La migration cellulaire est une étape clé intervenant à un stade précoce de la dissémination des cellules cancéreuses dans l’organisme, et est donc responsable de la formation des métastases qui tuent environ nonante pourcent des patients atteints de cancer. De plus, ces cellules migrantes résistent à l’apoptose grâce à l’activation constitutive de voies de signalisation anti-apoptotiques, et développent donc une résistance vis-à-vis des traitements anti-cancéreux actuels qui sont généralement pro-apoptotiques. Nous avons pris pour cible ce processus de migration cellulaire dans l’espoir d’identifier des agents anti-migratoires qui permettraient de lutter contre la formation des métastases et de restaurer chez les cellules migrantes une certaine sensibilité aux traitements pro-apoptotiques.<p>Dans la première partie de notre travail, nous avons analysé les effets anti-angiogéniques et anti-migratoires des agents anti-tubuline. Nous avons confirmé que le Taxol® présentait une action anti-angiogénique à des concentrations non-cytotoxiques. Nous avons ensuite démontré que d’autres agents anti-tubuline exerçaient la même action que le Taxol®, et que cette action leur était spécifique. Nous avons montré que certains de ces agents étaient également capables de réduire la migration de lignées cellulaires tumorales, toujours à des concentrations non-cytotoxiques, et que cette action pouvait s’exercer via une affectation du cytosquelette d’actine.<p>Dans la deuxième partie du présent travail, nous avons démontré l’importance de la mise au point d’une approche pharmacologique originale permettant l’identification de composés à action anti-migratoire puisque l’outil utilisé par le U.S. National Cancer Institute pour le criblage de nouvelles molécules anti-cancéreuses ne permet pas de discerner l’activité anti-migratoire des molécules testées.<p>Enfin dans la troisième partie de ce travail, après avoir souligné la raison du choix de l’actine comme cible pour inhiber la migration cellulaire, nous avons développé une stratégie pharmacologique in vitro originale de découverte de composés anti-actine à activité anti-migratoire. Grâce à une approche divisée en plusieurs étapes, à savoir un essai de cytotoxicité, une étude de la dynamique de la polymérisation d’actine en tubes ou sur cellules entières, et des essais de migration bidimensionnelle sur cellules individuelles ou sur population cellulaire, nous avons montré d’une part que des molécules connues pour affecter le cytosquelette actinique étaient capables d’affecter la migration cellulaire, et d’autre part que la méthodologie que nous avons développée permettait bien l’identification de composés affectant l’actine et capables de réduire la migration de cellules tumorales. En conclusion, cette stratégie in vitro pourrait être utilisée dans l’identification de nouvelles molécules à activité anti-migratoire pour lutter contre le cancer.<p> / Doctorat en sciences pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les pathosystèmes, plante-bactérie, aboutissent souvent au niveau de la plante à de profondes reprogrammations tant au niveau de la morphogenèse que du métabolome. Dans le cas de l’interaction plante-Rhodococcus fascians, une bactérie phytopathogène, il se développe au niveau du site d’infection, une structure morphologique particulière nommée « galle feuillée ». <p>Au sein de cette hyperplasie, les altérations métaboliques induites concernent non seulement les produits du métabolisme primaire mais également le métabolisme secondaire et plus particulièrement des composés qui interviennent dans les mécanismes de défense ou qui affectent la prolifération cellulaire végétale. <p>Dans le cadre de notre travail de thèse, nous nous sommes fixé deux objectifs principaux qui sont de caractériser les altérations métaboliques au niveau des tissus hyperplasiques de tabac mais aussi de rechercher des applications potentielles du point de vue thérapeutique de cette interaction.<p>L’approche métabolomique globale basée sur une analyse comparative des spectres 1H-RMN d’extraits bruts de tissus infectés et de tissus non-infectés couplée à des analyses statistiques de données multivariées (ACP, OPLS-DA) a été utilisé pour l’étude de la reprogrammation métabolique. Le résultat indique une accumulation de composés phénoliques et des métabolites de la famille des diterpènes dans les tissus de la galle feuillée. <p>Les activités biologiques des extraits de la galle feuillée ont ensuite été évaluées, notamment des activités antioxydantes (DPPH, FRAP), anti-inflammatoire (15-LOX) et antiproliférative (MTT). Il ressort de cette analyse une augmentation du potentiel réducteur et anti-radicalaire des extraits de la galle feuillée, une activité inhibitrice de la lipoxygénase ainsi qu'une activité antiproliférative sur lignées tumorales humaines, comparée à la plante non infectée. <p>L’étude des composés affectant la prolifération des cellules cancéreuses humaines a aboutit à la mise en évidence d’un mélange de molécules (F3.1.1) appartenant au groupe des incensoles (cembrènoïdes). Ces composés ralentissent la durée de la division cellulaire, affectent la taille des cellules et induisent des anomalies de la karyokinèse et de la cytokinèse des cellules de glioblastome U373. La dynamique tubuline/microtubule est identifiée comme étant la cible des cembrènoïdes (F3.1.1). L’effet des ces composés est original comparé aux anti-tubulines usuels tel que la colchicine et le paclitaxel. Le mécanisme d’action des incensoles est unique et donc prometteur du fait que la dynamique des microtubules reste une cible de choix dans le traitement des cellules cancéreuses.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La problématique de l’accès potable est très aiguë dans plusieurs pays en développement. Entre les années 1999 et 2004, un programme d’approvisionnement en eau de consommation a été mis en œuvre au profit des populations de la région Nord du Burkina Faso à travers la réalisation de forages. Au cours de son application, ce programme a malheureusement rencontré un problème, lié à la contamination des eaux souterraines par l’arsenic, naturellement relargué à partir des roches en contact avec la nappe aquifère. Dans le cadre de ce travail, nos études conduites par la suite dans la zone nous ont permis de mettre en évidence des teneurs élevées et parfois excessives dans certaines eaux souterraines. Le contrôle chimique et microbiologique régulier de la qualité de l’eau apparaît comme un moyen primordial de prévention des risques sanitaires liés à la consommation de ces eaux. A cet effet, deux outils électroanalytiques de suivi des teneurs en arsenic et en mercure dans les eaux souterraines ont été développé. La méthode conçue sur la base du premier dispositif utilise une électrode de pâte de carbone modifiée par des nanoparticules d’or et recouverte d’une monocouche auto-assemblée de glutathion. Elle est caractérisée par une large gamme de travail comprise entre 3 et 1498 µg/L, une répétabilité de l’ordre de 5%, une exactitude de 3,5 % et une limite de détection estimée à 0,9 µg/L. Cette méthode a été appliquée avec succès à une étude de spéciation sur site. Il ressort de ces investigations que 40% des échantillons d’eaux analysés ont une prévalence relative en arsenic (III) supérieure à 50%, et 60% des échantillons ont une prévalence relative en arsenic (V) supérieure à 50%. Le second dispositif électroanalytique, développé pour la surveillance des teneurs en ions mercuriques dans les eaux souterraines, est basé sur une électrode sérigraphiée de carbone modifiée par des nanoparticules d’or. La méthode mise en œuvre à l’aide de ce transducteur est caractérisée par une gamme de travail comprise entre 1 et 100 µg/L, une répétabilité de 5%, une exactitude de 0,4% et une limite de détection estimé à 1 µg/L. L’application à l’analyse d’une série d’échantillons d’eau souterraine a révélé une teneur cinq fois supérieure à la norme pour un échantillon d’eau et des teneurs proches de la limite de quantification pour 2 échantillons. Les méthodes développées sont aisées à mettre en œuvre, elles offrent des caractéristiques de performances comparables à celles des méthodes de références pour un coût d’investissement très abordable. Elles sont bien adaptées aux mesures de suivi et des analyses sur terrain. Elles pourraient constituer pour un pays comme le Burkina Faso, une alternative très intéressante aux méthodes de spectrophotométrie atomique coûteuses et difficilement accessibles. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

1. SUMMARYMyeloperoxidase (MPO) which belongs to the peroxidase family, is found in mammalian neutrophils. This heme enzyme contributes to the production of (pseudo)halogenous acid such as HOCl which oxidizes proteins, cell membrane, DNA and RNA causing death for the pathogens. It has an antimicrobial effect due to HOCl secreting inside the phagosomes of the neutrophils, whereas it will be released outside neutrophils causing oxidative damages for the host tissues. Proteins, lipids, lipoproteins, DNA and RNA are potential targets of the MPO resulting in several chronic syndromes. Many researchers have discovered the harmful effects of MPO and its products demonstrating its role in many inflammatory chronic diseases such as: Cardiovascular diseases as in atherosclerosis. MPO contribution in atherosclerosis development has been demonstrated. Neurodegenerative diseases also was related to MPO: such as Alzheimer’s disease (AD), multiple sclerosis (MSc) and Parkinson’s disease The enzyme has been also pointed out in other diseases such as renal disease and cancer.For these reasons, MPO as a target of drug discovery has attracted the attention of many researchers. X-ray 3D structures were resolved for this enzyme, biological activity and mechanism of action were investigated in depth, and many medicinal chemists have investigated and screened for new MPO inhibitors. Indeed, this cumulative work including X-ray data, the role of MPO in different pathologies, MPO inhibitory mechanism of action, screening and various chemical entities that inhibit MPO, provided sufficient elements to start a new drug design and drug discovery process on MPO.The aim of the present study was to apply a rational drug design approach to the myeloperoxidase inhibition: from in silico to pharmacological activity. This includes:─ Conducting high throughput virtual screening in order to find new potential hits to inhibit MPO followed by mechanism of inhibition determination. ─ Selecting one hit and then implementing a whole pharmacomodulation process in order to increase the potency of the inhibition greater than the starting hit and to improve the selectivity.Firstly, a rational drug design process was launched to find new hits using high throughput virtual screening. The chosen database for the screening was ASINEX database published in ZINC.X-ray structure of human peroxidase complexed to cyanide and thiocyanate (PDB 1DNW) was selected to conduct High-Throughput Virtual Screening (HTVS). Three successive protocols with different levels of accuracy in the docking and scoring processes were used starting with HTVS, followed by Standard Precision (SP) and finally with Xtra Precision (XP). The quality of the docking process performed was validated by docking a set of 60 chosen molecules of varying chemical structure and known as MPO inhibitors. From the result of the HTVS conducted on 1,350,000 compounds, the 100 best compounds were selected. Among them, 81 molecules were available for purchase from ASINEX, those compounds were tested with a MPO inhibition assay. Thirty-two compounds (39 %) were active, but only 8 compounds were selected, featuring different chemical structures with IC50 values ranging between 0.46 ± 0.07 and 12 ± 3 μM. Among these molecules, two compounds were the best and considered as hits. One has purinedione structure which is similar with the structure of thioxanthine derivatives (F9, IC50=0.46±0.07μM). The second compound has a hexahydropyrimidine structure (A1, IC50 = 0.5 ± 0.1 μM) The most common interactions found among all 8 docked ligands are the ionic bond with Glu102 and a stacking (shifted or not) with pyrrole ring D of the prosthetic group. Hydrogen bonds with Glu102, Thr100, Gln91, Arg239, or the propionate groups of the heme are also found in several docked geometries of the complexes. Interestingly, interactions with Glu102 and pyrrole ring D of the heme were also seen with fluorotryptamine derivatives and also salicylhydroxamic acid (SHA).For measuring MPO-dependent LDL oxidation, the two best compounds were tested. Compounds A1 and F9 showed good inhibition on MPO-dependent LDL oxidation (62 ± 6, 4.5 ± 0.9, 11 ± 2% and 11 ± 2, 2.6 ± 0.8, 6 ± 4%, respectively).Consequently, in order to determine the mechanism of inhibition transient-state kinetics were further investigated of all the 8 selected compounds.Both new lead compounds (A1 and F9) act as electron donors of both Compound I and Compound II of MPO. The reaction with Compound I was significantly faster (k2 ≫ k3). As a consequence, the enzyme is trapped in the Compound II state. They reversibly inactivated the enzyme blocking the harmful halogenation activity of MPO by transferring it to the MPO peroxidase cycle. In the present study, 8 active and reversible MPO inhibitors were selected. They act as electron donors of the oxidoreductase and efficiently block the halogenation activity with reversible inactivation. Two of the selected compounds have a submicromolar activity and inhibit MPO-dependent LDL oxidation. The high-throughput virtual screening was proved to be a successful tool to find new leads of MPO inhibitors. Conducting HTVS on a large-scale database enabled selection of novel scaffolds of MPO inhibitors never explored before in less time and at less expenses.Finding 8 new different chemical scaffolds through the first step of this drug discovery process led us to choose a new hit, compound A1, which has a hexahydropyrimidine structure, compound F9 was not chosen despite being more active due to its similarity to compounds discovered by AstraZeneca. To conduct pharmacomodulation, a validation of the docking procedure was conducted by comparing the X-ray structures of MPO with 2-(3,5-bistrifluoromethylbenzylamino)-6-oxo-1H-pyrimidine-5- carbohydroxamic acid, HX1, and SHA in the X-ray structures of human MPO in complex with cyanide and thiocyanate (PDB code 1DNW) as well as in complex with HX1 (PDB code 4C1M). Compound A1 was docked into both target structures 1DNW and 4C1M. In both cases, A1 showed almost the same poses.Based on the binding modes of A1, different strategies were developed for the design of derivatives which were mainly focused on the substitution of the aromatic rings A and B, the 2 amino groups and the side chain bridges.Pharmacomodulation was carried out on the hit A1 with different strategies:─ Investigating the role of hydroxyl groups on both aromatic rings─ Shifting the position of the amino groups in the hexahydropyrimidine ring to obtain piperazine derivatives and introduction of fluorine ─ Eliminating of one ring and of an amino group in the hexahydropyrimidine ring leading to piperidine derivatives ─ Opening the hexahydropyrimidine ring while keeping amine function and changing the length of the bridge between this amino group and aromatic ring as well as the impact of substitutions on aromatic rings.─ Hybridization of fluorotryptamine derivatives (effective MPO inhibitors) with hit A1.Based on of the docking experiments, 37 designed compounds were synthesized. The assessment of inhibition of the chlorination activity of MPO was undertaken over the 37 compounds. The hit A1 IC50 = 500 nM. The best compounds inhibiting MPO exhibited the following characteristics:─ One amino group on the bridge between aromatic rings was sufficient for the establishment of binding to Glu102 ─ The presence of three methylene groups between the secondary amine and an aromatic ring improved the inhibition of chlorination and thus decreased the IC50 values. These results showed that the position of the hydroxyl group is important. The distance between the hydrogen bond acceptor (HBA) group of one aromatic ring and the amino group is very important. The docking experiments of bisarylpropylamine derivatives showed ionic and hydrogen bonding interactions between Glu102 and hydroxyl group on aromatic ring linked to the longer side chain.─ Hybridized compounds which carry a fluorotryptamine instead of the phenol ring obtained by hybridization of hit A1 and the potent MPO inhibitors fluorotryptamine derivatives. Actually, compound 38 (which had one aromatic ring and a propyl bridge attached to indole ring) had an IC50 = 54 nM which was 10 times more powerful than the starting hit.The 3 best compounds were tested to examine the transient kinetics. They act as electron donors of the oxidoreductase and efficiently shift MPO from the chlorination cycle to the peroxidase cycle. Due to the similarity of the best compound 38 to serotonin it was tested with the two other best compounds on serotonin transporter (SERT) to examine the selectivity between MPO and SERT.Compound 38 had higher selectivity over MPO but the best selective compound was 28 that contains two aromatic rings carrying one hydroxyl and one fluorine.Electron density maps were conducted to predict the site of oxidation. Results suggested it occurs preferentially at the benzene ring or the indole ring in the best compounds.Determination of redox potentials for the synthesized compounds were tested. Best compounds act as electron donors allowing a one-electron reduction of Compound I.In conclusion, the present study succeeded through rational drug design including structure-based drug design and HTVS to identify new chemical entities for MPO inhibition. Eight compounds were more active than the starting hit A1 with submicromolar inhibition potency. Hybridization and structure based design also gave improvement of selectivity of inhibitors against MPO such as compound 38. Bis-arylalkylamine derivatives are a new group of MPO inhibitors with higher selectivity which could be a new hit for future development. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La myéloperoxydase (MPO) est une enzyme pro-oxydante qui est capable de causer des dommages aux biomolécules, comme les acides nucléiques, en les chlorant spécifiquement par le biais de l’acide hypochloreux (HClO) qu’elle produit. La MPO étant présente au sein de tissus prostatiques et impliquée dans divers mécanismes physiopathologiques (incluant les cancers), il nous semblait important d’évaluer dans ce travail l’impact de sa présence dans le développement de lésions prostatiques ainsi que celui de la présence de nucléosides spécifiquement modifiés par la MPO sur la réplication, la transcription et la traduction.Dans un premier temps, des méthodes ont été développées afin de permettre l’analyse quantitative des nucléosides de l’ADN, de l’ARN, du pool cytoplasmique et du plasma. Des protocoles d’extraction et d’hydrolyse de l’ADN et de l’ARN ainsi que des protocoles de purification et de déphoshorylation des nucléosides libres (pool cytoplasmique et plasma) ont été développés ou adaptés afin de pouvoir ensuite séparer et quantifier les nucléosides par chromatographie liquide à ultra haute performance couplée à un spectromètre de masse Triple Quadupôle (LC/MSMS). La méthode analytique LC/MSMS a été développée et validée pour l’étude de six résidus modifiés :les 5‐chloro-(2’-désoxy)cytidines, les 8-chloro-(2’-désoxy)guanosines et les 8-oxo-(2’-désoxy)guanosines. Les quatre premiers étant des marqueurs spécifiques de la MPO et la formation des oxoguanosines pouvant être catalysée par l’enzyme (marqueur du stress oxydatif). Cette méthode a notamment l’avantage de présenter des limites de quantification plus faibles que dans la littérature, abaissant de 4 à 25 fois la sensibilité de la méthode selon le nucléoside.Deuxièmement, nous nous sommes attardés sur l’implication de la MPO dans le développement de lésions prostatiques, en recherchant la présence de ces nucléosides modifiés au sein de biopsies prostatiques de patients et de cultures cellulaires prostatiques traitées in vitro par la MPO, à l’aide des méthodes développées précédemment. Néanmoins, il s’est avéré qu’aucun chloronucléoside n’a été détecté dans ces cas de figure. Une méthode d’immunomarquage par fluorescence a également été développée afin d’essayer de colocaliser la présence de la MPO et son activité au sein de tissus prostatiques de patients souffrant de lésions prostatiques. Ce marquage avait pour but d’estimer l’activité réelle de la présence de MPO, et donc son rôle au sein de ces lésions prostatiques mais un phénomène d’autofluorescence n’a pas permis d’aboutir à des résultats.Finalement, l’étude du plasma de patients hémodialysés et de la pénétration intracellulaire de nucléosides modifiés depuis les liquides extracellulaires, tel que le plasma, vers le compartiment cellulaire ont été abordées. Ces expériences ont également été rendues possibles grâce aux méthodes développées et validés précédemment. Puisqu’il s’avère que les échantillons de plasma de donneurs sains et de patients contiennent de la 5-chlorocytidine et que cette dernière est capable de pénétrer in vitro dans les cellules prostatiques, l’aspect de l’incorporation de ces nucléosides au sein de l’ADN et l’ARN a également été approfondi. Il en résulte que seule la 5-chlorocytidine s’incorpore dans l’ARN lors de la transcription en présence de nucléosides modifiés dans le milieu alors qu’aucun nucléoside modifié ne s’incorpore dans l’ADN lors de sa réplication. Ce dernier point est probablement dû à une perte partielle ou complète de l’activité de certaines enzymes impliquées dans la réplication face aux chloronucléosides. De plus, l’étude du rendement de la traduction a montré que cette incorporation spécifique était accompagnée d’une importante réduction de la traduction de l’ARN en protéines.En conclusion, bien que ce travail ait permis d’établir une méthode LC/MSMS sensible, précise et exacte pour l’analyse de nucléosides modifiés (chlorés et oxydés) dans différentes matrices, il n’a pas permis de mettre en évidence des chloronucléosides dans les tissus prostatiques de patients et d'impliquer la MPO dans le développement de lésions prostatiques. Le rôle de la MPO dans les tissus prostatiques reste donc encore à élucider. De plus, ce travail a mis pour la première fois en évidence la présence de 5-chlorocytidine dans le plasma humain ;ce même nucléoside est capable de s’incorporer spécifiquement dans l’ARN, influençant fortement le rendement de la production de protéines, ce qui soulève encore des questions quant à son impact sur les fonctions et la viabilité des cellules en présence de 5-chlorocytidine dans le milieu extracellulaire. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

γδ T cells are unconventional T cells that that can recognize infected and transformed cells via their γẟ TCR, thus promoting different immune responses. In addition, several studies showed that γδ T cells are important in the protection against different pathogens in early life, such as human cytomegalovirus (CMV). The diversity of the γδ TCR repertoire is mainly generated in the complementarity determining region 3 (CDR3) where V(D)J recombination takes place. One of the main players in the junctional diversity is the terminal-deoxynucleotidyl-transferase (TdT) enzyme responsible for the random template-independent nucleotide addition at the junction of the joining gene segments.In the mouse model it is established that during development, especially before birth, innate γδ T cell subsets are generated in waves and their generation depends on the type of hematopoietic stem and precursor cells (HSPC). These γδ T cells express a semi-invariant γδ TCR and can acquire a functional program already in the thymus. In human, in contrast, the idea of γδ T cells as innate-like lymphocytes is questioned by recent works showing that the γδ TCR repertoire of human pediatric thymuses and of term-delivery cord blood is highly diverse. Here, by analyzing in detail human fetal and post-natal thymi, we observed striking differences between fetal and post-natal γδ thymocytes at the γδ TCR repertoire and functional level. In contrast to post-natal γδ thymocytes, fetal γδ thymocytes were functionally programmed, expressed low levels of TdT and were highly enriched for invariant/public CMV-reactive CDR3 sequences (TRGV8-TRJP1-CATWDTTGWFKIF, TRDV2-TRDD3-CACDTGGY, and TRDV1-TRDD3-CALGELGD). The rearrangements of these invariant sequences were driven by short-homology repeats at the end of the involved gene segments, as it was observed in the mouse. In addition, we investigated the role of HSPC in the generation of this invariant γδ thymocytes by using an in vitro T cell development system and we showed that only fetal HSPC could generate γδ T cells enriched for the same specific features that were found in the ex-vivo fetal γδ thymocytes. Moreover, we showed that the RNA-binding protein Lin28b, highly expressed in fetal γδ T cells, reprogrammed the term delivery HSPC towards the generation of γδ T cells resembling to their fetal counterpart.In conclusion, we show that the human fetal thymus generates, in a HSPC- and Lin28b-dependent manner, innate invariant γδ T cells with programmed effector functions that might provide protection to the fetus during congenital infections, such as against CMV. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

High grade gliomas remain a devastating disease, for which a curative therapy is virtually absent. The high medical need is unmet by novel treatment strategies and advances in chemo-and radiotherapy. Patients diagnosed for GBM face a median survival of 15 months after maximal standard-of-care therapy, and relapse is often observed due to micro-metastasis in the direct environment of resection. In part, current treatment modalities such as chemo-and immunotherapy are hampered in their efficacy due to the specialized TME. This area is adequately equipped to withstand the cytotoxic attack of chemo- and immunotherapy. Therefore, we hypothesized that modulation of the TME could decrease these defense mechanisms, and increase susceptibility to tumor lysis.In this respect, we focused on Gal-1 as an ideal target to modulate the TME in the context of GBM. Gal-1 exerts multiple tumor promoting functions. From pre-clinical research, we have learned that Gal-1 is an important mediator for the proliferation and migration of tumor cells, moreover Gal-1 could also promote angiogenesis in the TME, providing nutrients and oxygen for GBM to grow. Gal-1 also maintains the inherent defense mechanisms to chemo and immunotherapy. Gal-1 is crucial for the resistance mechanisms to TMZ by altering the EPR stress response. Moreover, and most important for our purposes, Gal-1 is also a crucial immune suppressor in the TME, which can induce apoptosis in activated T cells, and recruit Tregs. To target Gal-1 in the TME would be clinically most relevant if this could be performed via a non-invasive treatment modality. Therefore, we developed a nanoparticle complex that could deliver siGal-1 from the nasal cavity directly to the CNS, and even the TME. This nose-to-brain delivery bypasses systemic routes, with a higher (and more selective) local bioavailability in the CNS. The major pharmaceutical excipient in this nanoparticle complex consists of chitosan polymers. These polymers are highly interesting agents to promote nose-to-brain delivery due their muco-adhesive and epithelial barrier modulation properties. When applying these particles in vitro on GBM cells, a solid decrease of Gal-1 was noted, and the epithelial modulatory properties were confirmed. Furthermore, we observed a rapid transport from the nasal cavity to the brain upon intranasal administration of a highly-concentrated chitosan nanoparticle siGal-1 suspension and we could even observe the sequence-specific cleavage of Gal-1 mRNA, and a decrease of Gal-1 in the TME. This Gal-1 reduction could modulate the TME from immune suppression to immune activation, as demonstrated by decrease in suppressor cells, and increased stage of activation in rejective immune cells. Moreover, due to decreased Gal-1, also angiogenesis was alleviated, and a reduced size in vasculature was observed, mimicking a morphological vessel normalisation. Reversing the immune and vascular contexture of the TME by Gal-1 reduction seemed a prerequisite to increase the efficacy of TMZ, DC vaccination and PD-1 blocking. In combination experiments, we noticed that siGal-1 on top of these treatments, could further increase the efficiency of chemo and immunotherapy. The findings presented in this thesis can serve as a proof of concept for the feasibility to modulate and re-orchestrate the TME of GBM via intranasal administration. The intranasal administration of siGal-1 could represent a valuable clinically translational treatment to increase the efficiency of chemo- and immunotherapy for GBM patients. In our research facilities, a phase 0 as a first-in-human trial is actively pursued. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Introduction: In recent year, the role of the pharmacist has evolved from product-focused to patient-focused activities. Following this evolution, new professional pharmacy services were simultaneously developed by researchers and started to be legally implemented and remunerated for community pharmacists around the world. Implementation, essential to ensure a good programme delivery and therefore its effectiveness, was seen as a passive process for which diffusion and dissemination were sufficient to translate research into practice. However, the transition from theory to practice is often difficult as different factors hinder or facilitate the implementation of such services. In consequence of that, implementation research started to be developed in the community pharmacy field to understand and fil the gap between theory and practice.Objectives of the thesis: Three projects were conducted in Belgium and Switzerland; (1) to understand the implementation of an existing programme in Belgium; the isotretinoin pregnancy prevention programme (PPP) (Chapter IV, point 4.1), and (2) to study the implementation of two new developed pharmaceutical services, which include an interview between the pharmacist and the patient and require interprofessional collaboration; the medication adherence program in Switzerland and the medication review in Belgium (Chapter IV, point 4.2). Methods: To understand the implementation of the isotretinoin PPP, two studies were conducted. The first study was a survey sent to health care professionals (pharmacists, general practitioners and dermatologists) and patients. The outcomes of the survey were the PPP awareness and compliance to safety recommendations related to the teratogenic risk of isotretinoin. The second study was cross-sectional and analysed the reimbursed prescription data of the Belgian population taking isotretinoin between January 2012 and August 2015. The outcomes were medication adherence to isotretinoin and to contraception, and the concomitant use of contraception and isotretinoin. Medication adherence was measured using the medication possession ratio (MPR), dividing the total days of medication supplied within the refill interval by the number of days in the refill interval. The concomitant use of isotretinoin and contraception was realised in combining prescription database of both isotretinoin and contraception of women between 12 and 21 years old, who received at least one prescription of isotretinoin during the study period.To study the implementation of the medication adherence program in Switzerland and the medication review service in Belgium, two prospective and observational studies were conducted with a mixed method approach (quantitative and qualitative outcomes). The defined outcomes, based on the RE-AIM model, were; reach of the target patients, adoption of the service by health care professionals providing the service, implementation (facilitators, barriers and fidelity or the extent to which the intervention is delivered as intended), and maintenance (the extent to which the intervention become institutionalized or part of the routine activity). Outcomes were collected through web platforms for quantitative data, and interviews and focus groups for qualitative data.Results and discussion: The study of the isotretinoin PPP implementation showed that two safety recommendations related to the teratogenic risk were particularly poorly applied by interviewed health care professionals. These two recommendations were the use of a second contraceptive method (like condoms) and the monthly pregnancy test. They considered these two recommendations as unnecessary for women taking an effective contraceptive method. Through the prescription refill data analysis, we observed that 46.1% of patients were adherent to isotretinoin (MPR ≥ 0.8) and 74.0% of women taking isotretinoin to their prescribed contraception (oral contraceptive, rings and patches). Lastly, 83.4% of women between 12 and 21 years taking isotretinoin did not receive an effective contraceptive method one month before, during and one month after isotretinoin treatment. However, the proportion of women receiving at least one prescription of contraception during (74.1%) and after (72.1%) isotretinoin treatment was higher than one month before isotretinoin treatment (35.7%). Regarding these results, less adopted recommendations should be reviewed by an expert committee and interventions focused on the improvement of the use of contraception during isotretinoin treatment could be developed.The two studies related to two new developed pharmaceutical services showed that their implementation was feasible in community pharmacy practice. Most of pharmacists participating in both projects had positive attitude regarding the implementation of these services in their daily practice. They considered it as professionally satisfying and important for patients and perceived the benefits of the programs. However, similar barriers were observed; difficulties to include patients and lack of interprofessional collaboration, and lack of time (related to lack of staff, administrative burden and lack of team adoption). According to participating health care professionals, the development of new strategies to overcome these barriers is necessary to anticipate the future implementation and the maintenance of these services at the national level. Following these results, the proposed strategies are for example the development of broad based media campaigns (for health care professionals and patients), or the development of specific trainings focusing on interprofessional collaboration, service-process, practice change management and leadership. Conclusion: The legal evolution of the pharmacists’ role is a positive progress but insufficient to ensure a full implementation in practice. Implementation strategies should be considered at different implementation stages (exploration, preparation, testing, operation and maintenance) and levels (individual, pharmacy, local setting, and system). The use of implementation science would allow a quicker and more effective implementation of these new professional pharmacy services. The anticipation of change and the selection of appropriate strategies would allow a higher fidelity level to the different components of the service by health care professionals and therefore a higher effectiveness, e.g. clinical and economic outcomes. Health care professionals, professional associations, academics and policy makers should be aware of implementation science and integrate it in the development of the new pharmacists’ role. As shown in our results, it should also be considered for existing programmes such as the isotretinoin PPP. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

For many years, the nasal route of administration as part of a therapeutic treatment has been used. This route of administration is easy to implement, especially due to its non-invasiveness the ease of administration that it affords for the patient. In addition, it is suitable for chronic treatment as well as for an emergency situation when the patient is unconscious. For instance, the administration of benzodiazepines, such as midazolam, may be done to stop convulsions in a patient.Traditionally, intranasal administration was mainly borrowed to target a local effect (e.g. treatment of a cold with a decongestant agent). Subsequently, its application for systemic delivery (e.g. treatment of migraine with triptans) was more and more frequently considered. However, the administration of a drug in the nasal cavities for systemic delivery still remains limited. Indeed, even if the intravenous route has several major limitations such as its invasiveness or the pain generated during administration, it remains more widely used than the intranasal route. This can be explained, on the one hand, by the knowledge that was relatively limited regarding the nasal delivery but also because of the unavailability of nasal devices allowing precise control of the nasal administration (i.e. accurate dose delivery, strong deposition in the nasal cavity, etc).Subsequently, the intranasal route has led to a third therapeutic targeting, namely, the “nose-to-brain pathway”. In that case, the nasal cavity was considered as an opportunity to access the central nervous system (CNS). Indeed, the nose-to-brain delivery allows reaching the brain while bypassing the blood-brain barrier which is known to be a major obstacle to the diffusion of drugs in the CNS. Moreover, the passage through the nasal cavity would allow the administration of sensitive molecules (e.g. biopharmaceuticals) while avoiding excessive enzymatic degradation.Therefore, the nose-to-brain pathway appears to be an attractive route for the delivery of unstable molecules, requiring an access to the brain to reach their site of action. In this context, the therapeutic target that has been selected was "cachexia". It is a complex metabolic syndrome associated with underlying illness and characterized by loss of muscle with or without loss of fat mass. It usually results in particular from undernutrition and a generalized inflammatory state in the patient. In order to treat this syndrome and to restore the appetite in these patients, the goal was to use ghrelin (GHRL) as a model drug. GHRL is a peptide hormone that exhibits, among other effects, an orexigenic action. This biopharmaceutical needs to reach its receptors, located in the hypothalamus, to exert its therapeutic effect.In this study, the goal was to develop a formulation that was able to protect GHRL during its nasal administration, while increasing its residence time to promote its diffusion through the nasal olfactory epithelium.In the first part of the project, GHRL was mainly characterized in terms of stability (e.g. temperature and pH), but also in terms of surface charge. These results allowed selecting the most suitable strategy of formulation as well as the optimal storage conditions. After these preformulation evaluations, it was decided to work on the development of a liquid formulation. The first formulation was based on micelles composed of lipids with polyethylene glycol "DSPE-PEG (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [amino (polyethylene glycol) -2000] (ammonium salt)" as hydrophilic group. This type of pegylated lipids have already shown, in many scientific studies, interesting properties in the context of intranasal administration, especially in terms of mucopenetration. With a slight adaptation of the protocol found in the literature, it was possible to obtain micelles of an adequate size (~15 nm). The micelles produced also showed good ability to encapsulate GHRL with an encapsulation rate of 98%, but micelles of DSPE-PEG failed to increase the GHRL diffusion through epithelial layer. This step is essential in order to obtain high GHRL levels in the brain. The formulation containing DSPE-PEG micelles has thus been abandoned.Still in the goal of combining lipid excipients with hydrophilic polymer, another formulation strategy based on liposomes coated with chitosan has been considered. Since GHRL has a positive charge at physiological pH, anionic liposomes have been developed to get a high loading. Three types of liposomes have been produced: anionic, neutral and cationic. The objective was to evaluate the influence of the liposomes charge on GHRL encapsulation. By working with anionic liposomes, the loading could be 46% higher than that obtained from the cationic liposomes. In order to evaluate a potential relation between the amount of GHRL that was encapsulated in the liposomes and the amount of GHRL that could potentially be degraded in the presence of enzyme, the three types of liposomes were exposed to trypsin. Following enzyme exposure, anionic liposomes showed enzymatic protection 4 times higher than cationic liposomes. These anionic liposomes have also shown high GHRL protection in the presence of another enzyme with another mechanism of digestion, namely, carboxylesterase-1. Subsequently, isothermal titration calorimetry tests were performed to better understand the interaction mechanisms between GHRL and anionic liposomes. This technique showed that hydrophobic interactions between both compounds were predominant. The coating of anionic liposomes by chitosans was performed and confirmed by an increase of the mean diameter (+48 nm) and charge (+6 mV) as well as by the modification of the morphology of the liposomes. This coating of liposomes with chitosans was supposed to confer additional properties to the formulation such as mucoadhesion and permeation enhancement. These both effects can be obtained thanks to the positive charge of chitosans which allows adhering to the mucins of the mucus, on the one hand, and thanks to the opening of the epithelial tight junctions that enhances drug permeation, on the other hand. The chitosan coating allowed increasing the fixation of the liposomes to mucins by about twenty percent compared to uncoated liposomes. In addition, the "absorption promoter" effect of chitosans was confirmed on cells culture. Then, the formulation was introduced into two distinct nasal devices intended for the administration of liquid nasal sprays, namely, the VP3 device from Aptar Pharma and the SP270 device from Nemera. The aerosols produced by each device allowed generating droplets characterized by a mean diameter higher than 10µm, leading to potential satisfactory impaction onto the olfactory region instead of diffusion throughout posterior region of the nasal cavities. In the second part of the work, a dry formulation was produced by spray-drying from the liquid dispersion of coated liposomes. The objective was to increase the stability of GHRL during storage as well as to enhance its remanence and diffusion through the olfactory epithelium. The optimized parameters allowed producing a powder characterized by a mean diameter higher than 10 μm with an acceptable yield. The powder produced exhibited a low residual moisture and showed good homogeneity in terms of GHRL content. Then, a comparative study was carried out between the powder and the liquid formulation to compare the GHRL stability over time during storage at different temperatures (4°C and 25°C) but also their ability to fix mucins. In both cases, the dry powder showed better results The powder was also re-dispersed in aqueous phase to evaluate the ability of the liposomes to be reconstituted without modifying their physicochemical properties (e.g. size distribution, charges, stability). It was demonstrated that the majority of the initial properties could be preserved after reconstitution (i.e. rate of encapsulation). Similarly to the liquid formulation, the powder was loaded into a specific device developed for the nasal administration of powders that allows targeting the olfactory region to optimize the nose-to-brain transfer. The device, "UDS - Unit Dose System " from Aptar Pharma, has shown excellent properties in terms of particle size distribution in the aerosol but also in terms of targeting the olfactory zone. The latest was studied by means of "nasal cast" that is a 3-printed model of artificial nasal cavities. After impaction in the different cavities of the cast, it was possible to quantify the amount of GHRL that was deposited in the olfactory zone. Using our optimized formulation in combination with the device developed by Aptar, it was shown that 52% of the powder was impacted onto the area corresponding to the olfactory region. Such data demonstrated the relative difficulty to target this section of the nasal cavities.Finally, the formulation loaded with fluorescent GHRL was intranasally administered in mice. It was demonstrated that GHRL could reach the brain after intranasal administration of the formulation and that the formulation was essential to allow this transfer to the brain.The administration of such biopharmaceutical by nose-to-brain with this formulation seems to be an interesting alternative to exploit. However, additional studies to quantify this transfer more precisely, to better define its kinetics and also to evaluate the efficacy of the treatment should be carried out. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

IntroductionDepuis plusieurs décennies, la pratique et les soins pharmaceutiques sont soumis à plusieurs changements en partie en raison de l’évolution de la société, des progrès de la recherche et de la mise sur le marché de nouveaux médicaments. La pratique du pharmacien a passée d’une délivrance centrée sur le médicament vers la délivrance centrée sur le patient notamment par la détection, l’intervention et la résolution des Problèmes Liés aux Médicaments (PLM).Certains patients atteints d’une condition médicale particulière, tels que les patients cancéreux, peuvent être soumis à des traitements lourds qui leurs sont nécessaires mais qui peuvent les rendre plus vulnérable à l’apparition d’un PLMObjectifsL'objectif de cette thèse était de mettre en évidence la proportion des PLM dans les pharmacies d’officines ainsi qu’à l'hôpital et d’évaluer les potentielles conséquences en milieu hospitalier.La première partie était composée de deux projets ;1) Traduction et adaptation de la classification du PCNE V6.2 à la pratique et au cadre juridique pharmaceutique belge en intégrant la validation du contenu et la fiabilité inter-évaluateur de la classification adaptée. 2) Étude pilote visant à évaluer la proportion de PLM des antidouleurs les plus utilisés en Belgique.La deuxième partie de cette thèse était composée de trois projets. 1) Quantification et classification des réadmissions des PLM des patients cancéreux réadmis dans les 30 jours et mise en évidence des facteurs de risque liés à ces réadmissions ;2) Évaluation des coûts liés aux réadmissions dues aux PLM et les potentielles économies de PLM évitables ;3) Détection des interactions médicamenteuses à partir de différentes sources disponibles au sein de la population cancéreuse réadmise lors du premier projet et évaluation de l’impact de ces interactions sur la survie des patients.MéthodeLa classification du PCNE V6.2 a été adaptée et traduite pour le contexte belge. Afin d’évaluer la validité du contenu, les pharmaciens académiques et d’officines ont évalué six critères, deux qui ciblaient le mode d’emploi (compréhensibilité, utilité) et quatre le formulaire d’encodage (pertinence, logique d’agencement, exhaustivité et redondance). Lors de leur pratique quotidienne, les pharmaciens ont appliqué l'outil adapté du PCNE afin d’évaluer si les instructions avaient été respectées et de quantifier le temps nécessaire pour résoudre un PLM. Par la suite, l’analyse des encodages des pharmaciens a permis d’estimer la fiabilité inter-évaluateurs. Le second projet était une étude pilote qui a permis aux étudiants de Master 2 d’encoder avec l’outil adapté du PCNE V6.2 les PLM détectés en officine par leur maître de stage. Les PLM impliquant les antidouleurs ont été extraits de la base de données initiale et ont été analysés.La deuxième partie s’est basée sur une étude rétrospective observationnelle de six mois dans deux établissements de soins Bruxellois :un hôpital général universitaire et un centre de référence en oncologie. Afin d’évaluer les PLM, une revue de médication de type 2b a été appliquée pour chaque patient réadmis aux urgences ou suite à une consultation médicale. La probabilité d’implication d’un PLM dans la réadmission a été évaluée à l’aide du système du Centre de surveillance de l'organisation mondiale de la santé d'Uppsala (OMS-UMC). La réception de la base de données des différents coûts liés à ces réadmissions a permis une estimation des coûts de réadmission de ces PLM pour chacun des deux établissements impliqués. Le caractère évitable d’un PLM a pu être évalué par l’utilisation du questionnaire de Schumock et al. Le dernier projet à évaluer les potentielles interactions médicamenteuses à l'aide des bases de données en ligne Lexicomp® et Epocrates®. Une analyse de survie de Kaplan-Meier et une analyse de Cox ont été effectuées pour évaluer le lien entre les variables interaction et survenue du décès.RésultatsL'adaptation de l’outil a permis l'ajout de 16 items. Une bonne validation du contenue a été obtenue suite à l’évaluation des pharmaciens académiques et des pharmaciens d’officine. Un total de 109 PLM a été encodé, avec un temps de résolution moyen de 5 min. Concernant la fiabilité inter-évaluateur, 74 items sur un ensemble de 83 ont montré une fiabilité élevée. L’étude pilote a permis de recueillir 15 952 PLM, dont 1 832 pour les antidouleurs, 3 200 interventions ont été produites afin de résoudre les PLM. La majorité des PLM ont été totalement ou partiellement résolus (77,2%).Lors de la seconde partie de la thèse, l’analyse des dossiers de patients cancéreux réadmis dans les 30 jours a révélé que 123 patients avaient été réadmis pour un PLM certain (4,9%), probable (49,6%) ou possible (45,5%). Les facteurs de risque mis en évidence étaient un faible score de Charlson, la polymédication et certaines chimiothérapies (préparations à base de Platine, les anthracyclines ou les vinca-alcaloides). Un montant total de 495 869,10 € a été mis en évidence pour les réadmissions dues aux PLM, avec une durée médiane d’hospitalisation de 7 jours. Les cancers prédominants liés à ces réadmissions étaient le poumon (19,5%) et le sein (17,9%). En se basant sur les diagnostiques des médecins, une part importante (71,5%) des réadmissions du aux PLM était liée aux effets indésirables de la chimiothérapie.Le troisième projet de la seconde partie de ce travail a inclus une population finale de 299 patients réadmis 30 jours après la sortie de l'hôpital en raison d’un PLM. Selon les bases de données en ligne, entre 78,9% et 80,9% des patients étaient réadmis avec au moins une interaction. En moyenne entre 1,6 et 2,3 interactions par patient ont été détectés pour Lexicomp® et Epocrates®. Les opioïdes (29,9%) suivis des anxiolytiques (15,8%) étaient les médicaments les plus souvent impliqués. Les effets indésirables les plus prédominants étaient les dépressions du système nerveux central (SNC) et les dépressions respiratoires. Des analyses de Kaplan-Meier ont montré une différence statistiquement significative sur la survenue du décès, entre les patients avec et sans interactions. Néanmoins, le décès ne semble pas être directement lié à la présence d'une interaction.ConclusionLa première partie a pu montrer que l’adaptation de l’outil au contexte francophone belge était fiable et avait une validité suffisante pour une utilisation quotidienne. La participation de 6 facultés belges a permis une implication nationale permettant d’obtenir une grande proportion de PLM (15 952) ;parmi eux, plus de 10% concernaient les antidouleurs dont la quasi-totalité ont été complètement résolus.Concernant la deuxième partie, environ 10% des réadmissions de patients cancéreux dans les 30 jours suivant leur dernier soin étaient liées à un PLM, parmi ces réadmissions 71,5% étaient liées à un effet indésirable. Le coût médian par réadmission était de 2 406,10 €. Les PLM évitables représentaient 7,3% dont le coût s’élevait à un total 27 938,61 €. L’évaluation des interactions a pu mettre en évidence une forte proportion de potentielles interactions liées aux traitements de patients cancéreux, néanmoins cela ne semble pas être lié à la survenue du décès.Ce travail a pu mettre en évidence la présence importante de PLM en officine et la volonté des pharmaciens d’officines belges à améliorer leur pratique. Néanmoins l’intégration d’un outil plus spécifique à la pratique officinale sur le terrain permettrait une adhésion plus complète et potentiellement une meilleure détection. La deuxième partie de ce travail a montré quelques facteurs de risque intéressants et l’importante présence d'interactions, qui demandent une potentielle vigilance chez les patients cancéreux afin de réduire les risques de réadmission dues aux PLM et les coûts associés. Cependant, une meilleure communication entre les professionnels de santé au sein de l’hôpital mais également avec les prestataires extérieurs tels que les médecins de famille et les pharmaciens d’officine, pourrait permettre un meilleur suivi et une diminution de ces réadmissions avec pour objectif d'améliorer la qualité de vie des patients. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished