Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario Departamento de Patología Animal / Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs) son a un grupo de enfermedades neurodegenerativas, de progresión lenta y finalmente fatales. Afectan tanto a humanos como a los animales. Dentro de éstas, los ovinos pueden presentar una enfermedad que es conocida hace más de 250 años, el Scrapie. El agente etiológico del Scrapie y del resto de las encefalopatías espongiformes, se denomina “prión” (partícula infecciosa proteinácea), que corresponde a la forma alterada (PrPSc) de una proteína constitutiva de membrana celular (PrPC). El Scrapie, luego de presentar largos períodos de incubación, manifiesta un cuadro clínico principalmente neurológico con cambios de conducta, tremores e incluso convulsiones, además de prurito, perdida de lana, debilidad y deterioro de la condición corporal. La presentación de la enfermedad está fuertemente determinada genéticamente y se transmite en forma vertical y horizontal. Actualmente el país cuenta con varias técnicas diagnósticas para enfrentar la encefalopatía espongiforme que afecta a los bovinos (EEB), no así para el Scrapie. Por este motivo, esta memoria de título buscó demostrar que la técnica de inmunohistoquímica es completamente confiable para ser utilizada como herramienta diagnóstica del Scrapie, bajo las condiciones particulares del laboratorio Oficial del país, perteneciente al Servicio Agrícola y Ganadero (SAG). Se procesaron 100 muestras de tejido nervioso a nivel de óbex, provenientes de ovinos sanos clínicamente mayores de 2 años, sacrificados en mataderos de la XII región, con el propósito de aplicar la técnica inmunohistoquímica, además de describir los hallazgos histopatológicos más importantes a través de una tinción de H-E modificada. La totalidad de las muestras fueron negativas a Scrapie mediante la tinción inmunohistoquímica. Por otra parte, en las mismas muestras se pudieron observar a través 4 de la tinción histopatológica de H-E modificada para EETs, lesiones microscópicas inflamatorias, hemorrágicas, pigmentarias y otras sin lesiones, sin embargo resultaron ser inespecíficas y no se asociaron a ninguna enfermedad específica. La realización de la inmunohistoquímica presentó 100% de sensibilidad y especificidad, reafirmando que esta técnica es confirmatoria para el diagnóstico del Scrapie, tal y como lo recomienda la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) / Servicio Agrícola y Ganadero SAG) y Proyecto FAVET /04-35

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / El Scrapie es una enfermedad neurodegenerativa producida por priones que afecta a ovinos y caprinos, descrita desde el siglo XVIII. El prion es una proteína de conformación anormal que se propaga transformando la isoforma normal del hospedero. La lesión patológica más característica es la vacuolización, ya sea en el soma neuronal o del neuropilo. La identificación de los casos sospechosos es el primer paso en el programa de vigilancia para esta enfermedad. La técnica de inmunohistoquímica, se utiliza para evidenciar el depósito de la proteína patológica en el tejido nervioso como el óbex, lo cual limita el diagnóstico a ser realizado solo después de la muerte del animal. Por esto, es necesaria una herramienta que entregue información de los animales en los estados preclínicos, así la biopsia de tejido linfoide de tercer párpado, ha sido descrita para realizar estudios in vivo de Scrapie en ovejas y cabras. Con estos antecedentes, se realizó este estudio en animales vivos en nuestro país, de la Región Metropolitana, con el fin de estandarizar la técnica de inmunohistoquímica (IHQ) y desarrollar un protocolo in vivo, adecuado a nivel del laboratorio país. Chile ha sido declarado libre de Scrapie, para esto el Servicio Agrícola y Ganadero (SAG), cuenta con herramientas diagnósticas como la IHQ, la histopatología, el Western Blot y el ELISA, que son realizados post mortem. En este estudio se muestrearon 75 ovejas mayores de dos años de edad, de las cuales se extrajo el tejido linfoide del tercer párpado. Las muestras fueron sometidas a tinción Hematoxilina-Eosina (H-E) para clasificar su aptitud de acuerdo a la cantidad de centros germinales. De la totalidad de las muestras, 50 fueron clasificadas como aptas para continuar con la técnica de IHQ, lo que corresponde a un 66,6% de los individuos muestreados, esto porque la cantidad de centros germinales del tejido linfoide necesarios para diagnosticar una muestra como negativa debe ser igual o mayor a 4 Todas las muestras evaluadas por IHQ fueron negativas a Scrapie, al no presentar en ninguno de los centros germinales el precipitado granular rojo que evidencia la inmunoreacción de la proteína priónica, además de compararlas con los controles positivos y negativos aportados por un centro de referencia canadiense. La técnica basada en la biopsia de tejido linfoide de tercer párpado ovino, demostró la factibilidad de ser realizada en condiciones de laboratorio país, lo cual podría entregar información precoz sobre el estado sanitario de la masa ovina en lo referido a Scrapie. En este trabajo se logró la obtención de tejido linfoide de tercer párpado viable de ovinos, su clasificación y con ello validar y estandarizar la IHQ en este tejido a partir de muestras obtenidas in vivo, lo que demuestra la aplicabilidad y la capacidad de usar esta nueva herramienta diagnóstica en la masa ovina nacional, para así ser utilizada como técnica in vivo de screening, en programas de vigilancia, diagnóstico y control de Scrapie en Chile / Proyecto FIV Nº12101401.9102.009

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs) son un grupo de enfermedades que afectan a diferentes especies incluyendo al humano. Dentro de las EETs animales, destaca el Scrapie que afecta a ovinos y caprinos, y la Encefalopatía Espongiforme Bovina, que además de afectar al ganado bovino, es transmisible a los humanos. El causante de estas enfermedades es una partícula proteinácea infecciosa llamada prión, que se origina por un cambio conformacional de una proteína priónica celular del hospedero (PrPc). En los últimos años se han desarrollado programas de vigilancia que consideran a la Histopatología e Inmunohistoquímica (IHQ), como el método de diagnóstico confirmatorio para la EEB. Sin embargo, la epidemia desencadenada en el Reino Unido, obligó a implementar métodos diagnósticos más rápidos como son el Western Blot e Inmunoensayoenzimático (ELISA). Durante la década del 2000, los investigadores comenzaron a indicar que, en el caso del Scrapie, era posible utilizar otros tejidos para realizar el diagnóstico. Estos tejidos consideran a los nódulos linfáticos, el tejido linfoide asociado a mucosa rectal (TLAMR) y al tercer párpado, dada la patogenia de la enfermedad. Esta memoria fue desarrollada en el laboratorio de Patología del Servicio Agrícola y Ganadero de Lo Aguirre. Se utilizaron 50 muestras de mucosa rectal de caprinos mayores de 2 años, sin importar raza ni sexo. Se obtuvieron 2 cortes a partir de cada muestra de recto. Uno obtenido a la distancia de 0,5 cm a la unión mucocutánea rectal y el otro a 1 cm de este. De cada corte se obtuvieron cortes seriados, con el fin de destinar uno a la tinción de Hematoxilina y Eosina (H&E) y su corte homólogo a la técnica de Inmunohistoquímica, si es que en la tinción H&E se observaban al menos 4 folículos linfoides presentes. En total se trabajó con 100 cortes, que fueron sometidos a las técnicas tradicionales de histopatología y a la tinción de H&E. De éstos, 90 resultaron aptos para aplicar la técnica 5 de Inmunohistoquímica (IHQ); sin embargo, para la detección de la proteína priónica patológica se escogieron los 50 mejores; uno de cada muestra de recto caprino y seleccionada por su aptitud y mayor cantidad de folículos linfoides contabilizados mediante la tinción de H&E. De las muestras sometidas a IHQ, ninguna de ellas presentó el precipitado granular rojo característico de la inmunorreacción por la presencia de priones, por lo cual se determinó que todas las muestras de los caprinos estudiados debían clasificarse como negativas, al igual que los controles negativos de mucosa rectal y de obex. Por su parte, los controles positivos de mucosa rectal y de obex siempre presentaron el precipitado granular rojo indicativo de una inmunorreacción positiva, tal como lo había indicado el Centro de Referencia para ese tipo de controles. Se realizó un análisis estadístico en base a la comparación de los dos grupos de distancias analizados y la cantidad de folículos linfoides observados en ellos. Mediante la prueba No Paramétrica U de Mann Whitney de cual se concluyó que no existe diferencia significativa en la distribución de los folículos linfoides observados entre 0,5 y 1 cm de distancia a la unión mucocutánea rectal. De esta manera, este trabajo colaboró con la vigilancia pasiva anual que realizó el Servicio Agrícola y Ganadero durante el año 2013, con respecto a la detección de priones en la especie caprina en un determinado grupo de animales de nuestro país.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Scrapie es una enfermedad perteneciente al grupo de las EETs que afecta a ovejas y cabras. Este prototipo de enfermedad priónica, se caracteriza porque en las etapas iniciales de su patogenia el prión se deposita en los tejidos linforreticulares (TLR). Esta cualidad permite que se realicen pruebas diagnósticas preclínicas, en base a la detección de la proteína priónica patológica por medio de Inmunohistoquímica (IHQ) en zonas anatómicas donde es posible reconocer TLR. Según los informes entregado por la OIE en Chile no se han descritos casos de Scrapie, ni tampoco se posee sistema de vigilancia sobre esta enfermedad., No obstante, se establece que si se llegasen a presentar casos, estos se deben declarar obligatoriamente. Sin embargo, el SAG realiza vigilancia post mortem utilizando muestras de óbex con las que se llevan a cabo las técnicas diagnósticas de histopatología, IHQ y ELISA. Debido al potencial ganadero ovino del país, se hace importante poseer herramientas diagnósticas ante mortem de fácil realización, que permitan la implementación de programas de control epidemiológico en vivo. Es así como para esta memoria, se eligió el tejido de la mucosa rectal para validar la técnica diagnóstica por IHQ. Debido a que esta zona anatómica se caracteriza por presentar folículos linfoides dispersos cercanos a la unión recto anal, lo cual la hacen ser un área accesible por medio de una biopsia in vivo. A la vez, se realizó un análisis para determinar cual es la mejor región anatómica que permita obtener la mayor cantidad de folículos linfoides, ya que se requieren como mínimo 4 centros foliculares para realizar la técnica de IHQ con valor diagnóstico preclínico de Scrapie, reconocido internacionalmente. Para alcanzar este objetivo se trabajó con los últimos 4 cm del recto obtenidos de 54 ovinos mayores de 2 años, todos ellos provenientes de mataderos ubicados en la Región de Magallanes y Antártica Chilena. De cada trozo de recto, se analizaron 5 cortes a las distancias de 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 cm desde la línea recto anal hacia craneal. Estos cortes fueron sometidos a tinción de H/E, posteriormente se observaron e hizo un conteo de la presencia de folículos linfoides para así, clasificar la muestra como apta o no para realizar la IHQ. De esta manera, evaluando la aptitud de la muestra se observó que de los 54 individuos, en 33 (61%) al menos una de las cinco muestras fue considerada como apta y en 21 (39%) de ellos, no se presentaron muestras aptas en ninguno de sus cortes. Una vez obtenido los datos de la cantidad de folículos presentes por corte estos se sometieron a un análisis estadístico de chi cuadrado (2), el que arrojó como resultado que la mejor zona para obtener una muestra útil para el diagnóstico, es el área comprendida entre los 0,5 y 1,5 cm desde la unión recto anal. Así, del total de 270 cortes obtenidos, 74 cortes fueron aptos para realizar la IHQ, correspondiente al 61,1 % de los individuos muestreados. Todos estos cortes fueron negativos a Scrapie al no presentar el precipitado granular rojo de la inmunotinción y al compararlos con controles positivos y negativo que se disponían. De esta forma, la técnica basada en la biopsia rectal entrega una herramienta potencialmente útil para el diagnóstico precoz del Scrapie, debido a que el tejido linfoide rectal es fácilmente accesible en ovinos vivos, lo que facilita una rápida toma de muestras con un mínimo malestar para el animal. Esta técnica tendrá su mayor efectividad cuando se utilice una biopsia obtenida en la zona comprendida entre los 0,5 y 1,5 cm desde la unión recto anal. Por lo tanto, con este estudio se logró estandarizar la zona más adecuada para la toma de muestra, por medio de una biopsia rectal in vivo, además de validar la técnica de IHQ en estos tejidos, para así utilizarla como posible técnica in vivo de screening en programas de cuarentena y control de Scrapie para el país / Financiamiento: Proyecto FIV no. 121014019102002