Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carolinacolombellipacca_tese.pdf: 2227429 bytes, checksum: 4bcc12b8c06f6322170e32bfccfc8fa1 (MD5) Previous issue date: 2013-11-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Introduction. Arboviruses, arthropod-borne viruses, are frequently associated with human outbreaks and represent a serious health problem. The genus Flavivirus, which includes both the Yellow Fever Virus (YFV) and Saint Louis Encephalitis Virus (SLEV), are important pathogens that result in high morbidity and mortality rates worldwide. In Brazil, YFV has a sylvatic cycle and occurs annually, despite the efficiency of the vaccine. Saint Louis Encephalitis is an infectious illness that can cause acute fever caused by SLEV, which is widely distributed in the Americas. The emergence of SLEV became a serious concern after the first related outbreak in Brazil in 2006, in the city of Sao Jose do Rio Preto. There is no specific antiviral drug for these viruses, only supporting treatment that can alleviate the symptoms and prevent complications. The need to develop effective and safe antiviral drugs is indispensable for the treatment of these infections. Objective. The aim of this work was to identify new possible antiviral drugs against the arboviruses that can cause acute fever and encephalitis (YFV and SLEV) and to evaluate the capacity of inhibition of these compounds in ABR mice. Material and Methods. Plaque reduction assay, flow citometry, immunofluorescence and cellular viability were used to test the compounds in vitro. ABR mice were inoculated with YFV, and the biological samples were tested for the presence of the virus through the use of plaque reduction assay and qPCR. Neutralization assay was also performed. Results. Treated cells showed efficient inhibition of viral replication at concentrations that presented minimal toxicity to the cells. The assays showed that ftalyl-tiazole and fenoxytiosemicarbazone were more effective, and that they reduced viral replication by 60% and 75% for YFV and SLEV, respectively. The analysis also revealed that the ABR mice inoculated with YFV had histopathological alterations in the liver; however, the samples did not present viral title. Neutralization assay showed a high concentration of antibodies in the serum. Conclusion. The inhibitions of viral replication were confirmed through the use of some assays in vitro, and the effectiveness of the selected compounds show that they are an option in the treatment of these viruses. More detailed studies are needed to determine the mechanism of action of these molecules. The mice were found to have histopathological alterations, which indicates viral infection; however, they also presented with high concentrations of antibodies. More studies about animal models are necessary to make in vivo experiments. / Introdução: Os arbovírus, vírus transmitidos por artrópodes, são freqüentemente associadas a surtos em seres humanos e representam um problema sério de saúde pública. Os vírus pertencentes ao gênero Flavivirus, tais como vírus da Febre Amarela (YFV) e vírus da Encefalite de Saint Louis (SLEV), são importantes patógenos que podem causar alta taxa de morbidade e mortalidade no mundo. No Brasil, YFV é mantido em ciclo silvestre notificados anualmente, a despeito da segurança e eficiência da vacina. A encefalite de Saint Louis é uma doença infecciosa febril aguda causada pelo SLEV amplamente distribuída nas Américas. A emergência do SLEV passou a ser um fato preocupante no Brasil a partir da constatação do primeiro surto no país em 2006, na cidade de São Jose do Rio Preto. Não existe tratamento específico para estas viroses, somente tratamento de suporte para ajudar a aliviar os sintomas e prevenir complicações. Desta forma, há uma grande necessidade de que sejam desenvolvidos antivirais efetivos e seguros para o tratamento destas infecções. Objetivos: O objetivo deste trabalho foi identificar potenciais compostos antivirais contra os arbovírus causadores de doença febril aguda e encefalites (YFV e SLEV) in vitro e avaliar a capacidade de inibição da replicação viral dos compostos in vivo em camundongos ABR. Materiais e Métodos: Para tanto, foram realizados ensaios de redução de placas, citometria de fluxo, imunofluorescencia, bem como testes de viabilidade celular para as analises in vitro. Além disto, camundongos ABR foram inoculados com YFV e seus materiais biológicos testados para a presença de partículas virais por ensaio de redução de placas e qPCR. Adicionalmente, foi realizado ensaio de neutralização do soro dos animais. Resultados: Celulas tratadas com os compostos mostraram eficiente inibição da replicação viral em concentrações que apresentam baixa citotoxicidade. Os ensaios mostraram que derivados de ftalyl-tiazole e fenoxytiosemicarbazone foram os mais eficazes na ação antiviral, apresentando redução de 60% e 75% para YFV e SLEV, respectivamente. Camundongos ABR inoculados com YFV apresentaram alterações histológicas no fígado, entretanto, não foi constatado título viral nas amostras testadas. O ensaio de neutralização mostra altas concentrações de anticorpos no soro dos animais. Conclusões: A inibição da replicação foi comprovada por vários ensaios in vitro evidenciando as moléculas como potentes alternativas para o tratamento dos vírus. Mais estudos são necessários para a determinação do mecanismo de ação destas moléculas. Os camundongos apresentaram alterações histopatológicas sendo um indicativo de infecção, entretanto, apresentam altas taxas de anticorpos. Mais estudos sobre modelo animal são necessários para a realização de ensaios in vivo.

Submitted by Simone Souza (simonecgsouza@hotmail.com) on 2017-09-15T13:37:53Z No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Letícia Borges da Silva Heinen.pdf: 4369897 bytes, checksum: 2e00a8b07d093787dbdb2e23dd6ac34e (MD5) / Approved for entry into archive by Jordan (jordanbiblio@gmail.com) on 2017-09-19T12:59:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Letícia Borges da Silva Heinen.pdf: 4369897 bytes, checksum: 2e00a8b07d093787dbdb2e23dd6ac34e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-19T12:59:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Letícia Borges da Silva Heinen.pdf: 4369897 bytes, checksum: 2e00a8b07d093787dbdb2e23dd6ac34e (MD5) Previous issue date: 2014-03-28 / CNPq / O gênero Flavivirus, família Flaviviridae, alberga arbovírus como os vírus dengue (DENV) e da febre amarela, que possuem importância médica e são envolvidos em epidemias de doença febril em áreas urbanas e rurais em regiões tropicais e subtropicais. No Brasil, atualmente, o DENV e o vírus da encefalite de Saint Louis (SLEV) são os dois flavivírus circulantes em áreas urbanas mais frequentes. Desde a introdução e emergência dos diferentes sorotipos de DENV a partir da década de 1980, extensas epidemias de febre do dengue vêm sendo reladas por todo o país. O SLEV, anteriormente reconhecido apenas em ciclos enzoóticos e com pouca relevância médica no Brasil, tem sido implicado em casos de doença febril durante epidemia de dengue no sudeste do país. O objetivo deste estudo foi investigar a circulação de flavivírus em pacientes com doença febril aguda com suspeita de dengue em Mato Grosso (MT) em 2011 e 2012. Material e Métodos: 604 amostras de soro obtidas entre outubro de 2011 e julho de 2012 de pacientes com doença febril aguda suspeita de dengue com até cinco dias do início dos sintomas em MT foram submetidas à multiplex semi-nested RT-PCR para a pesquisa de flavivírus, como os quatro sorotipos de DENV, SLEV, vírus da febre amarela, do Oeste do Nilo, Rocio, Bussuquara, Iguape e Ilhéus. Amostras positivas foram testadas em pelo menos duas reações independentes de single-nested RT-PCR e submetidas a sequenciamento nucleotídico de região do gene da glicoproteína de envelope para análise filogenética. Resultados: Dentre os 604 pacientes, 315 (52,2 %) foram positivos para DENV-4, 24 (4,0 %) para DENV-1, 3 (0,5 %) para SLEV, 1 (0,2 %) para DENV-2 e 1 (0,2 %) para DENV-3. Todas as amostras eram de pacientes oriundos de áreas urbanas de 17 municípios de MT. Entre as amostras positivas, 9 eram co-infecções entre DENV-1/DENV-4, 1 entre DENV-2/DENV-4, 2 por SLEV/DENV-4 e 1 entre SLEV/DENV-1/DENV-4. Os demais flavivírus pesquisados não foram detectados. Amostras negativas para flavivírus totalizaram 273/604 (45,20 %). Discussão: A ocorrência das arboviroses na população geralmente é subestimada, devido a fatores como quadro clínico inespecífico, infecções inaparentes e ausência de diagnóstico diferencial. O DENV-4 foi introduzido no MT em 2012, responsável pela maior casuística nas cidades da Baixada Cuiabana. Co-infecções são frequentes quando há circulação hiperendêmica dos quatro sorotipos do DENV, situação já relatada no Brasil em Manaus e Rio de Janeiro em 2011. O SLEV foi detectado em pacientes de Cuiabá e Várzea Grande. Infecções por SLEV são primariamente inaparentes ou brandas. Em MT, espécies de Culex e outros vetores deste virus são amplamente dispersas. Como humanos são hospedeiros finais e apresentam baixa viremia, sua ocorrência é provavelmente subestimada. Conclusão: DENV-1 e DENV-4 foram os flavivírus identificados com maior frequência. Os quatro sorotipos do DENV foram detectados em Cuiabá e infecções esporádicas pelo SLEV foram identificadas em pacientes co-infectados com o DENV-4 ou o DENV-4/DENV-1 em Cuiabá e Várzea Grande, indicando que outros arbovírus podem circular silenciosamente durante epidemia de dengue em áreas urbanas em MT. / The genus Flavivirus, Flaviviridae family, comprises arboviruses such as the medical important dengue virus (DENV) and yellow fever virus, involved in febrile illness epidemics in urban and rural areas of tropical and subtropical regions. In Brazil, DENV and Saint Louis encephalitis (SLEV) virus are currently the two most important flaviviruses circulating in urban areas. Since the introduction and emergence of different DENV serotypes in the 1980´s, extensive dengue outbreaks have been reported throughout the country.SLEV, previously recognized only in enzootic cycles without medical relevance in Brazil, has been implicated to febrile illness etiology during dengue fever outbreaks in the Southeast region. The aim of this study was to investigate the circulation of flaviviruses in patients with acute febrile illness suspected of harboring dengue in Mato Grosso (MT) between 2011 and 2012. Material and Methods: 604 serum samples obtained between October 2011 and July 2012 from patients with acute febrile illness suspected of dengue lasting less than 5 days in MT were subjected to multiplex semi-nested RT-PCR for flaviviruses, including all four serotypes of DENV, SLEV Yellow Fever, West Nile, Rocio, Bussuquara, Iguape and Ilheus viruses. Positive samples were tested at least twice in independent single-nested RT-PCR reactions and subjected to nucleotide sequencing of the envelope glycoprotein (E) gene region for phylogenetic analysis. Results: Among 604 patients, 315 (52.2 %) were positive for DENV-4, 24 (4.0 %) for DENV-1, three (0.5 %) for SLEV, one (0.2 %) for DENV-2 and one (0.2 %) for DENV-3. All patients are residents in urban areas of 17 cities of MT. Among then, 9 were co-infections among DENV-1/DENV-4, 1 between DENV-2/DENV-4, two between SLEV/DENV-4 and one with SLEV/DENV-1/DENV-4. The other flaviviruses were not detected. Negative samples for flavivirus totaled 273/604 (45.20 %). Discussion: The occurrence of arboviruses in the population generally is underestimated, probably due to unapparent infection or unspecific clinical presentation, associated to the absence of differential diagnosis. The DENV-4 serotype was introduced in MT in 2012, responsible for the largest number of cases in Cuiabá and Varzea Grande. Co-infections are common when hiperendemic circulation of all four serotypes of DENV is observed. This situation has already been reported in Brazil in Manaus and Rio de Janeiro cities in 2011. Three patients were positive for SLEV in Cuiaba and Várzea Grande. SLEV infections are primarily mild or unapparent. In MT, species of Culex and other vectors are widely dispersed. As humans are final hosts and, therefore, present low titer viremia, the occurrence of SLEV in the population is probably underestimated. Conclusion: DENV-1 and DENV-4 were the most frequently flaviviruses identified. The four DENV serotypes were detected in Cuiaba and sporadic SLEV infections were identified in patients co-infected with DENV-4 or DENV-1/DENV-4 in Cuiaba and Várzea Grande, indicating that other arboviruses may circulate silently during dengue epidemics in urban areas of MT.