Orientador: Wilma de Grava Kempinas / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T17:40:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Favareto_AnaPaulaAlves_M.pdf: 1827762 bytes, checksum: d744cd05981fc722ad8dc5063be9ece7 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Vários estudos têm demonstrado que a proteína espermática de membrana SP22 (22-28 kDa) é altamente correlacionada com a fertilidade. A localização desta proteína no segmento equatorial da cabeça espermática em várias espécies mamíferas, e a inibição de fertilização in vivo e in vitro, obtida com a incubação de espermatozóides com anticorpos anti-rSP22, sugerem sua participação na interação espermatozóide-oócito e sua importância para a capacidade reprodutiva masculina. Assim, os objetivos do presente estudo foram avaliar a presença da proteína SP22 em espermatozóides de carneiros adultos (raças Dorper e Santa Inês), identificando sua localização; quantificar os níveis desta proteína mediante as técnicas de ELISA e imunomarcação fluorescente utilizando anticorpo anti-rSP22; e correlacionar os seus níveis com os parâmetros espermáticos de morfologia, integridade de membrana avaliada por sondas fluorescentes (diacetato de carboxifluoresceína e iodeto de propídio), e cinética obtida por sistema computadorizado (CASA). A SP22 foi especificamente localizada no segmento equatorial da cabeça e no colo do espermatozóide ovino. As técnicas de ELISA e imunomarcação fluorescente mostraram-se eficientes para a quantificação da SP22 nos espermatozóides ovinos e altamente correlacionadas (R2 = 0,70). Não houve diferença significativa (P > 0,05) nos níveis de SP22 obtidos por estes dois métodos entre as raças estudadas. Para o estudo da cinética espermática foi realizada análise estatística multivariada, considerando os valores individuais obtidos pelo sistema CASA (1 ejaculado por carneiro, n = 3847 espermatozóides). Através da análise de agrupamento foi possível estabelecer um número de 3 sub-populações espermáticas coexistentes no ejaculado dos carneiros. A sub-população 1 foi a mais ativa e progressiva. A subpopulação 3 teve movimento pouco progressivo e não-linear, e a sub-população 2 teve um padrão de cinética intermediário. Houve diferença significativa (qui-quadrado = 824,39; grau de liberdade = 34; P < 0,0001) na distribuição das 3 sub-populações nos carneiros. No entanto, não houve correlação significativa (P > 0,05) entre a proporção de cada sub-população nos carneiros e os níveis de SP22 avaliados por ELISA e imunomarcação fluorescente. A integridade de membrana espermática foi positivamente correlacionada (R2 = 0,48; P = 0,02) com a proporção de espermatozóides da sub população 1 e negativamente correlacionada (R2 = 0,30; P = 0,02) com a sub-população 3. Porém, este parâmetro espermático não foi correlacionado (P > 0,05) com a proporção de espermatozóides da sub-população 2. Além disso, a morfologia espermática não foi correlacionada (P > 0,05) às proporções das três sub-populações cinéticas encontradas. Os níveis de SP22 obtidos por ELISA foram negativa e positivamente correlacionados (R2 para as 3 variáveis = 0,47) com as porcentagens de espermatozóides morfologicamente anormais e de espermatozóides com membrana plasmática íntegra, respectivamente. A quantificação de SP22 por análise de imunomarcação fluorescente não foi correlacionada com nenhum dos parâmetros espermáticos avaliados. Estes resultados demonstraram que o estudo da proteína SP22 em espermatozóides ovinos pode trazer importantes informações a respeito da capacidade reprodutiva destes animais. Entretanto, para a validação desta proteína como um biomarcador de fertilidade nesta espécie são necessários estudos que correlacionem os níveis da SP22 com as taxas de fertilidade obtidas in vivo e/ou in vitro / Abstract: Several studies have shown that the SP22 sperm membrane protein (22-28 kDa) is highly correlated with fertility. The location of this protein on the equatorial segment of the sperm head in several mammallian species, and the inhibition of in vivo and in vitro fertilization, obtained by the incubation of spermatozoa with anti-rSP22 antibodies, suggest its paticipation in spermatozoon-oocyte interaction and its importance for the male reproductive capacity. Thus, the goals of the present study were to evaluate the presence of the SP22 protein on spermatozoa from adult rams (Dorper and Santa Inês breeds), identifying its location; to quantify the levels of this protein by ELISA and FITC immunostaning analysis using anti-rSP22 Ig; and to correlate its levels with sperm parameters of morphology, membrane integrity evaluated by fluorescent probes (carboxyfluorescein diacetate and propidium iodide) and kinetics by computer-assisted sperm analysis (CASA). The SP22 was specifically located on the equatorial segment of the head and neck of the ram spermatozoon. The ELISA and FITC immunostaning techniques appear to be efficient for the SP22 quantification in ovine spermatozoa and were significantly correlated (R2 = 0.70). There was no significant difference (P > 0.05) in SP22 levels assessed by these two methods between the studied breeds. For the study of the sperm kinetics, multivariate statistical analysis was performed, considering the individual values obtained by CASA system (1 ejaculate per ram, n = 3847 spermatozoa). Through clustering analysis, it was possible to set up a number of 3 sperm subpopulations coexistent within ejaculate from rams. The subpopulation 1 was the most active and progressive. The subpopulation 3 had little progressive and non-linear movement and the subpopulation 2 had an intermediate kinetic pattern. There was significant difference (chi-square = 824.39; degrees of freedom = 34; P < 0.0001) in the distribution of the 3 subpopulations among the rams. However, there was no significant correlation (P > 0.05) between the proportion of each subpopulation in the rams and the SP22 levels evaluated by ELISA and FITC immunostaining analysis. The membrane integrity was positively correlated (R2 = 0.48; P = 0.02) with the proportion of spermatozoa in subpopulation 1 and it was negatively correlated (R2 = 0.30; p = 0.02) with subpopulation 3. However, this sperm parameter was not significantly correlated (P > 0.05) with proportion of spermatozoa in subpopulation 2. Moreover, sperm morphology was not significantly correlated (P > 0.05) with the proportions of the three kinematics subpopulations found within ejaculate semen. The SP22 levels obtained by ELISA were negatively and positively correlated (R2 = 0.47 for 3 variable) with percentages of spermatozoa morphologically abnormal and of spermatozoa with intact plasma membrane, respectively. The SP22 quantification by FITC immunostaning analysis was no correlated with any of the sperm parameters. These results showed that study of the SP22 protein in ram spermatozoa can bring important information about the reproductive capacity of these animals. Nevertheless, studies that correlate the SP22 levels with in vivo and/or in vitro fertility rate are necessary for validation of this protein as a fertility biomarker in this species / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Wilma De Grava Kempinas / Resumo: A infertilidade afeta aproximadamente 15% dos casais em idade reprodutiva, sendo o homem responsável por cerca da metade dos casos. A diminuição da fertilidade masculina é devido a uma variedade de condições que incluem malformações congênitas, distúrbios genéticos e endócrinos, doenças infecciosas e inflamatórias, disfunção sexual e estilo de vida. A proteína espermática SP22 (sperm protein, 22kDa) tem demonstrado ser um biomarcador de fertilidade masculina, visto que, em ratos, está bem estabelecido que sua concentração, em extratos de espermatozoides da cauda epididimária, se correlaciona com a fertilidade desses gametas. No entanto, para incorporar essa proteína como um biomarcador em estudos epidemiológicos e clínicos são necessários dados quantitativos em humanos. Assim, o presente estudo teve por objetivos padronizar a técnica de quantificação e imunolocalização da proteína espermática SP22, investigar possíveis correlações entre parâmetros seminais convencionais e funcionais, de homens férteis e inférteis, com a concentração dessa proteína e avaliar o seu potencial preditivo como um biomarcador, não invasivo, de fertilidade. Para tanto foram realizados dois estudos observacionais: um do tipo caso-controle e outro do tipo seccional. O estudo caso-controle foi desenvolvido em amostras seminais de 44 voluntários da cidade de Botucatu e região, com idade entre 20 a 50 anos, que foram agrupados de acordo com a fertilidade: férteis (um ou mais filhos) e inférteis. Já o estu... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Infertility affects approximately 15% of couples in reproductive age and 50% of the cases are directly related to man. The decrease in male fertility is due to several conditions including congenital malformations, genetic and endocrine disorders, infectious and inflammatory diseases, sexual dysfunction and lifestyle. Sperm protein SP22 (22kDa) has been shown to be a male fertility biomarker since, in rats, it is well established that its concentration, in sperm extractions from the epididymal tail, correlates with the fertility of these gametes. However, to incorporate this protein as a fertility biomarker in epidemiological and clinical studies, quantitative data are required in humans. Thus, the present study aimed to standardize the SP22 quantification and immunolocalization technique, investigate possible correlations among conventional and functional seminal parameters of fertile and infertile men with the concentration of this protein and to evaluate its predictive potential as a non-invasive fertility biomarker. Therefore, two observational studies were performed: one case-control type and the other sectional type. The case-control study was carried out on 44 volunteers’s seminal samples from Botucatu city and region, aged between 20 and 50 years, who were placed according to fertility: fertile (one or more children) and infertile. The sectional study was carried out on 12 patients’s attendend by the Human Reproduction Center of the Botucatu Medical School – UNESP, al... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor