La voie Wnt est une voie de signalisation importante pour l’embryogenèse, la morphogenèse et l’homéostasie des tissus au stade adulte. Des mutations dans cette voie de signalisation sont souvent associées à une létalité embryonnaire ou à des pathologies sévères.Une caractéristique singulière de la signalisation Wnt est sa grande complexité génétique. Chez les vertébrés, ce sont 19 ligands Wnt différents qui peuvent potentiellement lier les 10 membres de la famille des récepteurs Frizzled (Fz). De plus, la liaison d’un ligand Wnt à un récepteur Fz peut conduire à l’activation d’au moins trois voies de transduction distinctes. Pourtant, l’interaction Wnt/Fz est incompatible avec une reconnaissance monospécifique étant donné que Wnt et Fz interagissent via des résidus conservés dans les deux familles. Les patrons d’expression des différents Wnt et des différents Fz sont complexes et souvent chevauchant. Malgré cela, la délétion sélective d’un Wnt peut conduire à des phénotypes spécifiques non-observés lors de la délétion d’un autre ligand Wnt co-exprimé. C’est notamment le cas des ligands Wnt7a et Wnt7b. Seules leurs expressions par les progéniteurs neuronaux permettent d’activer la voie de signalisation Wnt/β-caténine dans les cellules endothéliales malgré l’expression simultanée d’autres ligands Wnt. Dès lors, comment les cellules des vertébrés sont-elles capables de discriminer les différents ligands Wnt ?L’étude de l’activation des signalisations induites par les ligands Wnt7a et Wnt7b permet d’illustrer par quel mécanisme moléculaire des co-récepteurs, tels que Gpr124 et Reck, médient la reconnaissance spécifique d’un ligand Wnt et permettent la formation d’un signalosome spécifique. Reck est un récepteur spécifique des ligands Wnt7a et Wnt7b qui permet de les discriminer de tous les autres ligands Wnt. Il interagit avec ceux-ci via une région intrinsèquement désordonnée et divergente dans la famille Wnt appelée « le peptide linker ». Etant donné que cette région est exposée au solvant et qu’elle ne comprend pas les sites d’interaction avec le récepteur Fz, elle pourrait jouer un rôle critique dans la discrimination des différents ligands Wnt. Gpr124, quant à lui, interagit avec Reck via son domaine extracellulaire et permet la co-localisation de ce dernier et des récepteurs Fz dans le même signalosome. Pour ce faire, Gpr124 interagit avec la protéine adaptatrice Dvl via son domaine intracellulaire. Le recrutement membranaire et la polymérisation de Dvl permettent la formation d’une plateforme d’ancrage facilitant la formation du complexe Reck/Gpr124/Fz/Lrp5/6 qui active alors sélectivement la voie la signalisation Wnt/β-caténine en réponse aux ligands Wnt7a et Wnt7b. L’identification d’un tel mécanisme de décodage laisse supposer qu’il pourrait exister plusieurs modules de reconnaissance spécifique adaptés à d’autres ligands Wnt assurant ainsi un réglage précis de la signalisation Wnt en fonction du contexte moléculaire de la membrane plasmique. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les surrénales sont des glandes endocrines permettant la réponse au stress de l’organisme. Alors que la medulla produit des catécholamines, la corticosurrénale sécrète des minéralocorticoïdes au niveau de la zone glomérulée, et des glucocorticoïdes grâce aux cellules de la zone fasciculée. Ces hormones sont notamment impliquées dans l’homéostasie hydrominérale, la réponse immunitaire et la maturation pulmonaire au cours de la vie fœtale. Les insuffisances surrénaliennes peuvent donc être très délétère en absence de traitement. Pour maintenir l’intégrité tissulaire au cours de la vie et pour mieux répondre aux variations des besoins de l’organisme, le cortex surrénalien est en renouvellement cellulaire constant. Des expériences de lignage ont mis en évidence que ce renouvellement repose sur le recrutement de cellules progénitrices capsulaires et situées dans la partie externe du cortex. Lorsqu’ils sont mobilisés, ces progéniteurs se différencient en cellules de la zone glomérulée, qui vont alors migrer de façon centripète le long du cortex et se différencier en cellules de la zone fasciculée après une conversion de lignage, au cours de leur migration. Cette conversion de lignage est orchestrée via un équilibre entre l’activation des voies Wnt/β-caténine, imposant une identité glomérulée, et PKA, permettant une différenciation fasciculée. Les facteurs épigénétiques jouent de nombreux rôles essentiels, du développement embryonnaire jusqu’à la tumorigenèse, en passant par l’homéostasie des tissus. Nous avons montré que la méthyltransférase EZH2 était le facteur épigénétique le plus surexprimé dans les carcinomes corticosurrénaliens et que cette surexpression était associée à l’agressivité de ces cancers. EZH2 est la sous-unité catalytique du complexe multi-protéique PRC2 qui permet, entre autres, la répression de la transcription de ses gènes cibles en posant la marque H3K27me3. L’objectif de ma thèse a été d’identifier les potentiels rôles physiologiques de EZH2 dans la surrénale, qui n’avaient jusque là, jamais été recherchés.En développant un modèle murin d’invalidation génétique de Ezh2 dans le cortex surrénalien, dès l’émergence de l’ébauche surrénalienne au cours du développement embryonnaire, nous avons pu mettre en évidence une hypoplasie corticosurrénalienne, résultant d’une forte atrophie de la zone fasciculée, et associé à une insuffisance primaire en glucocorticoïdes. Nos analyses nous ont permis de démontrer le rôle original et inattendu de Ezh2 dans le contrôle de la voie de signalisation PKA, en réprimant l’expression d’inhibiteurs de cette voie comme les phosphodiestérases (PDE) et la sous-unité régulatrice Prkar1b. EZH2 régule ainsi la zonation fonctionnelle du cortex surrénalien via son activité histone méthyltransférase. A l’inverse, on n’observe pas d’altération marquée de la voie Wnt/β-caténine, suggérant que Ezh2 n’est pas essentiel au contrôle de cette voie dans la surrénale. Nous avons également pu mettre en évidence une dédifférenciation de cellules corticales qui retrouvent, suite à la perte de Ezh2, une identité progénitrice en exprimant des marqueurs adréno-gonadique tels que Gata4 et Wt1. Cette dédifférenciation est un phénomène naturel que l’on retrouve avec le vieillissement et qui pourrait être associée avec la diminution progressive de l’expression de Ezh2 dans les cellules stéroïdogènes. L’ensemble de ces résultats, met en évidence une nouvelle fonction de Ezh2 dans le contrôle de la voie de signalisation PKA et de l’homéostasie de la glande surrénale. / Adrenals are endocrine glands allowing the stress response of the organism. While the medulla produces catecholamines, the adrenal cortex secretes mineralocorticoids in the glomerular zone, and glucocorticoids through cells in the fasciculated zone. These hormones are notably involved in hydromineral homeostasis, the immune response and pulmonary maturation during fetal life. Adrenal insufficiency can therefore be very deleterious in the absence of treatment. To maintain tissue integrity over the course of life and to better respond to the changing needs of the body, the adrenal cortex is in constant cell renewal. Lineage experiments have shown that this renewal is based on the recruitment of capsular progenitor cells and progenitors located in the outer part of the cortex. When mobilized, these progenitors differentiate into cells of the glomerular zone, which then migrate centripetally along the cortex and differentiate into cells of the fasciculated zone after lineage conversion, during their migration. This lineage conversion is orchestrated via a balance between the activation of the Wnt/β-catenin pathway, imposing a glomerular identity, and PKA pathway, allowing fasciculated differentiation. Epigenetic factors play many important roles, from embryonic development to tumorigenesis, passing by tissue homeostasis. We have shown that methyltransferase EZH2 is the most overexpressed epigenetic factor in adrenocortical carcinomas and this overexpression is associated with cancer agressivity. EZH2 is the catalytic subunit of the multiprotein complex PRC2 that allow, among others things, the repression of the transcription of its target genes by posing the mark H3K27me3. The aim of my thesis was to indentify the putative physiological roles of EZH2 in the adrenal, never investigated yet.By developing a murine model of genetic invalidation of Ezh2 in the adrenal cortex, from the emergence of the adrenal anlagen during embryonic development, we have been able to demonstrate adrenocortical hypoplasia, resulting from a strong atrophy of the zona fasciculata, and associated with primary glucocorticoid insufficiency. Our analyses allowed us to demonstate the original and unexpected role of EZH2 in the controle of the PKA pathway, by repressing expression of this pathway inhibitors such as phosphodiesterases (PDE) and regulatory subunit Prkar1b. EZH2 thus regulate functionel zonation of adrenal cortex via its histone methyltransferase activity. On the contrary, we don’t observe marked alteration of the Wnt/β-catenin pathway, suggesting EZH2 is not essential for the control of this pathway in the adrenal. We could also show a dedifferenciation of cortical cells which, after the loss of Ezh2, exhibit progenitors identity by expressing adreno-gonadal marks as Gata4 and Wt1. This dedifferenciation is a natural phenomenon that appear with ageing and could be associated with processive decrease of Ezh2 expression in steroidogenic cells. All of these results, highlights a new function of Ezh2 in the control of the PKA signaling pathway and in the homeostasis of the adrenal gland.

Shp-1 (Src homology 2 domain-containing phosphatase 1) est une tyrosine phosphatase retrouvée principalement chez les cellules hématopoïétiques, mais également chez les cellules épithéliales. Bien que Shp-1 soit reconnue comme étant un régulateur négatif de plusieurs voies de signalisation intracellulaire chez les cellules hématopoïétiques, son rôle dans les cellules épithéliales a été jusqu’ici très peu étudié. Afin de mieux comprendre son rôle dans les cellules épithéliales intestinales, nous avons généré un modèle murin de délétion conditionnelle de Shp-1 spécifiquement dans l’épithélium intestinal (Shp-1CEI-KO). De manière intéressante, dès l’âge de 6 semaines, les souris expérimentales présentent une intestinalomégalie associée à une légère augmentation de la prolifération cryptale. La taille des cellules épithéliales est également augmentée, suggérant de l’hypertrophie cellulaire chez les souris invalidées pour Shp-1. Parallèlement, la voie de signalisation PI3K/Akt/mTor est activée dans l’épithélium des souris mutantes. Nous avons également noté une production accrue de cellules caliciformes et de leurs précurseures, les cellules intermédiaires, en absence de Shp-1. Par contre, la maturation des cellules de Paneth semble grandement compromise vu la baisse importante d’expression du lysozyme et des RegIIIβ et RegIIIγ, de même que la faible densité de leurs granules de sécrétion. La comparaison du phénotype intestinal des souris Shp-1CEI-KO avec celui des souris PtenCEI-KO suggère que l’hyperactivation de la voie PI3K/Akt/mTor est responsable en partie des altérations phénotypiques observées chez la souris invalidée pour Shp-1. En conclusion, nos résultats montrent que la tyrosine phosphatase Shp-1 est un régulateur important de l’homéostasie de l’épithélium intestinal en contrôlant notamment la croissance cellulaire et la différenciation des cellules de la lignée sécrétrice.

Le cancer colorectal est la deuxième cause de décès par le cancer en Amérique du Nord. Il a été démontré que l’intégrine α6β4 est surexprimée dans les tumeurs primaires colorectales et qu’elle a un rôle protumoral. Toutefois, deux variants d’épissage alternatif existe pour la sous-unité intégrine α6 soit, α6A et α6B. Ils possèdent des domaines cytoplasmiques différents laissant croire qu’ils ont également des fonctions différentes. De plus, dans le cancer colorectal humain, une augmentation du ratio des variants α6A/α6B est observée, suggérant ainsi que le variant α6A participerait à la fonction protumorale de l’intégrine α6β4. Toutefois, le rôle précis du variant α6A et sa régulation dans le cancer colorectal humain demeurent inconnus. Les travaux de recherche de cette thèse visent à identifier le rôle du variant α6A dans la carcinogenèse colorectale humaine, en plus de comprendre la régulation de son expression. Dans un premier temps, mes expériences ont confirmé qu’une augmentation du variant α6A est responsable de la surexpression de la sous-unité α6 observée dans le cancer colorectal humain. L’abolition spécifique de ce variant par shARN dans les cellules cancéreuses colorectales humaines a entrainée un ralentissement de la prolifération cellulaire, démontré par les expériences de croissance cellulaire et d’incorporation de BrdU. De plus, cette réduction de la prolifération cellulaire est accompagnée d’une répression importante de la voie Wnt/β-caténine, visualisée par la baisse de la β-caténine active, de sa localisation nucléaire et de son activité transcriptionnelle. La suppression du variant α6A dans les cellules cancéreuses colorectales humaines diminue leur capacité à développer des tumeurs en xénogreffe. Les analyses supplémentaires du mécanisme ont permis de constater que le variant α6A régule la voie Wnt/β-caténine par la dégradation autophagique de la protéine DVL2. De plus, la protéine PRICKLE1, un important médiateur de l’ubiquitination et la dégradation de DVL2, est augmentée par la suppression du variant α6A. Par ailleurs, une forte corrélation positive entre l’expression du variant α6A et MYC a été observée in vitro et in vivo. Mes travaux ont révélé que MYC contrôle l’expression du promoteur de la sous-unité α6 et qu’il favorise l’épissage de l’exon 25. Conséquemment, MYC régulerait l’expression du variant α6A par les facteurs d’épissage ESRP2 et HNRNPA2B1. Ces découvertes démontrent le potentiel de l’utilisation du variant α6A et de son mécanisme comme cible thérapeutique et outil diagnostique.

Les β-arrestines (Arrbs) régulent diverses voies de signalisation dont la voie Wnt/β-caténine (Wnt), un acteur clé dans le cancer colorectal. Le but de mon projet était d'étudier l'implication et les mécanismes régulés par les Arrbs dans la tumorigenèse intestinale dépendante de la voie Wnt. L'inhibition de l'expression des Arrbs partielle ou totale dans des souris ApcΔ14/+ montre que seules les souris invalidées pour l'Arrb2 développent 33% des tumeurs détectées chez les souris ApcΔ14/+ ; Arrb2+/+. Ces tumeurs ont une croissance normale. Cependant, l'analyse de leur transcriptome montre qu'elles expriment notamment certains gènes liés au système immunitaire, alors que les tumeurs dépendantes de l'Arrb2 expriment des gènes différents impliqués entre autres dans la voie Wnt. L'invalidation de l'Arrb2 réduit l'expression de gènes cibles de la voie Wnt dans les cellules isolées de 12 sur 18 tumeurs de souris ApcΔ14/+, et inhibe l'augmentation d'activité Wnt et la formation de colonies en agar mou induite par l'invalidation d'Apc dans des cellules murines ApcMin/+. L'Arrb2 est donc essentielle pour l'initiation et la croissance des tumeurs intestinales présentant une activité Wnt élevée. Pour comprendre les mécanismes régulés par l'Arrb2 dans ce contexte, les complexes protéiques associés à l'Arrb2 ont été analysés par protéomique dans des cellules humaines de cancer colorectal SW480 exprimant ou non un dominant négatif de Tcf4. 132 partenaires de l'Arrb2 potentiellement imbriqués dans un réseau de 917 protéines, ont été identifiés dans les cellules où la voie Wnt est active. Une baisse de 80% de l'activité Wnt entraine la disparition de 41 protéines avec 256 interactions potentielles alors que 42 protéines apparaissent avec 244 interactions potentielles. Le rôle clé d'Arrb2 dans le cancer colorectal s'expliquerait par la connexion d'au moins une quarantaine de protéines dépendantes de l'activité Wnt à un réseau de signalisation complexe dont l'analyse est en cours. / Β-arrestins (Arrbs) participate in the regulation of multiple signaling pathways, including Wnt/β-catenin (Wnt), the major actor in human colorectal cancer. The aim of my project was to study the involvement of Arrbs and the mechanisms they regulate in Wnt-dependent intestinal tumorigenesis. The partial or total inhibition of Arrbs in ApcΔ14/+ mice showed that only mice with Arrb2 depletion developed only 33% of the tumors detected in their Arrb2-WT littermates. These remaining tumors grow normally and are Arrb2–independent. Transcriptomic analysis showed that they overexpressed genes that reflect a high interaction with the immune system, whereas those overexpressed in Arrb2–dependent tumors are predominantly involved in Wnt signaling. Moreover, Arrb2 siRNAs decreased the expression of Wnt target genes in cells isolated from 12 of 18 tumors from ApcΔ14/+ mice, completely reversed the increased Wnt activity and colony formation in soft agar induced by Apc siRNA treatment in ApcMin/+ cells. Therefore, Arrb2 is essential for the initiation and growth of intestinal tumors displaying elevated Wnt pathway activity. To better understand the mechanisms involved in this context, Arrb2 protein complexes were analyzed by a differential systematic proteomic approach in SW480 human colorectal carcinoma cells expressing or not a Tcf4 dominant negative. 132 Arrb2 partners potentially involved in a signaling network of 917 proteins were identified in cells with a high Wnt activity. Upon a 80% decrease of this activity 41 partners disappeared with their 256 potential interactions whereas 42 partners appeared with 244 new possible interactions. Arrb2 key role in colorectal cancer could be explained by the cross-talk of about 40 proteins dependent of Wnt activity with a highly complex signaling network that is currently analyzed.

Les corticosurrénalomes (CS), bien que rares, sont des tumeurs malignes du cortex surrénalien très agressives. Environ 30% des patients atteints de cancer surrénalien présentent des métastases au diagnostic et leur survie à 5 ans est inférieure à 20%. Les mécanismes à l’origine de la progression cancéreuse ne sont pas complètement élucidés. Leur compréhension est pourtant un préalable à la mise au point de traitements adaptés. Les mutations du gène P53 font parties des altérations génétiques les plus fréquentes dans les CS. Dans ce contexte, il est légitime d'étudier l'effet de l'inactivation de P53 spécifiquement dans les surrénales de souris. L'antigène T du virus SV40 est un oncogène qui se lie et inhibe P53 et RB. Le laboratoire dispose de souris transgéniques (modèle AdTAg) exprimant l’antigène T de SV40 dans le cortex surrénal qui développent des tumeursévolutives. L’objectif de ce travail était de caractériser l’ontogenèse de ces tumeurs et d’explorer les modifications cellulaires et moléculaires qui accompagnent leur progression maligne notamment en lien avec les signalisations β-caténine et IGF2/mTOR. Les souris AdTAg développent des tumeurs surrénaliennes récapitulant l’ensemble des caractéristiques décrites pour les CS humains. En effet, elles présentent une surmortalité à partir de 22 semaines associée à la survenue de métastases pulmonaires et hépatiques. Les tumeurs sont à l'origine d'une hypercorticostéronémie témoignant de leur différenciation stéroïdogénique. L'analyse du score de Weiss à différents stades montre une évolution de la bénignité vers la malignité. Cette progression tumorale s’accompagne d’une activation précoce de la voie mTOR et tardive de la voie Wnt/β-caténine. Ces deux voies de signalisation pourraient donc constituer des cibles thérapeutiques intéressantes. La deuxième partie du projet visait à utiliser ce modèle murin pour tester une thérapie anticancéreuse applicable au carcinome surrénalien. La rapamycine, un inhibiteur de mTOR, inhibe la prolifération cellulaire et induit une apoptose des cellules tumorales. Après 3 mois de traitement, une réduction significative du volume tumoral est constatée ainsi que la normalisation des taux de corticostérone. Nous avons également évalué l'effet antitumoral d'inhibiteurs de la voie Wnt/β-caténine: la quercetine et le PRI-724. La quercetine stoppe la progression tumorale en inhibant la prolifération cellulaire. Elle prolonge significativement la survie des souris AdTAg. Cependant, nous n'avons pas de preuve moléculaire d'inhibition de la voie Wnt/β-caténine dans les surrénales AdTAg et les mécanismes d'action de la molécule restent à élucider. A l'inverse, le PRI-724 semble être un inhibiteur spécifique de la voieWnt/β-caténine capable de bloquer l'interaction CBP/β-caténine. Un traitement de 2 mois permet une réduction significative du volume tumoral chez les souris AdTAg. La baisse d'expression de certains gènes cibles de l'interaction CBP/β-caténine témoigne d'une inhibition de la voie. Les résultats obtenus avec les inhibiteurs des voies mTOR et Wnt/β-caténine dans le modèle murin de CS sont prometteurs. L'utilisation de ces molécules pourrait donc être envisagée dans le traitement du CS. / Adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare aggressive malignant tumor of adrenal cortex. 30% of patients have metastatic disease at diagnosis and the 5 year-survival rate is obtained inonly 20%. Unfortunately, the mechanisms of tumorigenesis are not well identified. Understanding these mechanisms could offer perspectives for new targeted therapies improving the survival in these patients. P53 inactivation in the adrenal cortex seems a good target to study its role in the tumorigenesis. Large T antigen of SV40 virus is an oncogene that fixes and inhibits P53 and RB. Our laboratory has mouse models expressing this antigen (AdTAg mouse model) in the adrenal cortex and developping progressive adrenal tumors. The initial objective was to characterize the ontogeny of these tumors, studying their molecular characteristics, especially β-catenin and IGF2/mTOR signaling, during the malignant progression. AdTAg mouse models develop adrenocortical tumors with characteristics that are identical to human ACC. They present pulmonary and liver metastases that lead to increased mortality rate from 22 weeks old. These tumors lead to hypercorticism that suggest their steroidogenic differentiation. Weiss score analyses indifferent ages show that these tumors progress from benign to malignant ones, associated with a precocious activation of mTOR pathway and tardive activation of Wnt/β-catenin pathway. These pathways are thus interesting therapeutic targets. The second part of this thesis was concentrated on the anti-cancer treatment trials. Rapamycin, an mTOR inhibitor inhibits cell proliferation and increases cell apoptosis in these tumors. After 3 months of treatment, the tumor burden was significantly reduced and corticosterone levels were normalized. We have also evaluated effects of Wnt/ β-catenininhibitors, Quercetin and PRI-742, in our mouse models. Quercetin inhibits tumor proliferation and progression and it extends the survival rate of AdTAg mice. Surprisingly, this effect was independent of Wnt/β-catenin activity and the molecular mechanisms remain to be elucidated. Inversely, PRI-724 seems to be a specific inhibitor of this pathway, blocking the interaction between CBP and β-catenin. A treatment of 2 months reduced significantly the tumor volume in AdTAg mice. This effect was through the inhibition of CBP and β-catenininteraction and signaling. These results encourage using the inhibitors of mTOR and Wnt/β-catenin pathway offering promising targets to improve the survival in patients with ACC.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) présente des mutations génétiques qui altèrent les principales voies de signalisation, notamment la voie Wnt/β-caténine. En absence de mutation génétique, certains CHC peuvent montrer une activité Wnt exacerbée suite à une inactivation épigénétique d’inhibiteurs ou à une surexpression de ligands Wnts ou de ses récepteurs. De plus, le remodelage de la matrice extracellulaire favorise la progression du CHC. Nous avons montré une association entre l’activation du signal Wnt et le remodelage de la matrice extracellulaire (MEC) dans les cirrhoses et le CHC. Puis modélisé in vitro, les effets des stimuli Wnt extracellulaires sur le phénotype de cellules hépatiques, en absence de mutation de la β-caténine. En effet, les cellules HepaRG ne présentent pas de mutations de la β-caténine, de l’axine et de p53. Ainsi, la stimulation Wnt3a des cellules HepaRG induisait la formation de palissades de cellules fusiformes. De plus, les cellules traitées exprimaient des taux élevés de αSMA, COLIV, c-MYC, CK19 et LGR5 suggérant un phénotype myofibroblastique, en accord avec l’expression des marqueurs de transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), SNAIL et TWIST. Ces données sont en faveur du rôle déterminant du microenvironnement Wnt activé dans la progression du CHC entrainant les cellules vers un phénotype progéniteur plus agressif via une TEM. En outre, l'analyse in silico de la signature transcriptomique de l'activation non mutationnelle de la voie Wnt a révélé un réseau de gènes impliqués dans le remodelage de la MEC, la TEM et la différenciation cellulaire. Les résultats suggèrent le rôle de HAPLN1 qui affecterait la migration cellulaire et l'expression des gènes de la MEC. De plus, LGR5 semble favoriser la dédifférenciation des hépatocytes. Au total, 8 gènes marqueurs obtenus in vitro ont été validés in vivo dans une série de 81 CHC humains, par qPCR et immunohistochimie en utilisant des tissus micro-array (78 CHC et 5 foies contrôles). Au total, l'ensemble des données suggère que HAPLN1 a une valeur pronostique sur la récidive et la survie globale du CHC. HAPLN1semble être indépendant du statut mutationnel la β-caténine et des variables cliniques. De plus, sa valeur pronostique est additive avec celle de CK19 + EpCAM et il semble agir en synergie avec NOG. / Hepatocellular carcinoma (HCC) displays signaling pathway disorders, including Wnt/β-catenin. Up-regulation of extracellular Wnt pathway agonists and down-regulation of extracellular Wnt pathway inhibitors result in non-mutational activation of Wnt signaling. In addition, increased extracellular matrix remodeling fosters HCC progression. Thus, we showed that enhanced Wnt signaling is associated with extracellular matrix remodeling in human cirrhosis and cancer. To further investigate non-mutational Wnt pathway activation, we established a model of Wnt activation in HepaRG human HCC progenitor cells carrying wild-type β-catenin, axin and p53. HepaRG progenitor cells treated with Wnt3a became fusiform and grew in palisades with enhanced expression of αSMA, COLIV, CK19, c-MYC, LGR5, SNAIL and TWIST, suggesting that enhanced extracellular Wnt signaling may drive HCC cells toward a more aggressive progenitor and epithelial mesenchymal transition (EMT) phenotype. Moreover, in silico analysis of the transcriptomic signature of non-mutational Wnt activation revealed a gene network involved in ECM remodeling, EMT and cell fate. Results suggest a role of HAPLN1, affecting extracellular matrix gene expression and cell migration and of LGR5 in hepatocyte dedifferentiation. Eight genes among the HepaRG gene expression dataset were validated in vivo in a collection of 81 human HCC samples and controls by qPCR and immunohistochemistry using tissue micro-arrays (78 HCC samples and 5 normal livers) in the light of β-catenin activation and mutational status. In conclusion, data suggest that HAPLN1 has a prognostic value on overall survival and recurrence of HCC. HAPLN1 appears to be independent of clinical features and β-catenin mutationnal status. Moreover, HAPLN1 appears to have an additive prognostic value with CK19 + EpCAM and act synergistically with NOG.

Les carcinomes de la cortico-surrénale (CCS) sont des tumeurs de mauvais pronostic et les thérapies sont encore limitées. La chirurgie reste à ce jour le seul traitement efficace. La compréhension des mécanismes de la tumorigenèse cortico-surrénalienne et l'identification des gènes et des voies de signalisation impliquées sont nécessaires pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Ces dernières années, plusieurs études de génomique ont été réalisées sur des cohortes indépendantes de CCS et ont mis en évidence l'existence de deux groupes de CCS ayant des profils d’expression génique particuliers et associés à des pronostics de survie différents. Il a aussi été identifié de fréquentes mutations touchant les gènes TP53 et CTNNB1 (β-caténine). De plus, l'activation aberrante de la voie WNT/β-caténine est associée au groupe des CCS agressifs. Enfin, des analyses des altérations génomiques par puce SNP et le séquençage de l’exome de cohortes de CCS a permis de préciser les fréquences des mutations de TP53 (~18%) et CTNNB1 (~14%) mais a aussi mis en évidence des mutations et des délétions homozygotes au niveau du gène ZNRF3 (Zinc And Ring Finger 3) dans environs 20% des CCS. ZNRF3 a été montré comme jouant un rôle de régulateur négatif de la voie WNT/β-caténine. Par conséquent, la voie de signalisation WNT/β-caténine est la voie la plus fréquemment altérée dans les CCS (~40%). L’objectif de mon projet était d’étudier comment l’activation constitutive de la voie WNT/β-caténine pouvait participer à la tumorigenèse cortico-surrénalienne, puis d'essayer de comprendre plus spécifiquement le rôle des altérations de ZNRF3 dans le développement et/ou l'agressivité des CCS. En combinant des analyses de transcriptomes de modèles cellulaires et de cohortes de CCS, nous avons établi une signature robuste cortico-surrénalienne de l'activation de la voie WNT/β-caténine. Parmi les gènes de cette signature, nous avons montré que AFF3 était une cible transcriptionnelle de la β-caténine et qu'il était capable de transmettre en partie les effets oncogèniques de la voie WNT/β-caténine dans les cellules cortico-surrénaliennes. En effet, son invalidation entraîne l'apoptose et diminue la prolifération des cellules cortico-surrénaliennes à l'image de l'invalidation de la β-caténine. La surexpression d’AFF3 altère l’organisation des speckles nucléaires et la localisation de CDK9/CyclinT1 impliqués respectivement dans l'épissage des ARNm et la transcription des gènes. ZNRF3 est le gène le plus fréquemment altéré dans les CCS alors qu'il l'est très peu dans les autres types de cancers. ZNRF3 est une E3 ubiquitin ligase qui entraîne l'internalisation et la dégradation des récepteurs Frizzleds de la voie WNT. Nous avons montré que ZNRF3 agit bien comme un gène suppresseur de tumeur dans les cellules cortico-surénaliennes humaines H295R. En effet la surexpression de ZNRF3 diminue la prolifération et augmente l’apoptose cellulaire de ces cellules. Nous avons aussi montré qu'à l'image d'autres régulateurs négatifs de la voie WNT comme AXIN2, ZNRF3 est un gène cible de la voie WNT/β-caténine dans la corticosurrénale. De manière intéressante, les altérations du gène ZNRF3 ne sont pas retrouvées dans des tumeurs présentant une forte activation de la voie de signalisation WNT/β-caténine, suggérant l'implication d'autres voies de signalisation. Nous avons identifié des partenaires protéiques de ZNRF3 par des expériences d'immunoprécipitation / spectrométrie de masse. Nous avons montré que ZNRF3 interagit avec la sous unité catalytique de la pompe NA+/K+, ATP1A1. Cette interaction altère le fonctionnement de la pompe NA+/K+ conduisant à des modifications du flux de Ca2+ intracellulaire. L'ensemble de ces travaux a permis de mieux comprendre comment la voie WNT/β-caténine participe à l'agressivité des cancers de la corticosurrénale et de montrer qu'AFF3 est essentiel pour les effets oncogéniques de cette voie. (...) / Adrenocortical carcinomas are rare tumors with poor prognostic and limited therapy. Up to now, surgery remains the only curative therapy. A better understanding of tumor biology and molecular prognostic factors would help to select relevant therapeutic targets and to develop innovative therapeutic strategies. In the last years, different genomic studies on independent cohorts of ACC have identified two subgroups of cancers with two distinguished profiles of genes expression and two different survival rates. Frequents alterations of CTNNB1 and TP53 are identified in ACC. Moreover, aberrant activation of WNT/β-catenin pathway in ACC is associated with lower overall survival. Using a combination of genomic approaches, we and others have recently analyzed independent cohorts of ACC. These works confirmed recurrent alterations in CTNNB1 (~14%) and TP53 (~18%), but also revealed new loci not previously reported to be altered in ACC. Strikingly, ZNRF3 (zinc and ring finger 3) was the most frequently altered gene (~20%). ZNRF3 encodes a protein that acts as a negative regulator of Wnt/β-catenin pathway. The Wnt/β-catenin pathway represents the most frequently altered pathway in ACC (~40%). The aim of my project was to study how the aberrant activation of WNT/β-catenin pathway could participate to adrenal tumorigenesis and then to identify more specifically the role of ZNRF3 alterations in development/aggressiness of ACC. By a combination of transcriptomic analysis on two cohorts of ACC and on H295R adrenocortical cells, we identified a list of genes whose expression is correlated to the WNT/β-catenin activation. Among these genes, we show that AFF3 is essential to mediate the effect of activation the WNT/β-catenin pathway in adrenocortical cancer. Indeed, AFF3 is a direct target gene of β-catenin and its silencing in H295R adrenocortical cells induces a decreased cell proliferation and an increased apoptosis similar to that induced by β-catenin silencing. Moreover, AFF3 overexpression altered the structure of nuclear speckles and the localization of CDK9/CyclinT1, which are respectively involved in mRNA splicing and transcription. ZNRF3 (zinc and ring finger 3) was the most frequently altered gene (20%) in ACC. ZNRF3 had never been frequently associated with other tumour types. ZNRF3 encodes a protein that had been described as cell-surface transmembrane E3 ubiquitin ligases, acting as negative regulators of Wnt/β-catenin signaling, by promoting the degradation of Wnt ligand receptors (Frizzled receptors). We show that ZNRF3 act as a tumor suppressor gene in adrenocortical cell line H295R. Indeed the overexpression of ZNRF3 decreases cell proliferation and increases apoptosis. We demonstrate also that ZNRF3 is a target gene of WNT/β-catenin pathway. ZNRF3 alterations have less effect on expression of WNT/β-catenin target genes than CTNNB1 mutations in ACC. Moreover, our results with ZNRF3 overexpression in H295R adrenocortical cells suggest that ZNRF3 is also involved in βcatenin independant-pathway(s) to mediate its effects on apoptosis. Using mass spectrometry analysis, we identified that ZNRF3 interacts with ATP1A1 (ATPase Na+/K+ Transporting Subunit Alpha 1), affecting the activity of the Na+/K+ ATPase pump in adrenocortical cells. These results provide a better understanding of the biological process of WNT/βcatenin pathway activation in ACC with AFF3 as new target of this pathway. Moreover, our data provide insight into the tumor suppressor role of ZNRF3 in ACC and uncovers an additional role of ZNRF3 on Na+/K+ ATPase pump activity.

La prévalence du syndrome métabolique (MetS) est en constante augmentation dans les pays industrialisés. La stéatose hépatique, caractérisée par une accumulation massive de lipides dans les hépatocytes est une des manifestations du MetS. Parmi les SNP (Single Nucleotide Polymorphism) associés au MetS et à la stéatose hépatique, le SNP I148M de l'adiponutrine/PNPLA3 (Patatin-like Phospholipase Domain-Containing) est décrit comme un nouveau marqueur de la stéatose et également de la sévérité des différentes atteintes hépatiques des NAFLD (Non-alcoholic Fatty Liver diseases). L'objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle de l'adiponutrine dans le foie, d'une part, en étudiant sa régulation transcriptionnelle par les facteurs de transcription SREBP1c (Sterol Responive Element Binding Protein) et ChREBP (Carbohydrate Responsive Element Binding Protein) en réponse à l'insuline et au glucose et d'autre part, en étudiant l'impact de sa surexpression sur le métabolisme glucido-lipidique dans le foie de souris. L'adiponutrine est régulée de façon semblable aux enzymes lipogéniques et semble avoir un impact sur le métabolisme lipidique dans le foie. Comme l'adiponutrine, différents SNP des médiateurs de la voie Wnt/β-caténine sont également associés au syndrome métabolique et au diabète. La voie Wnt/β-caténine joue un rôle déterminant dans la zonation du lobule hépatique. Nous nous sommes intéressés à la régulation de cette voie par les conditions nutritionnelles et dans un contexte physiopathologique de stéatose et de résistance à l'insuline. Nos résultats montrent la régulation de cette voie par les hormones pancréatiques (insuline et glucagon) dans le foie favorisant ainsi l'orientation métabolique des hépatocytes en fonction des besoins. De plus, cette voie est dérégulée dans le foie d'animaux résistants à l'insuline, suggérant qu'elle pourrait avoir une fonction dans ce désordre métabolique.

La prévalence du syndrome métabolique (MetS) est en constante augmentation dans les pays industrialisés. La stéatose hépatique, caractérisée par une accumulation massive de lipides dans les hépatocytes est une des manifestations du MetS. Parmi les SNP (Single Nucleotide Polymorphism) associés au MetS et à la stéatose hépatique, le SNP I148M de l’adiponutrine/PNPLA3 (Patatin-like Phospholipase Domain-Containing) est décrit comme un nouveau marqueur de la stéatose et également de la sévérité des différentes atteintes hépatiques des NAFLD (Non-alcoholic Fatty Liver diseases). L’objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle de l’adiponutrine dans le foie, d’une part, en étudiant sa régulation transcriptionnelle par les facteurs de transcription SREBP1c (Sterol Responive Element Binding Protein) et ChREBP (Carbohydrate Responsive Element Binding Protein) en réponse à l’insuline et au glucose et d’autre part, en étudiant l’impact de sa surexpression sur le métabolisme glucido-lipidique dans le foie de souris. L’adiponutrine est régulée de façon semblable aux enzymes lipogéniques et semble avoir un impact sur le métabolisme lipidique dans le foie. Comme l’adiponutrine, différents SNP des médiateurs de la voie Wnt/β-caténine sont également associés au syndrome métabolique et au diabète. La voie Wnt/β-caténine joue un rôle déterminant dans la zonation du lobule hépatique. Nous nous sommes intéressés à la régulation de cette voie par les conditions nutritionnelles et dans un contexte physiopathologique de stéatose et de résistance à l’insuline. Nos résultats montrent la régulation de cette voie par les hormones pancréatiques (insuline et glucagon) dans le foie favorisant ainsi l’orientation métabolique des hépatocytes en fonction des besoins. De plus, cette voie est dérégulée dans le foie d’animaux résistants à l’insuline, suggérant qu’elle pourrait avoir une fonction dans ce désordre métabolique. / The prevalence of metabolic syndrome (MetS) has increased in industrial countries. The hallmark of MetS in the liver is an excessive accumulation of triglyceride, which is called hepatic steatosis. Different SNP (Single Nucleotide Polymorphism) are associated with hepatic steatosis or MetS. One of them is found on adiponutrin/PNPLA3 (Patatin-like Phospholipase Domain-Containing) gene (SNP I148M) and is now considered as a new marker of hepatic steatosis and severity of NAFLD (Non-alcoholic Fatty Liver diseases). In order to understand the physiological role of adiponutrin in the liver, we studied its transcriptional regulation by SREBP1c (Sterol Responive Element Binding Protein) and ChREBP (Carbohydrate Responsive Element Binding Protein), mediators of insulin and glucose respectively. Moreover, by overexpressing adiponutrin in mice liver, we investigated its role in hepatic carbohydrate and lipid metabolism. We showed that adiponutrin is regulated as lipogenic genes and could have a role lipid metabolism. As for adiponutrin I148M, different SNP are found on substrats of Wnt/β-catenin pathway, a major pathway controlling acinus zonation. We examined the regulation of this pathway by nutritionnal status and in a pathophysiological context of insulin resistance and steatosis. We showed that Wnt/β-catenin pathway is regulated by pancreatic hormones (insulin and glucagon) in the liver in order to adapt hepatocyte phenotype to energetic needs. Moreover, this pathway is dysregulated in insulin resistant mice liver. These data may suggest a link between Wnt/β-catenin pathway deregulation and hepatic metabolic disorders.