Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur. / La formation réduite de l'acide mévalonique, due à l'inhibition de l'HMG-CoA réductase suite à un traitement aux statines, peut entraîner une baisse des niveaux d'ubiquinone. L'ubiquinone, membre obligatoire de la chaîne de transfert d'électrons, joue un rôle important dans la bioénergie mitochondriale, et on lui accorde un rôle antioxydant. L'ubiquinone serait le seul antioxydant liposoluble synthétisé de novo. Une baisse des niveaux d'ubiquinone pourrait expliquer certains effets nocifs caractéristiques tels les myopathies. Suite à des publications indiquant que les statines pouvaient diminuer les niveaux d'ubiquinone, nous avons entrepris de comparer les effets de deux statines, la lovastatine (liposoluble) et la pravastatine (hydrosoluble) sur les niveaux d'ubiquinone sanguins et tissulaires. Nous avons comparé ces deux statines en raison de leur distribution différente dans les tissus. Pour mesurer les niveaux d'ubiquinone, nous avons mis au point une méthode de chromatographie liquide de haute résolution (HPLC) sensible, reproductible et précise. Ensuite, dans une première étude, nous avons comparé les effets de la lovastatine et de la pravastatine, chez le rat, (à des doses de 0, 20, 40 ou 80 mg/kg/jour) sur les niveaux d'ubiquinone-9 et 10 dans le sang, le myocarde, le muscle et le foie. La lovastatine et la pravastatine ont diminué les concentrations d'ubiquinone dans le myocarde, le muscle et le sang. L'effet plus prononcé de la lovastatine a été attribué à ses concentrations tissulaires plus élevées. Seul l'effet observé avec la lovastatine était relié à la dose. Puisque le rat possède une immense capacité pour compenser l'inhibition de l'HMG-CoA réductase par les statines, ce qui pourrait expliquer l'absence d'effet des statines sur les lipides plasmatiques dans notre première étude, nous avons reproduit cette expérience dans un modèle qui reflète mieux la réponse chez l'humain, le hamster. Il importait de vérifier si une baisse des niveaux tissulaires d'ubiquinone serait accompagnée par une baisse dans la capacité des tissus à résister à un stress oxydatif. Nous avons émis l'hypothèse selon laquelle cette baisse se traduirait par une augmentation des produits de peroxydation. Nous avons choisi de mesurer le 4-hydroxynonénal (HNE), produit de peroxydation endogène le plus cytotoxique, et le 1,4-dihydroxynonène (DHN), un métabolite important, par une méthode de chromatographie en phase gazeuse et spectroscopie de masse (GCMS). Dans cette deuxième étude, nous avons comparé les effets de la lovastatine et de la pravastatine, à une dose de 20 mg/kg/jour, sur les niveaux d'ubiquinone, de HNE et de DHN, chez le hamster hypercholestérolémique. Nous avons mesuré le HNE et le DHN liés aux protéines, par une liaison thioéther, dans le myocarde pour les raisons suivantes : i) c'est un marqueur de la peroxydation lipidique; ii) le myocarde est plus sensible aux dommages oxydatifs en raison de ses défenses antioxydantes différentes des autres tissus; iii) le HNE induit des dommages aux cardiomyocytes; et iv) c'est dans cet organe que nous avons observé les baisses d'ubiquinone les plus significatives. Les faibles niveaux d'ubiquinone sont associés à plusieurs maladies coronariennes. Les résultats de cette deuxième étude ont confirmé que les deux statines diminuaient les niveaux d'ubiquinone de façon similaire. Les résultats chez le rat peuvent être attribués au comportement lipidique particulier et spécifique d'espèce. Chez le hamster, plutôt que l'augmentation anticipée des niveaux de HNE, nous avons observé une baisse qui était similaire pour les deux statines. Contrairement à notre hypothèse de départ, un traitement avec des statines n'entraînerait pas une augmentation de la peroxydation lipidique dans le myocarde. Toutefois, puisque dans nos conditions expérimentales, le myocarde n'a pas été soumis à un stress oxydatif aigu, nous ne pouvons exclure la possibilité d'une augmentation des niveaux de HNE conséquente à un stress oxydatif. Cette baisse des niveaux de HNE lié aux protéines pourrait s'expliquer de deux façons : (i) la pravastatine et la lovastatine ont une activité antioxydante qui pourrait compenser pour la baisse des niveaux d'ubiquinone et (ii) dans le myocarde, l'ubiquinone exercerait une activité pro-oxydante. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse montrent que la lovastatine et la pravastatine diminuent les niveaux d'ubiquinone dans le myocarde, le muscle squelettique et le sang. Dans le myocarde, cette baisse d'ubiquinone n'est pas associée à une augmentation du HNE ou du DHN, des produits de la peroxydation lipidique. Il n'y aurait donc aucun avantage à utiliser la lovastatine ou la pravastatine chez des patients ayant des conditions pathologiques préexistantes associées à des niveaux d'ubiquinone diminués dans le myocarde. En outre, les résultats de cette thèse évoquent la possibilité (i) d'un autre mécanisme par lequel ces deux statines exerceraient leurs effets bénéfiques, soit par une activité antioxydante et, (ii) d'une activité pro-oxydante de l'ubiquinone dans le myocarde.

Doctorat en sciences pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Doctorat en sciences pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Tuberculosis is an infectious disease caused by the pathogen Mycobacterium tuberculosis which is still a public health threat. Due to the appearance of multidrug-resistant M. tuberculosis strains, it is urgent to find new drugs to fight against tuberculosis, especially against the extensively drug resistant tuberculosis. The unique impermeable mycobacteria cell wall, rich in lipids, is a key barrier to anti-tuberculosis drug uptake. One of these lipids, the phthiocerol dimycocerosate (PDIM), is related to mycobacteria virulence, drug resistance and mycobacteria cell wall integrity. Therefore, research focusing on PDIM biosynthesis potentially provides a new route for the development of new anti-tuberculosis drugs.In this context, we investigated two proteins, the thioesterase TesA and the chaperonin GroEL1, that are involved in the PDIM biosynthesis, and studied their structural and functional properties. Firstly, using various substrates, we demonstrated that TesA displays thioesterase and esterase activities and showed that TesA undergoes substrate-dimerization. A new TesA inhibitor, methyl arachidonyl fluorophosphonate (MAFP), was identified that irreversibly binds to the TesA catalytic serine residue. Furthermore, MAFP can increase the susceptibility to vancomycin in a TesA inhibition dependent manner while it can also affect the M. bovis BCG biofilm formation through broader action mechanisms. Secondly, we observed that the mycobacterial GroEL1, unlike the other chaperonins, E. coli GroEL and mycobacteria GroEL2, increases copper tolerance. We demonstrated that the copper can specifically bind to the GroEL1 with a strong affinity for its natural carboxyl terminal histidine-rich region. The classical feature of chaperonins is also increased in the presence of copper. These results suggest that GroEL1 could help mycobacteria to tolerate high bactericidal metal concentrations during macrophage infection, potentially through a metal storage mechanism. Last but not the least, we identified new mycobacterial GroEL1 and GroEL2 activities. In one word, the biochemical properties of two essential proteins, GroEL1 and TesA, involved in PDIM biosynthesis in M. tuberculosis have been further elucidated. The implications of these results are important not only to develop new antituberculous drugs but also to fight drug resistance. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’importance de la prévalence des maladies cardio-vasculaires dans les pays industrialisés fait de l’amélioration de nos connaissances par rapport à leur physiopathologie, un des challenges les plus importants des années à venir. Même si les traitements actuels visent à une amélioration du pronostic, des études approfondies des multiples mécanismes inhérents à l’instauration de l’athérosclérose apportent de nouvelles pistes de cures.L’importance des low density lipoproteins (LDLs), et plus spécifiquement des LDLs oxydées par la myeloperoxydase (MPO) dans la mise en place de la pathologie, nous a poussé à investiguer leur rôle dans l’athérosclérose et en particulier la réponse des cellules endothéliales soumises à cet inducteur de dysfonction endothéliale.Nous avons voulu étudier l’importance des dérivés d’oméga-3 de type acide docosahexaénoïque (DHA) et plus particulièrement de la résolvine D1 (RvD1) récemment découverte comme étant un inducteur de résolution inflammatoire.Afin de pouvoir évaluer les modulations de la RvD1 et de ses précurseurs DHA et 17S-HDHA, nous avons mis au point une méthode de purification des matrices biologiques complexes, suivie d’une quantification par spectrométrie de masse couplée à la chromatographie liquide (LC/MS-MS).La littérature n’offrant que des méthodes difficilement reproductibles et aux résultats parfois discutables, nous avons opté pour une purification par extraction liquide/liquide qui a montré de très bons résultats lors de sa validation.Par l’utilisation de cette méthode, nous avons pu apprécier les effets de la MPO, et plus particulièrement des LDLs oxydées par la MPO sur les cellules endothéliales, dans l’induction d’une réponse pro-résolutive caractérisée par une augmentation de la RvD1. Cet effet favorable induit par la MPO a été comparé à un autre modèle d’oxydation des LDLs par le cuivre (Ox-LDLs), sans résultat, attestant par-là le caractère spécial des Mox-LDLs dans une initiation de résolution.Nous avons également mis en évidence un effet synergique de ces Mox-LDLs qui, une fois associées aux LDLs-natives, permettent une réponse physiologique plus forte avec des taux de RvD1 produits encore plus importants. Encore une fois, les Ox-LDLs semblent dépourvues d’effets.Par la mise en place d’autres tests, nous avons essayé de mettre en lumière le mécanisme permettant l’induction d’un processus pro-résolutif par la libération de RvD1. Nous avons donc testé différents inhibiteurs jugés intéressants ainsi que l’inhibition de différents récepteurs aux LDLs (natives et oxydées) exprimés au niveau des cellules endothéliales. Par l’analyse d’échantillons de plasma issus de souris d’âges différents, nous avons établi une corrélation négative entre l’âge de l’individu et le taux de RvD1 mesuré. Ceci exprime le fait que les défenses mises en place par l’organisme pour un retour plus rapide à l’homéostasie lors d’un processus inflammatoire ont tendance à s’amenuiser avec l’âge. De plus, l’analyse de plasmas de patients soumis à hémodialyse et comparés aux plasmas de volontaires sains nous a permis de mettre en évidence une corrélation négative entre le taux de RvD1 et le nombre de macrophages M1 chez les patients sous hémodialyse, ainsi qu’entre les taux de RvD1 et le ratio chloro-tyrosine/tyrosine chez les volontaires sains.Nous avons donc constaté que la MPO, bien qu’étant un inducteur important de dysfonction endothéliale par son rôle d’oxydation au niveau des LDLs, est aussi un inducteur d’une réponse physiologique favorable à une résolution du phénomène inflammatoire. De plus, les LDLs oxydées par la MPO semblent agir de manière synergique avec les LDLs-nat pour induire cette réponse pro-résolutive sous forme d’une augmentation accrue de résolvine D1. Ce métabolite actif du DHA a la capacité de réduire l’influx de neutrophiles au niveau de la plaque et de favoriser l’expression phénotypique M2 des macrophages, bien connus comme étant les macrophages de la résolution. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

SUMMARYHuman papillomaviruses (HPV) are small, non-enveloped viruses with a dsDNA genome. About 40 HPV types infect the mucosa and skin of the anogenital tract, and they are further subdivided into low-risk HPV (LR-HPV) and high-risk HPV (HR-HPV). Long-term, persistent infections with the latter type could result in the development of cervical cancer. Cervical cancer is the second most prevalent cancer worldwide, and the third leading cause of cancer-related deaths in women. HR-HPV DNA is frequently found integrated in cervical carcinoma tissue. Thus, HR-HPV integration is considered to be mechanistically linked to virus-promoted malignancy. Several complex and sometimes inter-linked signal transduction pathways, collectively termed as the DNA Damage Response (DDR), act to sense damage incurred to DNA and ultimately promote its repair. The central players of the DDR are three proteins of the phosphatidylinositol 3-kinase-like protein kinase (PIKK) family, ataxia telangiectasia mutated (ATM), ataxia telangiectasia and Rad3-related (ATR) and DNA protein kinase catalytic subunit (DNA-PKcs). Also crucial to the DDR are members of the poly(ADP)ribose polymerase family (PARP). Interactions between histones modified by PARP enzymes, the PARP enzymes themselves and the X-ray repair cross-complementing protein (XRCC-1), are important for efficient DNA repair. Reversible acetylation of histones plays a key role in the regulation of gene expression and in the DDR. The acetylation of histones, as well as that of numerous other cellular proteins, is carried out by histone acetyl transferases (HAT). This enzymatic process exists in a tightly-regulated equilibrium with lysine deacetylation, which is catalyzed by histone deacetylases (HDAC). HDAC modulate the expression and/or function of key proteins implicated in cancer. In addition, many HDAC are overexpressed in most cancers. Various small-molecule inhibitors of HDAC have been developed. HDAC inhibitors (HDACi) have been shown to promote cancer cell cycle arrest, differentiation and apoptosis. In addition, HDACi are well-documented for their synergistic or additive effects on DNA-damaging agents used in cancer therapy. In spite of a growing body of research however, the cellular and molecular mechanisms behind this phenomenon have not yet been fully uncovered. We evaluated the impact of several pan-HDACi and HDACi analogues on the extrachromosomal and genomically-integrated HPV-16 LCR-driven transcription in various cell lines. Using a classical reporter construct strategy, we report that the pan-HDACi Trichostatin A (TSA), valproate (VPA) and sodium butyrate (NaB) are potent inducers of transcription from the HPV-16 long control region (LCR) in its extrachromosomal form. This effect of HDACi was at least in part mediated by three binding sites of members of the AP-1 family of transcription factors within the viral LCR. HDACi analogues 1 through 6 did not modulate extrachromosomal HPV-16 LCR transcription in a statistically-significant way. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Mycobacterium phlei est un micro-organisme Gram positif non pathogène. La paroi mycobactérienne provenant de M. ph/ei possède une activité anticancéreuse directe par induction de l'apoptose, de même qu'un effet immunostimulant. Ces activités semblent liées à la présence d'ADN compléxé à la paroi mycobactérienne. Cependant, les applications thérapeutiques de l'ADN mycobactérien dans le traitement systémique du cancer sont limitées du fait de la courte demi-vie de l'ADN qui est sensible aux dégradations enzymatiques. Ainsi, le but de cette étude consiste à développer un vecteur synthétique inerte pour l'ADN génomique de M. phlei puis à évaluer l'activité anticancéreuse de l'ADN mycobactérien une fois associé à un vecteur. Nous avons évalué l'activité cytostatique et la cytotoxicité de 5 types de vecteurs pharmaceutiques sur des cellules issues de mélanomes de souris (816-F1 ). Les liposomes anioniques composés de DPPC/DMPG montrent une activité cytostatique sans cytotoxicité directe. Les liposomes cationiques sont à la fois cytostatiques et cytotoxiques. Enfin, les liposomes composés de DPPC/DMPG/DSPE-PEG, les liposomes composés de DPPC/CHOL, les nanoparticules de lipides solides et les nanoparticules de chitosan ne présentent aucun effet inhibiteur sur la prolifération cellulaire, ni d'effets cytotoxiques. Ces derniers sont donc sélectionnés pour le transport de l'ADN génomique de M. phlei. La formation d'un complexe ADN-lipide cationique (DOTAP) 5:1 (m/m) a permis l'incorporation de 10% de l'ADN dans les vecteurs neutres. Jusqu'à un rapport ADN-DOTAP 1 :1 (m/m), le lipide cationique ne modifie pas l'activité de base antiprolifératrice de l'ADN de M. phlei. L'ADN de sperme de hareng semble diminuer fortement la toxicité du DOTAP envers les cellules tumorales. Cependant, à un rapport 1 :1 (m/m) le DOTAP recouvre en partie sa toxicité une fois le complexe ADN-DOTAP associé au vecteur. Les liposomes cationiques ainsi que le chitosan fixent plus de 90% de l'ADN et permettent une plus grande protection vis à vis des DNases. L'efficacité antiprolifératrice de L'ADN génomique de M. phlei augmente fortement lorsqu'on l'associe sous forme de complexe ADN-DOTAP (5:1 ou 20: 1 (m/m)) aux liposomes neutres contenant du DMPG, ou aux liposomes DPPC/CHOL. De la même manière, l'association de l'ADN de M. phlei au chitosan sous forme de nanoparticules augmente significativement son activité anticancéreuse.