Les tumeurs corticosurrénaliennes unilatérales sont fréquentes (prévalence de 2 à 9% de la population). Il s’agit le plus souvent d’adénomes. Le cancer de la corticosurrénale, ou corticosurrénalome, a un pronostic sombre, la survie ne dépassant pas 40 % à cinq ans. Le diagnostic de malignité de ces tumeurs, actuellement basé sur l’histologie, peut être difficile. Le pronostic des corticosurrénalomes est hétérogène et peu prévisible. Enfin, la prise en charge thérapeutique est encore limitée. Ces difficultés diagnostiques, pronostiques et thérapeutiques s’expliquent entre autres par la connaissance limitée de la physiopathologie de ce cancer. Le génome a un rôle central dans le développement des cancers en général. La survenue d’altérations génomiques (mutations, anomalies de nombre de copies, pertes d’hétérozygotie, translocations, anomalies de méthylation) va aboutir à la surexpression d’oncogènes et à la répression de gènes suppresseurs de tumeurs. La génomique, en ouvrant la voie à la caractérisation moléculaire à l’échelle du génome entier des tumeurs, est devenue incontournable pour étudier la physiopathologie des cancers. Les études de transcriptome des tumeurs corticosurrénaliennes ont montré que le profil d’expression génique discrimine adénomes et corticosurrénalomes, et identifie deux groupes distincts de corticosurrénalomes avec des pronostics différents. Dans le sillage de ces travaux précédemment réalisés par l’équipe, je me suis intéressée pendant ma thèse aux anomalies de nombres de copies d'ADN et aux anomalies de méthylation des corticosurrénalomes. Dans une première partie j’ai étudié le génome de 38 adénomes et 21 corticosurrénalomes par puce d’hybridation génomique comparative (puces CGH). Le transcriptome de 54 de ces tumeurs était déjà disponible. Le génome des corticosurrénalomes est très altéré contrairement à celui des adénomes (44% du génome est perdu ou gagné, versus 10% pour les adénomes, p=2.10-10). Dans les adénomes, la région 9q34 (locus de SF-1) est fréquemment gagnée et ce gain est associé à une surexpression de SF-1. Pour les corticosurrénalomes, les évènements récurrents concernent les gains des chromosomes 5, 7, 12, 16, 19, 20 et les pertes des chromosomes 13 et 22. Les gènes situés dans les régions minimales communes gagnées ou perdues ont été filtrés en fonction de leur expression. La liste des gènes à la fois gagnés et surexprimés inclut des oncogènes comme FGFR4, CDK4, CCNE1 ; et la liste des gènes avec perte de matériel et sous-expression inclut des gènes suppresseurs de tumeurs (LATS2, ST13). Un outil diagnostique basé sur la mesure en PCR quantitative de 6 loci permet de séparer les corticosurrénalomes des adénomes dans une cohorte de validation indépendante de 79 tumeurs, avec une sensibilité de 100% et une spécificité de 83%. Le nombre d’altérations chromosomiques n’a pas de valeur pronostique, mais une technique de classification hiérarchique non supervisée permet de séparer les corticosurrénalomes en deux groupes de pronostic différent, et a été validée sur une cohorte indépendante de 25 tumeurs. Dans une deuxième partie, j’ai étudié les anomalies de méthylation des promoteurs des gènes de 51 corticosurrénalomes et 81 adénomes par puce Infinium HumanMethylation27 (Illumina). Les données d’expression étaient disponibles pour 87 tumeurs. Les corticosurrénalomes sont globalement hyperméthylés par rapport aux adénomes. La classification hiérarchique non supervisée sépare les corticosurrénalomes en 3 groupes : un groupe non-hyperméthylé, un groupe modérément hyperméthylé, et un autre très hyperméthylé. Cette classification a été confirmée par MS-MLPA. L’hyperméthylation est associée à un mauvais pronostic (p=0,02 en modèle de Cox). La corrélation entre niveau de méthylation et expression identifie 1741 gènes (sur les 12250 étudiés) corrélés négativement (…) / Unilateral adrenocortical tumors are common (prevalence : 2 to 9% of the population). Most of these tumors are adenomas. Adrenocortical cancer (ACC) has a poor prognosis, with a 5-yr survival rate not exceeding 40% in most series. Pathological diagnosis of these tumors relies on several histological features and can be difficult. The prognosis of adrenocortical carcinomas is heterogeneous and unpredictable. Knowledge of the pathophysiology of these tumors is also limited. The genome has a central role in the development of cancers in general. The occurrence of genomic alterations (mutations, abnormal copy number, loss of heterozygosity, translocations, abnormal methylation) will lead to the overexpression of oncogenes and repression of tumor suppressor genes. Genomic approaches became essential to study the pathophysiology of cancer. Transcriptome studies of adrenocortical tumors have shown that the gene expression profile discriminate ACC and adenomas, and identified two distinct groups of ACC with different prognoses. In addition to gene expression, genomics now covers a large spectrum of alterations, including chromosomal alterations, DNA sequence modifications, and epigenetic alterations. I studied chromosomal alterations and DNA methylation abnormalities in ACC during my thesis.In the first part the genome of 38 adrenocortical adenomas and 21 ACC were identified by comparative genomic hybridization arrays. The transcriptome of 54 of these tumors was already available. A larger proportion of the genome is altered in carcinomas compared with adenomas (44 % of the genome is lost or gained, versus 10% for adenomas , p = 2.10-10 ) . In adenomas, the 9q34 region, which includes the steroidogenic factor 1locus, is commonly gained and associated with an overexpression of steroidogenic factor 1 (SF-1).In carcinomas, recurrent gains include chromosomes 5, 7, 12, 16, 19, and 20 and recurrent losses chromosomes 13 and 22. Filtering the genes from these regions according to their expression profile identified genes potentially relevant to adrenocortical tumorigenesis. A diagnostic tool was built by combining DNA copy number estimates at six loci (5q, 7p, 11p, 13q, 16q, and 22q). This tool discriminates carcinomas from adenomas in an independent validation cohort (sensitivity 100%, specificity 83%). In carcinomas, the number of chromosomal alterations was not associated with survival (Cox p=0.84). A prognostic tool based on tumor DNA was designed with a clustering strategy and validated in an independent cohort. In the second part, methylation patterns of CpG islands in promoter regions of 51 adrenocortical carcinomas and 84 adenomas were studied by the Infinium HumanMethylation27 Beadchip (Illumina) . Gene expression data were available for 87 tumors. Methylation was higher in carcinomas than in adenomas (t test : p=3.1x10-9). Unsupervised clustering of DNA methylation profiles identified two groups of carcinomas, one with an elevated methylation level, evoking a CpG island methylator phenotype (CIMP). The subgroup of hypermethylated carcinomas was further divided in two subgroups, with different levels of methylation (CIMP-high and CIMP-low). This classification could be confirmed by methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification. Hypermethylation was associated with a poor survival (Cox model p= 0.02). The transcriptome/methylation correlation showed 1741 genes (of 12250) negatively correlated; among the top genes were H19 and other tumor suppressors (PLAGL-1, G0S2, and NDRG2). The subgroups identified by the transcriptome adrenocortical have different levels of methylation. In conclusion, genomic alterations discriminate carcinomas from adenomas and contain prognostic information. The subgroups identified by the adrenocortical transcriptome profiles of different genomic alterations. Chromosomal alterations and abnormal methylation alter the expression of genes important for tumorigenesis.

Les corticosurrénalomes (CS), bien que rares, sont des tumeurs malignes du cortex surrénalien très agressives. Environ 30% des patients atteints de cancer surrénalien présentent des métastases au diagnostic et leur survie à 5 ans est inférieure à 20%. Les mécanismes à l’origine de la progression cancéreuse ne sont pas complètement élucidés. Leur compréhension est pourtant un préalable à la mise au point de traitements adaptés. Les mutations du gène P53 font parties des altérations génétiques les plus fréquentes dans les CS. Dans ce contexte, il est légitime d'étudier l'effet de l'inactivation de P53 spécifiquement dans les surrénales de souris. L'antigène T du virus SV40 est un oncogène qui se lie et inhibe P53 et RB. Le laboratoire dispose de souris transgéniques (modèle AdTAg) exprimant l’antigène T de SV40 dans le cortex surrénal qui développent des tumeursévolutives. L’objectif de ce travail était de caractériser l’ontogenèse de ces tumeurs et d’explorer les modifications cellulaires et moléculaires qui accompagnent leur progression maligne notamment en lien avec les signalisations β-caténine et IGF2/mTOR. Les souris AdTAg développent des tumeurs surrénaliennes récapitulant l’ensemble des caractéristiques décrites pour les CS humains. En effet, elles présentent une surmortalité à partir de 22 semaines associée à la survenue de métastases pulmonaires et hépatiques. Les tumeurs sont à l'origine d'une hypercorticostéronémie témoignant de leur différenciation stéroïdogénique. L'analyse du score de Weiss à différents stades montre une évolution de la bénignité vers la malignité. Cette progression tumorale s’accompagne d’une activation précoce de la voie mTOR et tardive de la voie Wnt/β-caténine. Ces deux voies de signalisation pourraient donc constituer des cibles thérapeutiques intéressantes. La deuxième partie du projet visait à utiliser ce modèle murin pour tester une thérapie anticancéreuse applicable au carcinome surrénalien. La rapamycine, un inhibiteur de mTOR, inhibe la prolifération cellulaire et induit une apoptose des cellules tumorales. Après 3 mois de traitement, une réduction significative du volume tumoral est constatée ainsi que la normalisation des taux de corticostérone. Nous avons également évalué l'effet antitumoral d'inhibiteurs de la voie Wnt/β-caténine: la quercetine et le PRI-724. La quercetine stoppe la progression tumorale en inhibant la prolifération cellulaire. Elle prolonge significativement la survie des souris AdTAg. Cependant, nous n'avons pas de preuve moléculaire d'inhibition de la voie Wnt/β-caténine dans les surrénales AdTAg et les mécanismes d'action de la molécule restent à élucider. A l'inverse, le PRI-724 semble être un inhibiteur spécifique de la voieWnt/β-caténine capable de bloquer l'interaction CBP/β-caténine. Un traitement de 2 mois permet une réduction significative du volume tumoral chez les souris AdTAg. La baisse d'expression de certains gènes cibles de l'interaction CBP/β-caténine témoigne d'une inhibition de la voie. Les résultats obtenus avec les inhibiteurs des voies mTOR et Wnt/β-caténine dans le modèle murin de CS sont prometteurs. L'utilisation de ces molécules pourrait donc être envisagée dans le traitement du CS. / Adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare aggressive malignant tumor of adrenal cortex. 30% of patients have metastatic disease at diagnosis and the 5 year-survival rate is obtained inonly 20%. Unfortunately, the mechanisms of tumorigenesis are not well identified. Understanding these mechanisms could offer perspectives for new targeted therapies improving the survival in these patients. P53 inactivation in the adrenal cortex seems a good target to study its role in the tumorigenesis. Large T antigen of SV40 virus is an oncogene that fixes and inhibits P53 and RB. Our laboratory has mouse models expressing this antigen (AdTAg mouse model) in the adrenal cortex and developping progressive adrenal tumors. The initial objective was to characterize the ontogeny of these tumors, studying their molecular characteristics, especially β-catenin and IGF2/mTOR signaling, during the malignant progression. AdTAg mouse models develop adrenocortical tumors with characteristics that are identical to human ACC. They present pulmonary and liver metastases that lead to increased mortality rate from 22 weeks old. These tumors lead to hypercorticism that suggest their steroidogenic differentiation. Weiss score analyses indifferent ages show that these tumors progress from benign to malignant ones, associated with a precocious activation of mTOR pathway and tardive activation of Wnt/β-catenin pathway. These pathways are thus interesting therapeutic targets. The second part of this thesis was concentrated on the anti-cancer treatment trials. Rapamycin, an mTOR inhibitor inhibits cell proliferation and increases cell apoptosis in these tumors. After 3 months of treatment, the tumor burden was significantly reduced and corticosterone levels were normalized. We have also evaluated effects of Wnt/ β-catenininhibitors, Quercetin and PRI-742, in our mouse models. Quercetin inhibits tumor proliferation and progression and it extends the survival rate of AdTAg mice. Surprisingly, this effect was independent of Wnt/β-catenin activity and the molecular mechanisms remain to be elucidated. Inversely, PRI-724 seems to be a specific inhibitor of this pathway, blocking the interaction between CBP and β-catenin. A treatment of 2 months reduced significantly the tumor volume in AdTAg mice. This effect was through the inhibition of CBP and β-catenininteraction and signaling. These results encourage using the inhibitors of mTOR and Wnt/β-catenin pathway offering promising targets to improve the survival in patients with ACC.

Les cortico-surrénalomes (CCS) sont considérés comme des tumeurs malignes endocriniennes rares, associées à un pronostic sombre. Les trois mécanismes moléculaires les plus fréquemment altérés dans les CCS comprennent les mutations inactivatrices du gène suppresseur de tumeur TP53,la surexpression de IGF-II et l'activation constitutive de la voie de signalisation Wnt/β-caténine. En utilisant des modèles de souris transgéniques, nous avons montré que ces altérations, même combinées, ne sont pas suffisantes pour permettre la progression maligne.Nous avons précédemment identifié l'histone méthyltransférase EZH2 comme le modificateur d'histone le plus dérégulé dans les CCS. Nous avons également montré que sa surexpression est associée à une progression tumorale et à un mauvais pronostic. Cependant, les mécanismes sous-jacents de cette agressivité sont largement inconnus. Dans cette étude, nous avons cherché à identifier les gènes cibles de EZH2 dans les CCS, qui sont soient activés, soient réprimés. Ainsi, nous avons effectué une analyse bio-informatique des données du transcriptome de trois cohortes de patients porteurs de CCS. L’analyse montre une forte corrélation entre la surexpression de EZH2 et les gènes régulés positivement, suggérant un rôle majeur d’inducteur transcriptionnel de EZH2 dans les CCS. Nous avons montré que cette activité positive repose sur une interaction entre EZH2 et E2F1, qui entraîne la surexpression de gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire et la mitose tels que RRM2,PTTG1 et PRC1/ASE1. Nous avons montré que l'inhibition de RRM2 par ARN interférent ou traitement pharmacologique avec le GW8510 inhibe la croissance cellulaire, la capacité à combler les blessures, la croissance clonogénique, la migration et induit l'apoptose des cellules H295R en culture. En revanche, l'expression du facteur pro-apoptotique NOV/CCN3 est diminuée dans les CCS, ce qui est corrélé au développement de tumeurs agressives. Nos analyses moléculaires montrent que l'inhibition de EZH2 augmente l'expression de NOV/CCN3, suggérant que la surexpression de EZH2 pourrait favoriser la progression maligne des CCS en inhibant les stimulateurs de l'apoptose. Le facteur NOV a déjà été identifié comme cible négative du récepteur nucléaire SF1 dans les cellules du CCS, bien que les mécanismes moléculaires à l'origine de cette inhibition n'aient pas été identifiés. De manière intéressante, dans le cancer de la prostate, l'expression de NOV est inhibée par le récepteur des androgènes AR, grâce au recrutement de EZH2 qui pose la marque répressive H3K27me3. Nous avons pu identifier une coopération similaire entre SF1 et EZH2 pour réprimer l'expression de NOV et bloquer ainsi l'apoptose dans les CCS.Au total, ces résultats identifient SF1 et E2F1 comme deux partenaires indépendants de EZH2, induisant la répression de facteurs pro-apoptotiques et l'activation des gènes du cycle cellulaire respectivement, conduisant ainsi à l'agressivité des CCS. / Adrenocortical carcinomas (ACC) are regarded as rare endocrinemalignancies associated with dismal prognosis. The three common molecularmechanisms predominantly altered in ACC include inactivating mutations of theTP53 tumor suppressor gene, overexpression of IGF-II and constitutive activationof the Wnt/β-catenin signaling pathway. Using transgenic mouse models, wehave shown that these alterations, even when combined together, were notsufficient to induce malignant progression.We previously identified the histone methyltransferase EZH2 as the mostderegulated histone modifier in ACC. We have also shown that its overexpressionis associated with tumor progression and poor prognosis. Yet, the mechanismsunderlying this aggressiveness are largely unknown. Here, we aimed to identifyEZH2 target genes in ACC, which are either activated or repressed.Thus, we conducted a bio-informatics analysis of transcriptome data fromthree cohorts of ACC patients. The analysis showed a strong correlation betweenhighly expressed EZH2 and positively regulated genes suggesting a major role of‘transcriptional inducer‘ for EZH2 in ACC. We have shown that this positiveactivity relies on an interaction between EZH2 and E2F1 that results in theupregulation of genes implicated in cell cycle regulation and mitosis such asRRM2, PTTG1 and PRC1/ASE1. We showed that Inhibition of RRM2 by RNAinterference or pharmacological treatment with GW8510 inhibits cellular growth,wound healing, clonogenic growth, migration and induces apoptosis of H295Rcells in culture.In contrast, expression of the pro-apoptotic factor NOV/CCN3 is decreasedin ACC, which is correlated with development of aggressive tumours. Ourmolecular analyses show that EZH2 inhibition increases expression ofNOV/CCN3, suggesting that EZH2 overexpression may also favour malignantprogression in ACC by inhibition of apoptosis stimulators. NOV has previouslybeen identified as a negative target of the nuclear receptor SF1 in ACC cells,although the molecular mechanisms underlying this inhibition were unidentified.Interestingly, in prostate cancer, NOV expression is inhibited by the androgenreceptor, through recruitment of EZH2 and deposition of the H3K27me3 mark.We have been able to identify a similar cooperation between SF1 and EZH2 tosuppress NOV expression and block apoptosis in ACC.Altogether, these findings identifiy SF1 and E2F1 as two independentpartners of EZH2, inducing repression of proapoptotic factors, and activation ofcell cycle genes respectively, thus leading to aggressiveness of ACC.