relevant as indicated by its requirement for NGF-induced differentiation of preneuronal cells to a neuronal phenotype.

SHP-1 is a protein tyrosine phosphatase that often targets the phosphatidylinositol 3'-kinase (PI3K)/Akt signalling pathway. PI3K/Akt signalling regulates cell growth and survival, proliferation and differentiation. Growth factor-stimulated PI3K phospholipid production at the plasma membrane helps to recruit 3'-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 (PDK1) and Akt, where PDK1 phosphorylates and activates the pro-survival kinase Akt.<p>Tyrosine phosphorylation of PDK1 may regulate its function and, perhaps more importantly, its nuclear localization. Yet, it is unclear how PDK1 is imported into the nucleus as it does not contain a nuclear localization signal (NLS), although it does contain a nuclear export signal (NES). Interestingly, several tyrosines in PDK1 are targets for Src kinase and are putative target motifs for SHP-1, which does have an NLS.<p>Hypothesis: SHP-1 and PDK1 form a tyrosine-dependent, nucleo-cytoplasmic shuttling complex. <p>Removal of serum from C6 glioma cell cultures induces a platelet-derived growth factor receptor (PDGFR)-sensitive redistribution of PI3K lipid kinase activity to the nucleus. PDK1 tyrosine phosphorylation and its association with SHP-1 are also increased, as is the accumulation of both SHP-1 and PDK1 in the nucleus. Site-directed mutagenesis of tyrosine residues in PDK1 reveals that tyrosine 9 (Tyr9) and Tyr376 are important for the interaction of PDK1 with SHP1, whereas Tyr333 and Tyr 373 are not. Using pharmacological and genetic manipulations, it was demonstrated that SHP-1 and PDK1 shuttle between the nucleus and cytoplasm, and that the C-terminal-expressed NLS of SHP-1 facilitates shuttling, while dephosphorylation of PDK1 Tyr9 and Tyr376 regulates the rate of PDK1 (and by virtue of association, SHP-1) export from the nucleus. The SHP-1/PDK1 complex, which is constitutive in most cell lines, is functionally relevant as indicated by its requirement for NGF-induced differentiation of preneuronal cells to a neuronal phenotype.

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Résumé : La néphropathie diabétique (ND) est une complication microvasculaire du diabète évoluant ultimement en insuffisance rénale et l’hyperglycémie est connue comme étant l’un des facteurs de risques. De larges études cliniques, tel que le DCCT et l’UKPDS, ont montré que si le contrôle intensif de la glycémie se faisait de façon précoce, il serait possible de retarder le développement de la ND. Cependant, les résultats de l'EDIC montrent que si ce contrôle intensif se faisait plus tardivement, suite à une période d’hyperglycémie, il n’empêcherait plus sa progression. Les podocytes ont un rôle critique dans le maintien des fonctions rénales et leur apoptose corrèle de façon très spécifique avec la progression de la ND. Récemment, nous avons rapporté que SHP-1, une protéine tyrosine phosphatase, était augmentée en concentrations élevées de glucose (HG), menant à une inhibition des voies de signalisation de l'insuline. Notre hypothèse est que l’augmentation de l’expression de SHP-1 causée par l’hyperglycémie persiste même après réduction des niveaux de glucose, phénomène de mémoire hyperglycémique, causant une résistance à l'insuline, la mort des podocytes et une absence de réversibilité liée à la progression de ND. Les résultats in vivo montrent que la fonction et la pathologie rénale continuent de progresser et ce en dépit de la normalisation des niveaux de glucose avec implants d’insuline de 5 à 7 mois d’âge La progression de la pathologie corrèle avec le maintien de l’augmentation de l’expression de SHP-1, contribuant au maintien de l’inhibition des voies de l’insuline. En culture, des podocytes murins exposés en HG pendant 96 h et ensuite exposés en condition normale de glucose(NG) pour les dernières 24 h montrent une persistance de l’inhibition des voies de signalisation de l’insuline qui corrèle avec l’augmentation persistante de l’expression et l’activité phosphatase de SHP-1. L’activité des caspases 3/7 dans les podocytes est plus élevée lorsque ceux-ci sont exposés en HG qu’en NG. Le retour en NG pour les dernières 24 h n’a aucun effet bénéfique à réduire l’activité des caspases 3/7. Finalement, l’analyse épigénétique a été suggérée comme étant une explication du phénomène de mémoire hyperglycémique. La monométhylation de la lysine 4 de l’histone 3 (H3K4me1), un marqueur d’activation génique, est augmentée sur le promoteur de SHP-1 en HG et demeure élevée malgré le retour en NG pendant les dernières 24 h. En conclusion, l’hyperglycémie engendre une augmentation persistante de SHP-1 due possiblement à des modifications épigénétiques, causant le maintien de l’inhibition les voies de signalisation de l’insuline même après un retour à des niveaux normaux de glucose, contribuant à la progression de la ND. / Abstract : Diabetic nephropathy (DN) is the leading cause of end-stage renal disease. Renal podocytes apoptosis induced by hyperglycemia is an early event of DN. Clinical studies have shown that intensive blood glucose control reduced the development of DN but is not sufficient, if started late, to prevent its progression, introducing the concept of “hyperglycemic memory”. We have recently published that the tyrosine phosphatase SHP-1 is elevated in renal cortex of type 1 diabetic mice (Akita), contributing to insulin unresponsiveness and DN. We hypothesized that SHP-1 expression remains elevated regardless of systemic blood glucose normalization, and is responsible for hyperglycemic memory in podocytes leading to DN progression. In vivo contribution of SHP-1 in hyperglycemic memory was evaluated using Akita mice treated with insulin implants after 4 months of diabetes. Both urinary albuminuria and glomerular filtration rate were significantly increased in diabetic mice compared to non-diabetic mice and remained elevated despite normalization of blood glucose levels. Renal dysfunction was associated with a persistent increase of SHP-1 expression in renal cortex and inhibition of insulin action that were not normalized following insulin implants. Mouse podocytes were cultured in normal (5.6mM; NG), high glucose concentrations (25mM; HG) for 120 h or HG (96 h) followed by NG for an additional 24 h (HG+NG). We observed that Akt and ERK phosphorylation induced by insulin was inhibited in HG and were not restored despite returning glucose level to 5.6 mM after the HG period. This inhibition was associated with persistent increase of SHP-1 expression and phosphatase activity, leading to insulin signaling pathway inhibition. Moreover, caspase 3/7 activity in podocytes exposed to HG was higher than in podocytes cultured in NG and returning glucose concentrations to normal range for the last 24 h after the 96 h HG exposure had no effect on reducing caspase 3/7 activity. Epigenetic changes were studied to explain the hyperglycemic memory effect. On SHP-1 promoter, H3K4me1 levels, an activation mark, tended to be more elevated in podocytes exposed to HG and were maintained despite returning to NG levels after the HG conditions. In conclusion, hyperglycemia induces persistent and epigenetic changes of SHP-1 causing insulin unresponsiveness in the podocytes contributing to DN progression.

Il existe différents groupes de cellules lymphoïdes innées (ILC) qui ont été caractérisées en fonction des facteurs de transcriptions indispensables à leur différenciation et des cytokines qu’elles sécrètent. Les ILC1, dont font partie les cellules Natural Killer (NK), expriment T-bet et produisent de l’IFN-γ. Les ILC2 sont caractérisées par GATA-3 et sécrètent de l’IL-5 et de l’IL-13. Quant aux ILC3, elles ont été identifiées par leur sécrétion d’IL-17 et d’IL-22 ainsi que par l’expression de RORγt.Mon travail de thèse m’a amené à étudier différents aspects de la biologie des cellules NK et ILC3 : leur tolérance, leur homéostasie et leur plasticité.Les cellules NK jouent un rôle dans l’élimination de cellules cancéreuses et des cellules infectées par des bactéries et des virus. J’ai mis en évidence le rôle de la phosphatase SHP-1 (Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1) dans les mécanismes de tolérance et d’activation des cellules NK. J’ai également montré que la protéine anti-apoptotique Bcl2 (B-cell lymphoma 2) est importante pour l’homéostasie des cellules NK. Seules les cellules en cycle cellulaire peuvent compenser l’absence de Bcl2, notamment du fait de l’augmentation de l’expression d’une autre protéine anti-apoptotique, Mcl1 (Myeloid Cell Leukemia 1). Les ILC3 sont des cellules principalement localisées dans l’intestin et qui peuvent être classées en différents groupes en fonction des marqueurs qu’elles expriment. J’ai montré qu’il existe une plasticité entre les différentes populations d’ILC3, et que cette plasticité est régulée par des facteurs environnementaux tel que le TGF-β et le ligand de Notch, DL1. / There are three groups of innate lymphoid cells (ILC), defined notably by the transcriptions factors essential to their differentiation and their cytokines secretion. ILC1, including natural killer (NK) cells, express T-bet and secrete IFN-γ. ILC2 are characterized by GATA3 expression and the production of IL-5 and IL-13. ILC3 secrete IL-17 and IL-22 and express RORγt.My PhD work dealt with different aspects of NK cells and ILC3: their tolerance, homeostasis and plasticity.NK cell are involved in killing tumor cells and bacteria- or virus-infected cells. I found that the phosphatase SHP-1 (Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1) has a role in NK cell tolerance and activation.I also showed that the anti-apoptotic Bcl2 protein (B-cell lymphoma 2) is important for NK cell homeostasis. Only cycling NK cells could compensate the Bcl2 deficiency, due to the increase expression of another anti-apoptotic protein, Mcl1 (Myeloid Cell Leukemia 1).ILC3 are mainly located in the gut and are classified in different groups, depending on the markers that they expressed. I showed that there is plasticity between ILC3 populations and that this plasticity is regulated by environmental factors, including TGF-β and the Notch ligand, DL1.

Shp-1 (Src homology 2 domain-containing phosphatase 1) est une tyrosine phosphatase retrouvée principalement chez les cellules hématopoïétiques, mais également chez les cellules épithéliales. Bien que Shp-1 soit reconnue comme étant un régulateur négatif de plusieurs voies de signalisation intracellulaire chez les cellules hématopoïétiques, son rôle dans les cellules épithéliales a été jusqu’ici très peu étudié. Afin de mieux comprendre son rôle dans les cellules épithéliales intestinales, nous avons généré un modèle murin de délétion conditionnelle de Shp-1 spécifiquement dans l’épithélium intestinal (Shp-1CEI-KO). De manière intéressante, dès l’âge de 6 semaines, les souris expérimentales présentent une intestinalomégalie associée à une légère augmentation de la prolifération cryptale. La taille des cellules épithéliales est également augmentée, suggérant de l’hypertrophie cellulaire chez les souris invalidées pour Shp-1. Parallèlement, la voie de signalisation PI3K/Akt/mTor est activée dans l’épithélium des souris mutantes. Nous avons également noté une production accrue de cellules caliciformes et de leurs précurseures, les cellules intermédiaires, en absence de Shp-1. Par contre, la maturation des cellules de Paneth semble grandement compromise vu la baisse importante d’expression du lysozyme et des RegIIIβ et RegIIIγ, de même que la faible densité de leurs granules de sécrétion. La comparaison du phénotype intestinal des souris Shp-1CEI-KO avec celui des souris PtenCEI-KO suggère que l’hyperactivation de la voie PI3K/Akt/mTor est responsable en partie des altérations phénotypiques observées chez la souris invalidée pour Shp-1. En conclusion, nos résultats montrent que la tyrosine phosphatase Shp-1 est un régulateur important de l’homéostasie de l’épithélium intestinal en contrôlant notamment la croissance cellulaire et la différenciation des cellules de la lignée sécrétrice.