La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative rare, qui affecte les neurones GABAergiques moyens épineux (MSN) du striatum. Actuellement aucun traitement ne permet de guérir cette pathologie. Un essai clinique pilote, fondé sur la greffe intracérébrale de tissus fœtaux humains, a permis de remplacer les cellules lésées et de corriger certains symptômes. Néanmoins, la logistique nécessaire pour accéder à ces cellules limite cette forme de thérapie cellulaire à un nombre de patients restreint. Il est nécessaire d’identifier une source alternative de cellules capables de remplacer efficacement les tissus fœtaux. Les cellules souches embryonnaires humaines (hES) possèdent deux propriétés essentielles, l’autorenouvellement et la pluripotence, qui en font des candidats intéressants. L’objectif de notre étude a été d’évaluer le potentiel thérapeutique de ces cellules pour la thérapie cellulaire de la MH. Nous avons élaboré un protocole permettant la production, in vitro, de progéniteurs striataux capables de se différencier en MSN, à partir de cellules hES. Une fois greffés dans un striatum lésé de rat, ces progéniteurs peuvent survivre et se différencier en neurones MSN. Ces expériences de xénogreffes ont d’autres parts révélés la présence de cellules neurales prolifératives persistantes. L’ensemble de nos résultats démontre que les cellules hES constituent une source cellulaire alternative pertinente pour la thérapie cellulaire de la MH. Cependant, ils soulignent la nécessité de mettre en place des mesures spécifiques pour contrôler la prolifération in vivo des greffons issus de cellules hES, avant d’envisager toute application clinique. / Huntington’s disease (HD) is a neurodegenerative monogenic disorder resulting primarily in loss of GABAergic medium spiny striatal neurons (MSN). There is no known treatment to cure this pathology. Recent clinical trials consisting in transplanting human fetal tissue into the striatum of HD patients resulted in the substitution of lost cells and lead to functional benefits. However, application of this treatment to a large number of patients is restricted because the source and the processing of fetal cells are limiting factors. Thus, it is necessary to identify an alternative source of cells suitable to replace efficiently fetal tissue. Human embryonic stem (hES) cells, because they are self-renewable and pluripotent, are prime candidates. The aim of our work was to evaluate the therapeutic potential of hES cells for cell therapy of HD. We have designed a protocol to direct the differentiation of hES cells toward a striatal neuronal fate. This protocol allows the production from hES cells of striatal progenitors that are able to differentiate in MSN in vitro. Once transplanted into the lesioned striatum of rats these progenitors can survive and differentiate in MSN. On the other hand this xenografting experiments revealed that grafted cells have an extensive proliferation capacity. All the in vitro and in vivo data demonstrate that hES cells differentiation can be efficiently direct to a cell population relevant for cell therapy of HD. However these results underlines specific precautionary action on the path to the clinic, allowing for blocking cells proliferation if need be.

The extracellular responses of neurons in the corpus striatum following single pulse stimulation of the substantia nigra or dorsal raphe nucleus were investigated in urethane anaesthetized rats, nigral stimulation at low intensities (10 v) evoked single large amplitude spikes while higher intensities (10 to 20 v) evoked, in addition, a high frequency burst of small amplitude spikes or waves. Spontaneous large spikes, or those induced by the administration of glutamate, were inhibited by nigral stimulation. The onset of inhibition coincided with the onset of the burst. If the burst was prevented, inhibition no longer occurred. Neither the inhibitory nor the burst response evoked by nigral stimulation was influenced by iontophoretically or systemically administered antagonists of dopamine or by chemical lesions of the dopaminergic neurons of the nigrostriatal pathway. However the excitation of large units by nigral stimulation was reversibly blocked by dopamine antagonists. Stimulation of the dorsal raphe nucleus produced inhibition of spontaneously active striatal neurons. No excitatory response was ever observed. HEP injected into the striatum was transported to cells in the dorsal raphe nucleus and injection of tritiated leucine into the dorsal raphe nucleus produced significant transport of radio labelled protein to the caudate nucleus. It is concluded that the burst response is produced by excitation of striatal interneurons through collaterals of the striatonigral pathway which are intrinsic to the nucleus. Nigral stimulation causes an antidromic activation of the axon and a subsequent orthodromic activation of its collaterals. The interneurons activated by this "axon reflex" are inhibitory in function. It is further concluded that the dopaminergic neurons of the nigrostriatal tract make excitatory synaptic contact with striatal neurons in the central region of the nucleus. At least some of these target neurons project, in turn, to the globus pallidus. / Medicine, Faculty of / Cellular and Physiological Sciences, Department of / Graduate

DCLK3 (Doublecortin-like kinase 3) est une protéine kinase neuronale enrichie dans le striatum et dans le gyrus denté. L’expression de DCLK3 est nettement diminuée dans le cerveau des patients atteints de la maladie de Huntington (MH). Cependant, son rôle reste pour l’instant inconnu. Le laboratoire avait précédemment montré que DCLK3 pouvait jouer un rôle neuroprotecteur, en particulier dans différents modèles de la MH. En effet, la surexpression de Dclk3 dans le striatum produit un effet neuroprotecteur contre la toxicité de l’huntingtine mutée (Httm) et améliore les déficits moteurs dans les modèles murins de la MH (knock-in avec 140 répétitions de CAG). Nos résultats récents ont aussi montré que DCLK3 était localisée dans les noyaux des neurones et pourrait réguler la transcription par un mécanisme épigénétique. Le but de la présente étude a été de mieux comprendre le rôle de DCLK3 dans le cerveau. Pour cela, nous avons produit des souris avec des sites LoxP dans le gène Dclk3 (Dclk3flox/flox). Nous avons d’abord croisé ces souris avec les souris CMV-cre pour obtenir des souris constitutivement déficientes en Dclk3 et ceci dans l’ensemble de l’organisme. Nos études comportementales portant sur la mémoire, l’anxiété et les performances motrices, n’ont révélé aucun déficit majeur dans le phénotype. En accord avec cette observation, l’analyse structurale des cerveaux des souris KO Dck3 par histologie et IRM n’a pas révélé d’atteinte notable par rapport aux animaux témoins. Cependant, le profil des métabolites des mâles à 6 mois était légèrement mais significativement perturbé. Nous avons également croisé les souris Dclk3flox/flox avec des souris Rgs9-cre pour avoir une délétion de Dclk3 uniquement dans le striatum. Aucun déficit moteur n’a été observé dans ces souris. De manière intéressante, l’injection d’AAV-cre dans l’hippocampe des souris adultes Dclk3flox/flox tend à créer des déficits de mémoire au test de la piscine de Morris. L’ensemble de nos résultats indique un rôle de DCLK3 dans la plasticité synaptique dans l’hippocampe et suggère que la perte de DCLK3 dans la MH contribuerait aux aspects cognitifs de la maladie. Ainsi, à terme, la signalisation impliquant DCLK3 pourrait constituer une cible thérapeutique intéressante pour améliorer certains processus neurodégénératifs. / DCLK3 (Doublecortin-like kinase 3) is a neuronal kinase enriched in the striatum and in the dentate gyrus of the hippocampus. DCLK3 expression is markedly reduced in the brain of Huntington’s disease (HD) patients. However, its role remains unknown. The laboratory previously showed that DCLK3 could play a neuroprotective role, specifically in different HD models. The overexpression of Dclk3 in the striatum produces neuroprotection against mutant huntingtin (mHtt) toxicity and ameliorates motor deficits in rodent models of HD (knock-in mice with 140 CAG repeats). Our recent results indicate that DCLK3 is localized in the nucleus of neurons and may play a role in transcription through epigenetic mechanisms. Here, we aim at investigating further the role of DCLK3 in the brain. To do so, we generated mice with loxP sites in the Dclk3 gene (DCLK3flox/flox). We first crossed them with CMV-Cre mice to obtain constitutive knockout Dclk3 mice in the whole body. Our behavioral study on memory, anxiety and motor phenotype show no obvious deficit. Likewise, structural analysis in the brain of Dclk3 KO mice in histology and MRI did not highlight any deficit compared to control mice. However the metabolite profile in males at 6 months was slightly but significantly disturbed. Dclk3flox/flox mice were also crossed with Rgs9-cre mice to have Dclk3 deletion in the striatum only. No motor deficits were observed in these mice. Interestingly, the injection of AAV-Cre in the hippocampus of adult Dclk3flox/flox mice tends to produce memory deficits in the water-maze test. These results indicate a potential role of DCLK3 in synaptic plasticity in the hippocampus and suggest that the loss of this protein in HD could contribute to cognitive aspects of the disease. In long term, the signaling involving DCLK3 may constitute an interesting therapeutic target to improve certain neurodegenerative processes.

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1 / Amanda Rosemary Pahng

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2001. / Härtill 5 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst. / Härtill 15 uppsatser.

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