Thesis (Ph.D.) - University of Glasgow, 2008. / Ph.D. thesis submitted to the Department of Infection and Immunity, Faculty of Biomedical and Life Sciences, University of Glasgow, 2008. Includes bibliographical references. Print version also available.

Thesis (Ph. D.)--University of Hong Kong, 1986.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2002. / Härtill 4 uppsatser.

Thesis (M.S.)--University of Alabama at Birmingham, 2008. / Description based on contents viewed May 30, 2008; title from title screen. Includes bibliographical references (p. 62-66).

Thesis (Ph.D.) - University of Queensland, 2003. / Includes bibliography.

Broiler flocks become frequently asymptomatically contaminated by the enteric bacteria Salmonella sp. and Campylobacter sp. which are human pathogens. Among the strategies developed at farm level to reduce the incidence of these pathogens, some lactic acid bacteria have been shown to be interesting because of their antimicrobial activity and their stimulatory properties on the immune system of poultry. The aim of this thesis was to select bacteria with antagonistic activity against Salmonella or Campylobacter, and to improve their inhibitory effect by the combination with enzymes of polysaccharidase type. The first step of the thesis was an epidemiological study carried out in the Walloon region in order to determine the contamination way of broilers by Campylobacter in free range production. Results showed that the major way of contamination is the open-air range to which the animals have access during the rearing period. A preventive treatment of the open-air range and the straw litter with an antagonistic strain in combination with an enzyme seems thus to be suitable in this case. The second step of the work aimed at the selection of a xylanase for using as a dietary additive in combination with an antagonistic bacterial strain against Salmonella. Four xylanases were studied in vivo for their effect on growth performances of broiler chickens. Diet supplementation with enzyme led to an increased final body weight and daily weight gain (P < 0.05), without difference according to the bacterial or fungal origin of the xylanase. The Belfeed B1100MP xylanase, which is commercialized in he Walloon region, was selected in order to develop a probiotic-xylanase feed additive. The purpose of the third part was to select a bacterial strain with antagonistic activity against Campylobacter for applying on open-air range and broiler litter. An in vitro screening of 12 lactic acid bacteria was realised using a co-culture assay with a growth medium based on straw and dehydrated poultry excreta, supplemented with different cellulase concentrations. Lactobacillus pentosus and Enterococcus faecium showed inhibitory effect against Campylobacter without enzyme which was intensified by cellulose from 200 ppm. Finally, the effect of dietary supplementation with a L. plantarum strain combined with the Belfeed B1100MP (PE treatment) on growth performance, microflora, and faecal Salmonella Typhimurium concentrations, was studied with experimentally infected broiler chickens. The PE diet allowed to partially overcome the negative effects associated with the infection on growth performance and microflora, and to significantly reduce faecal Salmonella concentration.

6 Zusammenfassung In-vitro- und In-vivo-Studien zur Wirksamkeit von Eigelbantikörpern gegen Salmonella Enteritidis Michael Gürtler Institut für Lebensmittelhygiene der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Infektionen mit Salmonellen gehören weltweit zu den wichtigsten von Tieren auf den Menschen übertragbaren Erkrankungen. Anteilmäßig besitzen dabei die durch kontaminierte Lebensmittel, insbesondere Eier und Eiprodukte, hervorgerufenen Infektionen die größte Bedeutung. Dabei ist nach wie vor Salmonella Enteritidis (S. Enteritidis) in den Geflügelbeständen vorherrschend. Als Möglichkeit zur Bekämpfung von Salmonella-Infektionen bietet sich die passive Immunisierung der Legehennen durch orale Applikation von Eigelbantikörpern an. Bereits mehrfach wurde das Verfahren der Verabreichung von antikörperhaltigem Volleipulver zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionskrankheiten, vor allem bei Kälbern und Ferkeln, getestet. Untersuchungen über die Einsatz solcher Eigelbantikörper mit dem Ziel der Zurückdrängung von Salmonellen in Legehennenbeständen sind bisher nicht bekannt geworden. Ziel dieser Arbeit war es, im Rahmen von In-vitro- und In-vivo-Studien den Einfluss von Eigelbantikörpern auf Vermehrung und Vorkommen von S. Enteritidis bei Legehennen zu untersuchen. Im Versuchskomplex A wurde in vitro ermittelt, ob Anti-S. Enteritidis-Antikörper im Eidotter in der Lage sind, die Vermehrung von Salmonellen zu hemmen. Im Versuchskomplex B wurde untersucht, ob es gelingt, durch die orale Verabreichung von Anti-S. Enteritidis-Eigelbantikörpern die Kontaminationsrate der gelegten Eier mit Salmonellen bei experimentell infizierten Legehennen zu beeinflussen. Im Versuchskomplex C sollte geprüft werden, ob Eigelbantikörper die Fähigkeit besitzen, das Adhäsions- und Invasionsvermögen von Salmonellen an bzw. in Epithelzellen einer permanenten Zelllinie zu beeinflussen. Im Rahmen von Versuchskomplex A wurden Legehennen mit einem inaktivierten S. Enteritidis-Stamm parenteral hyperimmunisiert, um hohe Konzentrationen an Antikörpern im Dotter zu induzieren. Die Eidotter wurden mit zwei S. Enteritidis-Stämmen in drei verschiedenen Kontaminationsdosen beimpft und das Vermehrungsverhalten durch Keimzählung als Generationszeit ermittelt. Im Versuchskomplex B wurden in zwei Infektionsversuchen Anti-S. Enteritidis-Eigelbantikörper in Form von Volleipulver in einer Menge von 3 g pro Tier und Tag über das Futter an experimentell mit S. Enteritidis infizierte Legehennen verabreicht und die Ergebnisse mit denen einer Kontrollgruppe ohne Volleipulver verglichen. Die gelegten Eier wurden getrennt nach Eischale, Eiklar und Eigelb auf den Infektionsstamm untersucht. Im Versuchskomplex C wurden die Adhäsivität und Invasivität verschiedener Salmonella-Stämme an bzw. in Epithelzellen bei An- bzw. Abwesenheit von Anti-S. Enteritids-Eigelb- bzw. -Serumantikörpern unter Verwendung einer permanenten Dünndarmepithelzelllinie von der Ratte (IEC-6) nach Inkubation durch Keimzählung überprüft. Die Ergebnisse in Versuchskomplex A zeigten, dass Eigelbantikörper nicht in der Lage sind, im Eigelb befindliche Salmonellen in ihrer Vermehrung zu hemmen oder gar abzutöten. Die Infektionsversuche im Versuchskomplex B ergaben, dass bei einer Infektionsdosis von 2x109 koloniebildenden Einheiten (kbE)/Tier die Salmonella-Kontaminationsrate der Eier durch das antikörperhaltige Eipulver nicht gesichert verändert wird. Dagegen konnte beim Einsatz einer solchen von 2x108 kbE/Tier eine Wirkung des antikörperhaltigen Eipulvers auf die Kontamination der einzelnen Eikompartimente nachgewiesen werden. Dabei wurden in der Versuchsgruppe mit 13,3 % gesichert weniger Eier als positiv detektiert als in der Kontrollgruppe mit 29,4 % (p &#8804; 0,001), wobei mindestens in einem der drei Kompartimente Eischale, Eiklar oder Eigelb Salmonellen nachweisbar waren. In der Versuchsgruppe wies jedes Salmonella-positive Ei auch Keime auf der Eischale auf. In der Kontrollgruppe waren mit 29,9 % signifikant mehr Eischalen positiv als in der Versuchsgruppe mit 13,3 % (p &#8804; 0,001). Beim Eiklar ließ die geringe Nachweisrate sowohl in der Versuchs- als auch in der Kontrollgruppe eine statistische Beurteilung des Eipulvereinflusses nicht zu. Aus dem Eidotter wurden in der Versuchsgruppe bei 0,6 % der Eier Salmonellen isoliert, während es in der Kontrollgruppe mit 2,4 % signifikant mehr waren (p &#8804; 0,05). Die Ergebnisse des Versuchskomplexes C zeigten, dass Volleiantikörper und Serumantikörper die Invasion von S. Enteritidis in intestinale Epithelzellen serovarspezifisch vermindern können. Insgesamt lassen die Ergebnisse die Schlussfolgerung zu, dass bei einer oralen Verabreichung von Volleipulver mit S. Enteritidis-spezifischen Antikörpern an Legehennen bei einer Infektionsbelastung von 2x108 kbE/Tier mit einer gesicherten Reduzierung des Vorkommens von Salmonellen im Nahrungsmittel Ei im Vergleich zu Tieren ohne Zugabe von Eipulver zu rechnen ist. / In vitro and in vivo studies on the efficiency of egg yolk antibodies against Salmonella Enteritidis Michael Gürtler Institute of Food Hygiene, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig Infection of humans by Salmonella are among the most important zoonotic diseases. Contaminated food, especially eggs and egg products, represents the highest risk. Still Salmonella Enteritidis (S. Enteritidis) dominates, a serovar that occurs especially in poultry flocks. A possibility to combat Salmonella infection is the passive immunisation of laying hens by oral administration of egg yolk antibodies. The application of antibody-containing full-egg powder against bacterial diseases was tested previously especially on calves and piglets. The suitability of administration of egg-yolk antibodies to protect laying-hens flocks against Salmonella was not tested previously. It was the aim of the study to investigate the influence of egg-yolk antibodies of S. Enteritidis in egg laying hens by in-vivo and in-vitro studies. In part A, we investigated the influence of anti-S. antibodies in egg yolk on the multiplication of Salmonella in vitro. In part B, the impact of oral application of anti-Salmonella full-egg antibodies on the in-vivo Salmonella-contamination rate of eggs layed by experimentally infected hens was investigated. In part C the ability of egg-yolk antibodies and serum antibodies were tested with regard to the rate of adhesion and invasion of Salmonella on or in epithelial cells of a permanent cell culture line (two major pathogenic mechanisms). In part A, laying hens were hyper-immunised parenterally by an inactivated S. Enteritidis strain to induce a high concentration of antibodies in the egg yolk. Egg yolk was than inoculated with two S. Enteritidis strains in three different contamination doses. Multiplication of Salmonella cells was detected by cell counts and calculated as generation time. In part B, laying hens were immunised passively with anti-Salmonella egg yolk antibodies (by feeding 3 g of full egg powder per day and per animal) and the effects were compared with a control group without full-egg powder. The inoculation strain of S. Enteritidis was detected on egg shell, in egg white and in egg yolk separately. In part C, a suspension of S. Enteritidis was added to a permanent duodenal epithelial cell line of the rat (IEC-6). After incubation the adhesivity of Salmonella strains and their ability to invade these cells in the presence or in the absence of anti-S. Enteritidis egg yolk and serum antibodies, respectively, was detected by cell count. The results of part A demonstrated that egg-yolk antibodies are not able to inhibit multiplication of Salmonella in egg yolk. Experiments of part B showed that the Salmonella contamination rate of eggs could not be influenced by antibody-containing egg powder at a Salmonella infection dose of 2x109 colony forming units (cfu)/animal, whereas the antibody-containing egg powder at an Salmonella infection dose of 2x108 cfu/animal proved effective (i.e. contamination rate of egg components was reduced). In the experimental group 13.3 % of the eggs were Salmonella positive, which was significantly different from 29.4 % in the control group (p &#8804; 0,001). At least in one of the three compartiments egg shell, egg white or egg yolk Salmonella was detectable. In the experimental group Salmonella could be isolated from the shell of every positive egg. The rate of Salmonella isolation from egg shells of the control group was significantly higher those in the experimental group (p &#8804; 0,001). With regard to egg white, the low number of Salmonella detections in both groups did not allow statistical evaluation of the effect of full-egg powder. From egg yolk of the experimental group in 0.6 % of the eggs Salmonella could be isolated which was significantly lower than the detection rate in the control group with 2.4 % (p &#8804; 0,05). The results of part C demonstrated that full-egg antibodies and serum antibodies can inhibit the serovar-specific invasion of S. Enteritidis into intestinal epithelial cells. As a whole, the results support the conclusion that oral administration of full-egg powder containing S. Enteritidis specific antibodies to egg-laying hens exposed to a administration of 2x108 cfu/animal reduce the occurrence of Salmonella in the egg compared to eggs of animals without egg powder administration.

Ziel dieser Arbeit war es, die porzine Salmonelleninfektion unter Berücksichtigung der drei beim Schwein am häufigsten vorkommenden Salmonella-Serovaren anhand des klinischen Bildes, der quantitativen und qualitativen Erregerausscheidung, des Kolonisationsverhaltens, der Serokonversion bezüglich der unterschiedlichen Immunglobulin-Isotypen IgA, IgG und IgM sowie durch die Labordiagnostik näher zu charakterisieren. Bisherige Studien an Schweinen wurden überwiegend mit S. Typhimurium durchgeführt, weitere Serovare sind bisher nur unzureichend erforscht worden, obwohl sie ebenfalls zoonotisches Potential besitzen, aber vergleichsweise nur als gering virulent und kaum invasiv gelten. Die Durchführung dieser Studie erfolgte mit 6 Wochen alten Absatzferkeln, welche nach einem bereits etablierten Modell mit den jeweiligen Salmonella-Serovaren infiziert wurden. Nach dem Challenge wurden die Tiere täglich klinisch untersucht und es wurden Kotproben zur qualitativen und quantitativen Erregerausscheidung entnommen. Parallel dazu wurden im Abstand von zwei bzw. drei Tagen Blutproben für ein Differentialblutbild, Blutchemie sowie für die serologische Untersuchung gewonnen. Nach einer Woche wurden die Tiere getötet und es wurden insgesamt 13 sterile Organproben gewonnen, um eine Aussage über das Kolonisationsverhalten treffen zu können. Die Infektionsversuche zeigten, dass nach oraler Verabreichung von 1x1010 KbE die Tiere der mit S. Infantis infizierten Gruppe, entgegen den Erwartungen, die stärksten klinischen Symptome einer Salmonellose mit Diarrhoe, Fieber, Anorexie sowie reduziertem Allgemeinbefinden zeigten. Nach dem Challenge schieden alle Tiere der drei Infektionsgruppen den jeweiligen Challengestamm zu allen Zeitpunkten des Experimentes aus. Dabei war die quantitative Erregerausscheidung bei der S. Infantis-Infektionsgruppe stets am höchsten, bei der S. Derby-Gruppe stets am geringsten. Die Kolonisationsrate in den untersuchten Organproben war bei der S. Derby-Gruppe mit insgesamt 80,7 % am höchsten, gefolgt von der S. Typhimurium DT104-Gruppe mit 80,3 %. S. Infantis wurde mit einer Kolonisationsrate von 73,6 % am seltensten isoliert. Bei der quantitativen bakteriologischen Untersuchung der Organproben wurden bei der S. Typhimurium DT104-Gruppe die meisten Salmonellen vorwiegend aus den lymphatischen Organen isoliert, während bei der S. Infantis-Gruppe die Salmonellenbelastung in den essbaren Organen am höchsten war. Die serologische Untersuchung mittels isotypspezifischen ELISA offenbarte für IgG einzig bei der S. Typhimurium DT104-Gruppe einen deutlichen Anstieg der spezifischen Antikörperaktivität, während für IgM die höchste Aktivität bei der S. Derby-Gruppe gemessen wurde. Für IgA fand bei allen Tieren der drei Infektionsgruppen keine Serokonversion statt. Im Differentialblutbild stellten sich bei allen Tieren der drei Infektionsgruppen nach dem Challenge mit einer Leukozytose, einer Linksverschiebung und einer Monozytose typische Anzeichen einer bakteriellen Infektion ein. Die blutchemische Untersuchung offenbarte besonders bei der S. Typhimurium DT104-Gruppe und der S. Infantis-Gruppe größere Verluste von Natrium und Chlorid nach dem Challenge, während es bei der S. Derby-Gruppe zu keinen Elektrolytverschiebungen im Plasma kam. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deutlich, dass S. Infantis auch beim Schwein schwere klinische Verläufe verursachen kann und auch in essbaren Organen kolonisiert. Diese invasiven Isolate stellen neben den wirtschaftlichen Verlusten ein großes Verbraucher- schutzproblem dar. Obwohl die Prävalenz von S. Infantis beim Schwein nicht so hoch wie die von S. Typhimurium ist, so sollte diese Serovar in Zukunft besonders beobachtet werden. Für S. Derby wurde trotz schwacher Virulenz die höchste Kolonisationsrate nachgewiesen, was deren Potential, klinisch inapparente Salmonelleninfektionen auszulösen, deutlich macht. Somit belegt diese Arbeit, dass S. Infantis und S. Derby für den Menschen sehr bedeutsam sein können und daher ein entsprechendes Monitoring erfordern.